無糖組織培養(yǎng)在甘蔗快繁中的應(yīng)用

淡明 李松 盧曼曼 余坤興 劉紅堅(jiān) 劉麗敏 劉俊仙

摘要 [目的]研究植物無糖組織培養(yǎng)技術(shù)在甘蔗快繁中的應(yīng)用。[方法]選用透明硬質(zhì)塑料盒為培養(yǎng)容器，以珍珠巖和蛭石為基質(zhì)，進(jìn)行甘蔗無糖組織培養(yǎng)。在普通培養(yǎng)條件及高CO2濃度條件下探討新型培養(yǎng)容器和基質(zhì)及CO2濃度對(duì)甘蔗快繁的影響。[結(jié)果]無糖培養(yǎng)的甘蔗植株株高比常規(guī)培養(yǎng)的植株高1.03 cm，差異不顯著；無糖培養(yǎng)的植株鮮重比常規(guī)培養(yǎng)的重0.73 g，差異顯著；無糖培養(yǎng)的甘蔗生根數(shù)和根長(zhǎng)分別為3.60根和1.08 cm，與常規(guī)培養(yǎng)的差異顯著。[結(jié)論]用無糖培養(yǎng)方式培養(yǎng)的甘蔗組培苗在株高、鮮重、根數(shù)和根長(zhǎng)等生長(zhǎng)指標(biāo)上優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方式。

關(guān)鍵詞 無糖培養(yǎng)；甘蔗；快繁；CO2

中圖分類號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）29-0029-02

Application of Sugarfree Tissue Culture on Sugarcane Rapid Propagation

DAN Ming， LI Song， LU Manman et al

（Sugarcane Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007）

Abstract [Objective]To study the application of sugarfree tissue culture on sugarcane rapid propagation.[Method]The sugar free tissue culture of sugarcane was made by using transparent hard plastic box as a culture vessel， with perlite and vermiculite as the matrix. The effect of the new cultivable vessel and substrate and CO2 concentration on sugarcane was discussed under the conditions of normal culture and high CO2 concentration. [Result]The plant height of sugarfree culture sugarcane plant was 1.03 cm higher than the normal culture， and the difference was not significant. The plant fresh weight of sugarfree culture was 0.73 g heavier than conventional culture， and the difference was significant.The root number and root length of sugarfree culture were 3.60 roots and 1.08 cm respectively， which were significantly different from conventional culture. [Conclusion]Compared with traditional training way， sugarfree culture of sugarcane was superior to the traditional culture in plant height， fresh weight， root number and root length.

Key words Sugarfree culture；Sugarcane；Rapid propagation；CO2

基金項(xiàng)目 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目（桂農(nóng)科2012JM05）。

作者簡(jiǎn)介 淡明（1979—），女，廣西龍州人，助理研究員，碩士，從事甘蔗健康種苗組織培養(yǎng)與分子檢測(cè)研究。

收稿日期 2017-07-12

植物無糖培養(yǎng)快繁技術(shù)是在培養(yǎng)基不加糖的基礎(chǔ)上，采用環(huán)境控制手段，通過對(duì)CO2濃度、光照、溫度、濕度等環(huán)境因子的調(diào)節(jié)，使組培苗加強(qiáng)自身的光合作用，由異養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樽责B(yǎng)型，從而有效降低生產(chǎn)成本，達(dá)到快速繁殖優(yōu)質(zhì)種苗的目的[1-3]。這種更接近自然環(huán)境的條件可以很大程度降低試管苗的污染率，提高培養(yǎng)效率[4]。無糖組培技術(shù)強(qiáng)調(diào)采用體積較大的培養(yǎng)容器，在大型容器中培養(yǎng)植物小苗，容易得到長(zhǎng)勢(shì)整齊一致的植株，也易于統(tǒng)一管理作業(yè)。

甘蔗組培苗生產(chǎn)通常采用密閉的玻璃培養(yǎng)瓶，以瓊脂或?yàn)V紙作為支撐物，培養(yǎng)液中添加大量的糖。傳統(tǒng)的甘蔗組培生產(chǎn)存在一定的缺點(diǎn)，如污染率高、植株生長(zhǎng)不良、生長(zhǎng)緩慢、生根率低、馴化期死亡率高等，在繼代培養(yǎng)時(shí)，還需要大量勞力，這些都造成甘蔗快繁生產(chǎn)成本增加[5]。

