正交試驗優(yōu)化腌制芥菜發(fā)酵工藝及調(diào)控亞硝酸鹽含量的研究

烏日娜　曾令群

摘要[目的]優(yōu)化芥菜腌制發(fā)酵工藝，控制腌制芥菜亞硝酸鹽含量。[方法]以芥菜為原料，以亞硝酸鹽含量、感官評分為指標(biāo)，采用正交試驗設(shè)計，優(yōu)化芥菜腌制發(fā)酵工藝的生產(chǎn)方法；以亞硝酸鹽含量、亞硝峰峰值的抑制率為指標(biāo)，采用單因素試驗法，確定異抗壞血酸鈉、EDTA-2Na、藠頭及檸檬酸對亞硝酸鹽含量的調(diào)控作用。[結(jié)果]在乳酸菌接種量5%、食鹽添加量5%～7%（取6%）、溫度30 ℃、發(fā)酵9 d的工藝條件下，腌制芥菜中亞硝酸鹽含量為0.74 mg/kg，遠低于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的20 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)，所得的腌制芥菜風(fēng)味可口。異抗壞血酸鈉和藠頭能有效抑制亞硝峰的峰值及降低成品中亞硝酸鹽含量，而檸檬酸和EDTA-2Na僅能有效抑制亞硝峰的峰值，不能有效降低成品中亞硝酸鹽含量。[結(jié)論]研究可為腌制芥菜的開發(fā)利用提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞發(fā)酵芥菜；亞硝酸鹽；調(diào)控

中圖分類號TS255.53文獻標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）30-0089-05

Abstract[Objective]The fermentation process of pickled mustard was optimized and the content of nitrite in pickled mustard was controlled. [Method]Taking mustard as raw material， using nitrite content and sensory evaluation as index， the production method of mustard marinated fermentation process was optimized by orthogonal design； Using the content of nitrite and the inhibition rate of nitroso peak as index， the effects of sodium isoascorbate， EDTA-2Na， Chinese onion and citric acid on the nitrite content were determined by single factor experiments. [Result]The content of nitrite in pickled mustard was 0.74 mg/kg， at the conditions that inoculation amount of lactic acid bacteria 5%， the amount of salt added 5%-7%（6%）， 30 ℃ and 9 days fermentation duration， which was much lower than the national standard 20 mg/ kg. The flavor of resulting pickled mustard was delicious； sodium isoascorbate and Chinese onion can effectively inhibit the peak value of nitrite peak and reduce the nitrite content of finished products. While citric acid and EDTA-2Na can only effectively inhibit the peak of nitroso peak， but can not effectively reduce the nitrite content of finished products. [Conclusion]The research could provide technical support for the development and utilization of pickled mustard.

Key wordsFermented mustard； Nitrite； Regulation

芥菜（Brassica juncea Coss.）為十字花科蕓薹屬草本植物，俗稱蓋菜、青菜。芥菜具有去熱火、抵御風(fēng)濕、利五臟、補天陽、促進血液循壞之功效[1]。腌菜是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵蔬菜制品，其爽脆、開胃的優(yōu)良品質(zhì)深受國內(nèi)外消費者的喜愛。此外，腌制菜還具有增食欲、促消化、抗腫瘤、抗肥胖、抑衰老等保健功能[2]。

