不同病毒感染方法對(duì)山羊體細(xì)胞重編程效率的影響

宋輝 李卉 王鋒

摘要[目的]檢測(cè)2種病毒感染方法（懸浮感染和貼壁感染）對(duì)體細(xì)胞重編程效率的影響。[方法]采用慢病毒作為載體攜帶多能因子分別使用懸浮感染和貼壁感染2種方法感染正常山羊體細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)克隆形成率。[結(jié)果] 懸浮感染和貼壁感染的平均克隆率分別為0.44‰和0.31‰，懸浮感染的效果要顯著地優(yōu)于貼壁感染。[結(jié)論]懸浮感染的方式更利于山羊成纖維細(xì)胞重編程。

關(guān)鍵詞誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞;病毒;重編程效率

中圖分類(lèi)號(hào)S852.65+4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）32-0089-02

Effects of Different Virus Infection Methods on Reprogramming Efficiency of Goat Somatic Cells

SONG Hui1，2，LI Hui1，2，WANG Feng2*

（1.Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance，Ningxia Medical University，Ministry of Education，Yinchuan ，Ningxia 750004;2.Jiangsu Engineering Technology Research Center of Meat Sheep & Goat Industry， Nanjing Agricultural University， Nanjing，Jiangsu 210095）

Abstract[Objective] To study the effect of two kinds of virus infection methods （suspension infection and adherent infection） on somatic cell reprogramming efficiency. [Methods] Lentivirus was used as carrier to carry the pluripotent factor. The somatic cells of normal goat were infected by suspension infection and adherent infection respectively. The colony formation rate was calculated. [Result] The average cloning rate of suspension infection and adherence infection was 0.44‰ and 0.31‰ respectively. The effect of suspension infection was significantly better than that of adherent infection. [Conclusion] The method of suspension infection is more suitable for reprogramming of goat fibroblasts.

Key wordsInduced pluripotent stem cells;Virus;Reprogramming efficiency

體細(xì)胞重編程方法主要包括：核移植、細(xì)胞融合和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞技術(shù)（induced pluripotent stem cells，iPSCs）[1]（圖 1），而目前最常用的方法是iPSCs技術(shù)。但是作為一個(gè)新技術(shù)仍然存在一些問(wèn)題，例如重編程的效率低等。該技術(shù)從產(chǎn)生至今，盡管研究人員不斷對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，Huang等[2]報(bào)道，不論是人類(lèi)細(xì)胞還是小鼠細(xì)胞，不論使用2、3或4個(gè)因子進(jìn)行誘導(dǎo)，VPA都可以有效地提高重編程的效率。VPA與腺病毒和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法相結(jié)合，能否提高重編程的效率仍值得進(jìn)一步探索。

最近的研究也已經(jīng)表明，在重編程過(guò)程中轉(zhuǎn)基因的表達(dá)只需要在開(kāi)始的10～12 d[3-4]，表明游離病毒載體攜帶的外源轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)足夠重編程體細(xì)胞。因此，該研究嘗試在病毒感染的初期使用2種感染方法：懸浮感染和貼壁感染，檢測(cè)是否對(duì)體細(xì)胞重編程效率產(chǎn)生影響，從而為山羊成纖維細(xì)胞重編程提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、血清替代物（KSR）、非必需氨基酸（NEAA）、脂質(zhì)體（Lipofectamine TM 2000）、胰蛋白酶、谷氨酰胺、β-巰基乙醇（β-ME）均購(gòu)置于美國(guó)Life公司;絲裂霉素-C（MIT-C）購(gòu)置于瑞士Roche公司;成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（β-FGF）購(gòu)置于美國(guó)Peprotech公司。

1.2方法

1.2.1懸浮感染。用胰酶消化羊耳成纖維細(xì)胞，用含有病毒感染液的培養(yǎng)液將細(xì)胞吹下。將細(xì)胞懸液鋪到事先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層上。24 h后將病毒感染液吸出，加入體細(xì)胞培養(yǎng)液。24 h后重復(fù)感染一次。4 d后，用胰酶消化病毒感染的羊耳成纖維細(xì)胞，按一定的比例鋪到事先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層上，每天換液，在第6天用ESCs培養(yǎng)基代替體細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到出現(xiàn)克隆。