該試驗(yàn)采用組培箱作為培養(yǎng)容器，以透明硬質(zhì)無蓋塑料

盒為培養(yǎng)器皿，珍珠巖和蛭石的混合物為基質(zhì)，在箱式培養(yǎng)箱內(nèi)通入CO2 氣體，對(duì)甘蔗進(jìn)行無糖組織培養(yǎng)。對(duì)培養(yǎng)過程中激素濃度、通氣時(shí)間、CO2 濃度等環(huán)境因素進(jìn)行研究，并與常規(guī)組培方式進(jìn)行比較，研究出一套適合甘蔗健康種苗的無糖組織培養(yǎng)技術(shù)，為甘蔗的組織培養(yǎng)生產(chǎn)提供新的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為脫毒甘蔗試管苗桂糖49，在MS培養(yǎng)基中快繁培養(yǎng)而成。無糖培養(yǎng)采用專用的培養(yǎng)器皿（650 mL的硬質(zhì)透明塑料盒），每個(gè)塑料盒內(nèi)加珍珠巖∶蛭石=1∶1的混合物作為支撐物，加入能夠濕潤(rùn)支撐物的營(yíng)養(yǎng)液。對(duì)照采用常規(guī)組培的200 mL廣口玻璃瓶，2種培養(yǎng)基成分見表1。

1.2 方法

培養(yǎng)基高溫高壓滅菌20 min后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行接種。1個(gè)甘蔗莖尖苗為1株，每個(gè)培養(yǎng)容器內(nèi)接種3株，對(duì)照接種1株，每個(gè)處理各45株。然后放在溫度25～28 ℃，濕度85%～90%，光照強(qiáng)度3 000 lx的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每日光照12 h。接種后第3天，無糖培養(yǎng)處理開始通入CO2氣體，通氣時(shí)段內(nèi)CO2濃度維持在1 200 mg/L左右。對(duì)照組溫度、濕度、光強(qiáng)同無糖培養(yǎng)處理，無CO2氣體輸入，不另外添加營(yíng)養(yǎng)液。培養(yǎng)第30天后觀察不同處理幼苗的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)植株生根數(shù)，測(cè)量植株的株高，稱鮮重。

試驗(yàn)期間，無糖培養(yǎng)處理需要定時(shí)添加營(yíng)養(yǎng)液，以確保濕度保持在85%以上，對(duì)照組無需添加營(yíng)養(yǎng)液，但在15 d左右需要轉(zhuǎn)瓶1次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（oneway ANOVA），不同組間的平均值差異用StudentNewmanKeuls（SNK）比較 。數(shù)據(jù)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

培養(yǎng)10 d后，無糖培養(yǎng)處理的植株葉片顏色不變，且無微生物污染，對(duì)照組有2瓶污染。

培養(yǎng)30 d時(shí)，無糖培養(yǎng)植株葉片增大，較直立，葉色濃綠，幼苗健壯，有根3～5條，而對(duì)照組的植株葉片細(xì)小，葉尾卷曲，顏色鮮綠，有黃葉、枯葉，幼苗弱小，無根系。分別將2組處理的甘蔗幼苗取出、洗凈，測(cè)量株高和鮮重，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，無糖培養(yǎng)的甘蔗植株株高比常規(guī)培養(yǎng)的植株高1.03 cm，差異不顯著；無糖培養(yǎng)的植株鮮重平均為1.31 g，比常規(guī)培養(yǎng)的植株重0.73 g，差異顯著；無糖培養(yǎng)的甘蔗生根數(shù)和根長(zhǎng)分別為3.60根和1.08 cm，與常規(guī)培養(yǎng)的差異顯著。無糖培養(yǎng)的生根率為100%，污染率為0，而常規(guī)培養(yǎng)的甘蔗生根率為0，污染率為4.4%。

3 討論

（1）因?yàn)闊o糖培養(yǎng)是依靠植物葉片光合作用產(chǎn)生的有機(jī)物來維持和促進(jìn)植物生長(zhǎng)，所以無糖培養(yǎng)的對(duì)象必須是具有一定葉面積的外植體或小植株，無糖組培苗都是從常規(guī)有糖組培苗移植而來的[6]。該試驗(yàn)中無糖培養(yǎng)的對(duì)象是接種已60～90 d的常規(guī)有糖甘蔗莖尖組培苗，此階段的甘蔗組培苗有綠葉5～7片，有一定的葉面積。