腌制芥菜是由新鮮芥菜適當(dāng)脫水后經(jīng)乳酸發(fā)酵而制成。傳統(tǒng)的高鹽腌制自然發(fā)酵法存在時間長、鹽含量高、亞硝酸鹽累積量大、質(zhì)地軟等缺點[3] ，嚴(yán)重制約芥菜發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展。研究表明，接種乳酸菌發(fā)酵蔬菜具有發(fā)酵時間短、品質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)點，特別是能降低亞硝酸鹽的累積，產(chǎn)品安全性高[4]。發(fā)酵過程中乳酸菌的接種量、鹽含量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度的不同，對酸菜的品質(zhì)影響很大。發(fā)酵過程中添加酸味劑、抗氧化劑、香辛料等[5]，能顯著提高產(chǎn)品的色、香、味。酸味劑如檸檬酸具有降低發(fā)酵液的起始pH，起到抑制雜菌的作用[6]。抗氧化劑茶多酚及抗壞血酸[7]、EDTA-2Na等能還原亞硝酸鹽，起到降低亞硝酸鹽含量的作用。目前，有關(guān)乳酸菌低鹽腌制發(fā)酵芥菜的工藝研究報道不多，在此基礎(chǔ)上各種添加物對亞硝酸鹽含量的影響研究也鮮見報道。筆者以亞硝酸鹽為主要考察指標(biāo)，利用正交試驗優(yōu)化不同的乳酸菌接種量、鹽含量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對腌制芥菜品質(zhì)影響的最適發(fā)酵條件，在最優(yōu)發(fā)酵條件下進一步探討檸檬酸、異抗壞血酸鈉、EDTA-2Na、藠頭對亞硝酸鹽含量及亞硝峰調(diào)控的影響，旨在為高品質(zhì)、安全的發(fā)酵芥菜加工提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與試劑。

供試芥菜品種“春芥”由海南鴻大海實業(yè)有限公司提供；菜壇、食鹽購于?？谀蠂?；植物乳桿菌GIM1.140，購于廣東省微生物菌種保藏中心。

主要試劑：亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰醋酸、硼酸鈉、鹽酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺鹽酸鹽、亞硝酸鈉、MRS培養(yǎng)基。

1.1.2儀器與設(shè)備。

AR124CN電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵，上海鷹迪儀器設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司； FE20 pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2方法

1.2.1菌懸液的制備。取植物乳桿菌于MRS培養(yǎng)基中活化3代，取2環(huán)活化后的乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液經(jīng)3 000 r/min離心10 min，收集菌體，用等體積滅菌生理鹽水離心洗滌3次，將菌體懸浮于滅菌生理鹽水中制成菌懸液，菌懸液乳酸菌數(shù)為 108～109 CFU/mL。

1.2.2發(fā)酵芥菜的制作工藝。將新鮮芥菜清洗，晾曬至原重的70%，切分后裝入1 L的菜壇，每壇裝入相同重量的芥菜和鹽水（1∶2，W/V），接入乳酸菌菌懸液，壇口用水密封，在一定溫度下發(fā)酵。

1.2.3芥菜腌制發(fā)酵的單因素試驗。分別研究食鹽添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、乳酸菌接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、發(fā)酵時間（6、8、10、12、14 d）和發(fā)酵溫度（20、25、30、35、40 ℃）對腌制芥菜品質(zhì)的影響。

1.2.4芥菜腌制發(fā)酵的正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇食鹽添加量、乳酸菌接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度為影響因素，以亞硝酸鹽含量和感官評分為指標(biāo)，采用4因素3水平的正交試驗方案（表1），對芥菜腌制發(fā)酵的工藝條件進行優(yōu)化。

1.2.5各種添加物對亞硝酸鹽的影響。根據(jù)正交試驗結(jié)果所得的最適工藝，分別研究檸檬酸（1.0、2.0 g/kg）、異抗壞血酸鈉（1.0、2.0 g/kg）、EDTA-2Na（0.1、0.2 g/kg）和藠頭（2%、4%）對腌制芥菜亞硝酸鹽的影響，以最適腌制發(fā)酵工藝條件下不加添加物為對照。

1.2.6指標(biāo)測定。發(fā)酵第1天亞硝峰抑制率的計算按以下公式：

亞硝峰抑制率=（對照亞硝峰峰值-處理組亞硝峰峰值）/對照亞硝峰峰值×100%

亞硝酸鹽含量測定：鹽酸萘乙二胺法，參照GB 5009.33—2010 方法；pH的測定：參照GB10468—1989的方法。

1.2.8數(shù)據(jù)分析。采用正交設(shè)計軟件V3.1及SPSS 17軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2結(jié)果與分析