1.2.2貼壁感染 感染前，在6孔板的一個(gè)孔里鋪上羊耳成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞匯合到80%時(shí)，加入病毒感染液感染（每孔的感染液為：每種病毒濃縮液按照1∶1∶1∶1的比例加入到1 mL體細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻）。24 h后將病毒感染液吸出，加入體細(xì)胞培養(yǎng)液。24 h后重復(fù)感染一次。4 d后，用胰酶消化病毒感染的羊耳成纖維細(xì)胞，按一定的比例鋪到事先準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層上，每天換液，在第6天用ESCs培養(yǎng)基代替體細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，直到出現(xiàn)克隆。

2結(jié)果與分析

2.1病毒感染前后羊耳成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

圖 2A為原代培養(yǎng)的山羊成纖維細(xì)胞，中間夾雜著一些卵圓形的上皮細(xì)胞，經(jīng)過(guò)傳代即可除去混雜的上皮細(xì)胞，得到純度很高的成纖維細(xì)胞，在第2～3代進(jìn)行病毒感染（圖 2B：F3代山羊成纖維細(xì)胞），圖 2C和圖 2D依次分別是經(jīng)過(guò)兩輪病毒貼壁感染和懸浮感染后的山羊成纖維細(xì)胞，由于病毒對(duì)細(xì)胞的損傷導(dǎo)致部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。將病毒感染后的細(xì)胞使用胰酶消化后鋪到事前準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層上繼續(xù)培養(yǎng)（圖 2E和圖 2F），不論是懸浮感染還是貼壁感染，一般都會(huì)在感染后12～15 d出現(xiàn)克隆（圖 2G和圖 2H，表 1）。

2.2不同病毒感染方式對(duì)克隆形成效率的影響

每種感染方式各做了5次重復(fù)試驗(yàn)，每次感染1×105個(gè)細(xì)胞，懸浮感染和貼壁感染的平均克隆率分別為0.44‰和0.31‰，懸浮感染的效果要顯著地優(yōu)于貼壁感染，使用懸浮感染更利于山羊成纖維細(xì)胞重編程。

3結(jié)論與討論

體細(xì)胞重編程的過(guò)程中，一直面臨誘導(dǎo)效率過(guò)低的問(wèn)題，影響因素很多，細(xì)胞本身的質(zhì)量及個(gè)體差異對(duì)誘導(dǎo)結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定的影響，誘導(dǎo)后內(nèi)源基因表達(dá)的時(shí)間和克隆出現(xiàn)的時(shí)間都會(huì)存在一定差異，而其中病毒的用量非常重要，用量過(guò)大會(huì)對(duì)體細(xì)胞造成嚴(yán)重的傷害，用量過(guò)小不足以將體細(xì)胞重編程到需要的程度。因此，該試驗(yàn)采用多次重復(fù)感染，并配合懸浮感染和貼壁感染2種方法，以期增加iPSCs形成的效率和質(zhì)量。結(jié)果表明懸浮感染平均克隆率為0.44‰，而貼壁感染平均克隆率為0.31‰，懸浮感染的效果要顯著優(yōu)于貼壁感染，但是不論用哪種感染方法，對(duì)克隆出現(xiàn)的時(shí)間不會(huì)有太大的影響，一般是在誘導(dǎo)后12～15 d出現(xiàn)克隆。該研究用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)篩選原代克隆進(jìn)行擴(kuò)增[5-6]，iPSCs已經(jīng)傳代超過(guò)20代，傳代細(xì)胞活力旺盛，凍存后快速?gòu)?fù)蘇，其復(fù)蘇后大部分細(xì)胞具有良好的細(xì)胞活力。

參考文獻(xiàn)

[1] YAMANAKA S.Strategies and new developments in the generation of patientspecific pluripotent stem cells[J].Cell Stem Cell，2007，1（1）：39-49.

[2] HUANGFU D W，MAEHR R，GUO W J，et al.Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by smallmolecule compounds[J].Nat Biotechnol，2008，26（7）：795-797.

[3] STADTFELD M，MAHERALI N，BREAULT D T，et al.Defining molecular cornerstones during fibroblast to iPS cell reprogramming in mouse[J].Cell Stem Cell，2008，2（3）：230-240.

[4]

BRAMBRINK T，F(xiàn)OREMAN R，WELSTEAD G G，et al.Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells[J].Cell Stem Cell，2008，2（2）：151-159.

[5] TAKAHASHI K，TANABE K，OHNUKI M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell，2007，131（5）：861-872.

[6] KASTENBERG Z J，ODORICO J S.Alternative sources of pluripotency：Science，ethics，and stem cells[J].Transplant Rev（Orlando），2008，22（3）：215-222.