（2）甘蔗無糖培養(yǎng)利用珍珠巖和蛭石混合物作為支撐物，營(yíng)養(yǎng)液只添加大量元素、微量元素和鐵鹽母液，節(jié)省了糖和有機(jī)成分，可降低成本。無糖培養(yǎng)基不添加糖，使各種雜菌失去能源，可以很大程度上解決微生物污染問題[7]。甘蔗無糖培養(yǎng)的支撐物是珍珠巖∶蛭石=1∶1的混合物，其透氣性強(qiáng)，可促進(jìn)植株根系生長(zhǎng)，且植株健壯，可以不經(jīng)過馴化直接移栽，省去常規(guī)組培中生根和馴化階段，縮短培養(yǎng)周期。

（3）甘蔗無糖培養(yǎng)中通入了CO2氣體，加大光照強(qiáng)度，可提高植株的光合速率，使生長(zhǎng)速度加快，幼苗健壯。通入CO2氣體的初始時(shí)間為接種后3 d[8]，過早或過晚通入CO2氣體，都會(huì)使葉片變黃，植株萎蔫或生長(zhǎng)瘦弱。這可能是過早通入氣體，剛接種的小植株長(zhǎng)勢(shì)較弱，光合作用能力不強(qiáng)，較高的CO2濃度造成植株的生理代謝異常，同時(shí)氣體流動(dòng)造成培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度下降，使植株容易萎蔫。過晚通入CO2氣體，氣體供給不及時(shí)，使得植株的光合作用受到抑制，植株生長(zhǎng)矮小瘦弱[4]。在無糖培養(yǎng)過程中，要對(duì)培養(yǎng)箱進(jìn)行強(qiáng)制通風(fēng)，使氣體成分混合均勻。強(qiáng)制通風(fēng)也使暗期的CO2濃度降低，利于植株生長(zhǎng)。

（4）甘蔗無糖培養(yǎng)環(huán)境中，CO2濃度增加，替代了糖的作用[9]，使甘蔗組培苗在相同的環(huán)境條件下，株高和葉長(zhǎng)達(dá)到并超過常規(guī)組培苗。

（5）對(duì)組培環(huán)境增施CO2并提高光照強(qiáng)度是無糖組培技術(shù)的突出特點(diǎn)，為了確立生產(chǎn)中CO2濃度的最佳值，必須對(duì)不同CO2濃度下組培苗的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行研究。該試驗(yàn)表明，植物無糖培養(yǎng)技術(shù)可以用于甘蔗快繁，但是對(duì)甘蔗無糖組培技術(shù)的探討只是基礎(chǔ)性的，對(duì)于甘蔗無糖組培苗，CO2濃度對(duì)其光合速率的影響如何，適宜甘蔗組培苗光合速率的最佳CO2濃度是多少，CO2除了影響組培苗的光合作用以外，對(duì)苗呼吸是否有影響，這些問題還需進(jìn)一步深入探討。

參考文獻(xiàn)

[1] KOZAI T，KOYAMA Y，WATANABE I.Multiplication of potato plantlets in vitro with sugar free medium under high photosynthetic photon flux [J].Acta Hort，1988，230：121-127.

[2] KOZAI T，F(xiàn)UJIWARA K，KITAGA Y.Modeling，measurement and control in plant tissue culture[J].Acta Hort，1995，393：63-73.

[3] NIU G H，KOZAI T.Smiulation of CO2 concentration in the culture vessel and growth plantlets in micropropagation[J].Acta Hort，1998，456：37-43.

[4] 屈云慧，熊麗，吳麗芳，等.無糖組培技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展前景[J].中國(guó)種業(yè)，2003（12）：17-18.

[5] 淡明，李松，劉麗敏，等.甘蔗健康種苗組培快繁技術(shù)的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：3165-3166.

[6] 王立文.植物無糖組培中CO2增施方法及其應(yīng)用研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[7] 楊玉田，郭興臻，朱宗貴，等.無糖培養(yǎng)技術(shù)在甘薯快繁培養(yǎng)中的應(yīng)用效果[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（5）：18.

[8] 屈云慧，熊麗，張素芳，等.彩色馬蹄蓮組織苗無糖生根培養(yǎng)的環(huán)境控制[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2004，5（2）：166-169.

[9] 張婕，高亦珂.無糖組織培養(yǎng)在黃菖蒲（Iris pseudacorus）中的應(yīng)用[M]//張啟翔.中國(guó)觀賞園藝研究進(jìn)展2010.北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2010.