2.1芥菜腌制發(fā)酵單因素試驗結(jié)果

2.1.1食鹽添加量對腌制芥菜品質(zhì)的影響。由表3可見，在乳酸菌接種量為5%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵10 d的條件下，食鹽添加量為1%時，腌制芥菜的亞硝酸鹽含量最高，為5.37 mg/kg，這可能是由于較低濃度的食鹽抑制雜菌的能力較低，雜菌的生長降低了乳酸菌降解亞硝酸鹽的能力。食鹽添加量為3%～9%對亞硝酸鹽含量的影響差異不顯著（P>0.05），但與添加1%食鹽樣品相比，均顯著降低了樣品亞硝酸鹽含量（P<0.05）。各濃度的食鹽對腌制芥菜pH影響差異不顯著（P>0.05），可能的原因是在此食鹽濃度范圍內(nèi)，芥菜腌制發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)酸能力相似。食鹽添加量為3%～7%的腌制芥菜，感官評分顯著高于食鹽添加量為1%和9%的樣品，說明這2個樣品過淡或過咸。因此，選用食鹽添加量為3%、5%和7% 3個水平做進一步的正交試驗。

2.1.2乳酸菌接種量對腌制芥菜品質(zhì)的影響。

由表4可見，在食鹽添加量為5%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵10 d的條件下，1%乳酸菌接種量樣品的亞硝酸鹽含量最高，為4.73 mg/kg，顯著高于乳酸菌接種量為3%～9%的各樣品

（P<0.05），說明1%的乳酸菌接種量偏低，乳酸菌的數(shù)量還不足以有效降低亞硝酸鹽含量，況且該樣品的pH顯著高于其他樣品（P<0.05），感官評分顯著低于其他樣品（P<0.05），說明樣品的酸度不足，口感差；乳酸菌接種量為3%～9%的各樣品間的亞硝酸鹽含量差異不顯著（P>0.05），接種量為9%的樣品其pH和感官評分顯著低于3%～7%的各樣品，說明9%的乳酸菌接種量偏高，口感偏酸，該接種量雖能有效降低亞硝酸鹽含量，但對感官評價卻沒有幫助。因此，選用乳酸菌接種量為3%、5%和7% 3個水平做進一步的正交試驗。

2.1.3發(fā)酵時間對腌制芥菜品質(zhì)的影響。

由表5可知，在食鹽添加量為5%、發(fā)酵溫度30 ℃、乳酸菌接種量5%的條件下，發(fā)酵14 d的樣品，其亞硝酸鹽含量顯著高于發(fā)酵6～12 d的各樣品（P<0.05），而pH和感官評分顯著低于其他樣品（P<0.05），說明14 d的發(fā)酵時間偏長，樣品口感偏酸，品質(zhì)較差。因此，選用發(fā)酵時間為6～12 d做進一步的正交試驗。

2.1.4發(fā)酵溫度對腌制芥菜品質(zhì)的影響。

溫度對乳酸菌的生長繁殖具有重要影響。由表6可知，在食鹽添加量為5%、乳酸菌接種量5%、發(fā)酵時間10 d的條件下，30 ℃以上的高溫發(fā)酵有利于亞硝酸鹽的消除，說明在此溫度下乳酸菌生長繁育快、產(chǎn)酸多，降解亞硝酸鹽的能力加強。但35和40 ℃發(fā)酵的樣品偏酸、質(zhì)地較軟，感官評分顯著低于其他溫度發(fā)酵的樣品。因此，試驗采取20～30 ℃的發(fā)酵溫度做進一步的正交試驗。

2.2芥菜腌制發(fā)酵正交試驗結(jié)果

2.2.1直觀分析。

正交試驗設(shè)計及結(jié)果如表7所示，由極差R分析可知，影響亞硝酸鹽含量的因子主次順序為A>C>D>B，即乳酸菌接種量對腌制芥菜亞硝酸鹽含量影響最大，其次是發(fā)酵時間， 食鹽加入量影響最小。根據(jù)K值得出最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C2D3，即乳酸菌接種量5%、食鹽添加量5%、發(fā)酵時間9 d及發(fā)酵溫度30 ℃。同理，對感官綜合評分而言，影響因子的主次順序為A>B>D>C，即乳酸菌接種量影響最大，其次是食鹽添加量，發(fā)酵時間影響最小。最佳發(fā)酵組合為A2B3C2D3，即乳酸菌接種量5%、

食鹽添加量7%、發(fā)酵時間9 d及發(fā)酵溫度30 ℃。綜合考慮亞硝酸鹽含量及感官評分，選取的最佳發(fā)酵工藝條件為乳酸菌接種量為5%、食鹽添加量為5%～7%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間9 d。

2.2.2方差分析。

方差分析顯示，影響亞硝酸鹽的方差分析結(jié)果FA=2.392，F(xiàn)B=0.165，F(xiàn)C=1.204，F(xiàn)D=0.239，F(xiàn)臨界值均為4.460；影響感官評分的方差分析結(jié)果FA=2.577，F(xiàn)B=1.184，F(xiàn)C=0.045，F(xiàn)D=0.195，F(xiàn)臨界值均為4.460。由此可知，方差分析結(jié)果與極差分析一致，即影響亞硝酸鹽的主次順序依次為乳酸菌接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、食鹽加入量；影響綜合評分的主次順序依次為乳酸菌接種量、食鹽加入量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間。由F臨界值對比各因素F值可知，4個因素在0.05水平上影響均不顯著。

2.2.3驗證試驗。

按照最適腌制發(fā)酵工藝條件即乳酸菌接種量5%、食鹽添加量5%～7%（取6%）、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間9 d，此條件下亞硝酸鹽含量為0.74 mg/kg，綜合評分16.2，進一步驗證了腌制工藝的可行性。

2.3各種添加物對亞硝酸鹽含量及亞硝峰峰值抑制率的影響

2.3.1各種添加物對亞硝酸鹽含量的影響。

添加異抗壞血酸鈉、藠頭、檸檬酸及EDTA-2Na對發(fā)酵芥菜中亞硝酸鹽的影響分別見圖1～4。由圖1～4中可以看出，對照組在第1天出現(xiàn)明顯的亞硝峰，而4種添加物的亞硝峰不明顯，說明4種添加物對亞硝峰期的調(diào)控作用顯著。至發(fā)酵結(jié)束后，添加異抗壞血酸鈉和藠頭的樣品亞硝酸鹽含量與對照相比差異顯著（P<0.05），但不同異抗壞血酸鈉濃度之間、不同藠頭添加量之間差異不顯著（P>0.05），說明加入1.0 mg/kg的異抗壞血酸鈉及加入2%的藠頭可以有效降低發(fā)酵芥菜亞硝酸鹽含量；加入檸檬酸和EDTA-2Na的樣品至發(fā)酵結(jié)束時與對照組差異不顯著（P>0.05），且不同濃度檸檬酸樣品之間、不同濃度EDTA-2Na樣品之間亞硝酸鹽含量差異也不顯著（P>0.05）。

2.3.2各種添加物對亞硝峰峰值抑制率的影響。

由圖5可知，2個水平的異抗壞血酸鈉對亞硝酸峰的抑制率都有顯著影響（P<0.05），抑制率高達65%以上，但2個水平之間的差異不顯著（P>0.05），說明加入1.0 g/kg的異抗壞血酸鈉可有效降低亞硝峰的峰值。添加0.1和0.2 g/kg的EDTA-2Na對亞硝峰抑制率差異顯著（P<0.05），添加0.1 g/kg EDTA-2Na的抑制率（66.2%）顯著高于添加0.2 g/kg EDTA-2Na的抑制率（42.4%），可能的原因是過量的EDTA-2Na絡(luò)合了影響乳酸菌生長的一些金屬離子，在發(fā)酵的前期影響了乳酸菌的生長。藠頭的添加對亞硝峰的抑制率也有顯著影響（P<0.05），添加4%藠頭的亞硝峰的抑制率略高于添加2%藠頭的抑制率，從品質(zhì)上看，添加4%藠頭的樣品，品質(zhì)明顯好于添加2%藠頭的樣品。藠頭是一深受國內(nèi)外消費者歡迎的制作醬腌菜原料，有較強的清除亞硝酸鹽的能力，這與藠頭在體外能抑制N-二甲基亞硝胺（ND-MA）和N-二乙基亞硝胺（NDEA）的化學(xué)合成有關(guān)[8]。檸檬酸為酸味劑，起到調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH的作用。添加1.0 g/kg的檸檬酸對亞硝酸峰的抑制率（51.9%）顯著高于添加2.0 g/kg的樣品，可能的原因是過量的檸檬酸抑制了乳酸菌的生長繁殖。

不同添加物對亞硝峰的抑制率效果不一。姜汁對亞硝峰的抑制率高達81.5%[9]，蒜為47.9%，蔥為41.6%[5]。該研究中的添加物對亞硝峰的抑制率為38.1%～66.9%，這可能與不同添加物對亞硝酸鹽抑制過程中所起的作用不一致有關(guān)。

3結(jié)論

該試驗采用腌制發(fā)酵法，以亞硝酸鹽含量及感官評分為指標(biāo)，考察乳酸菌接種量、食鹽添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間4個因素對腌制芥菜品質(zhì)的影響，通過正交試驗，優(yōu)化芥菜腌

制發(fā)酵工藝。以亞硝酸鹽含量及亞硝峰的抑制率為考察指

標(biāo)，采用單因素試驗法，考察4種添加物對亞硝酸鹽含量的調(diào)控作用。結(jié)果表明，在乳酸菌接種量5%、食鹽添加量5%～7%（取6%）、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵9 d的工藝條件下，腌制芥菜的亞硝酸鹽含量為0.74 mg/kg，遠低于20 mg/kg的國家標(biāo)準(zhǔn)，所得的腌制芥菜風(fēng)味可口。4種添加物中，異抗壞血酸鈉和藠頭不僅可以有效降低亞硝峰的峰值，且能進一步減少成品中亞硝酸鹽含量，而檸檬酸和EDTA-2Na僅能有效抑制亞硝峰的峰值，不能有效降低成品中亞硝酸鹽含量。

參考文獻

[1]

羅燕華，陳亞雪，黃意甘，等.芥菜新品種‘漳芥1號的選育[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，29（7）：662-665.

[2] 馬霞，韓迪，張吉，等.乳酸菌在發(fā)酵果蔬中的應(yīng)用[J].中國乳品工業(yè)，2013，41（1）：40-42.

[3] 孟繁博， 張萬萍，姜金龍，等.響應(yīng)面法優(yōu)化腌制芥菜發(fā)酵工藝的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，42（3）：79-84.

[4] 楊性民，劉青梅，徐喜圓，等.人工接種對泡菜品質(zhì)及亞硝酸鹽含量的影響[J].浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2003，29（3）：291-294.

[5] 黃麗慧，張雁，魏振承，等.響應(yīng)面法優(yōu)化香辛料調(diào)控發(fā)酵芥菜亞硝酸鹽含量的工藝[J].中國食品學(xué)報，2013，13（11）：61-70.

[6] 鄒輝，劉曉英，陳義倫，等.泡菜（白菜） 腌制過程中有機酸對亞硝酸鹽含量的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)， 2013，39（11）：29-32.

[7] 黃葦，吳曉冰，李遠志，等. 抗氧化劑對腌芥菜中亞硝酸鹽消除效果的研究[J].食品科技，2009，34（5）：77-80.

[8] 闞健全，王光慈，陳宗道，等. 藠頭和苦瓜汁抑制亞硝胺合成的體外試驗[J].營養(yǎng)學(xué)報， 1995， 17（4）：409-413.

[9] 汪勤，高祖民.姜汁與維生素 C 阻斷腌漬蔬菜產(chǎn)生亞硝酸鹽的研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1991，14（4）：99-103.