組培固定番茄雜種優(yōu)勢(shì)優(yōu)化體系的建立

高玉蓉　劉振國(guó)　和江明

摘要[目的]建立組培固定番茄雜種優(yōu)勢(shì)優(yōu)化體系。[方法]以番茄雜種優(yōu)勢(shì)組合優(yōu)秀植株的側(cè)芽作為外植體，MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，通過(guò)添加不同濃度配比的6-BA和IAA篩選適宜的不定芽誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基，并通過(guò)添加不同濃度的NAA篩選適宜的不定芽生根培養(yǎng)基。[結(jié)果]在溫度25～26 ℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d的環(huán)境和靜止培養(yǎng)的條件下，參試材料在MS+6-BA 2.4 mg/L+IAA 0.60 mg/L的培養(yǎng)基上能夠誘導(dǎo)出生長(zhǎng)狀態(tài)良好的不定芽，并且能夠大量增殖；在1/2MS培養(yǎng)基中添加的NAA 濃度為0.5 mg/L時(shí)，不定芽生根狀態(tài)較好。[結(jié)論]該研究建立的番茄雜種優(yōu)勢(shì)組合植株側(cè)芽組培快繁體系，可以快速繁殖出大量番茄雜種優(yōu)勢(shì)組合側(cè)芽的組培苗，將其用于固定番茄雜種優(yōu)勢(shì)，可以達(dá)到加快番茄新品種選育進(jìn)程的目的。

關(guān)鍵詞番茄；植物組織培養(yǎng)；固定；雜種優(yōu)勢(shì)

中圖分類號(hào)S641.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）30-0046-03

Abstract[Objective]To establish optimization system of fixed tomato heterosis by plant tissue culture.[Method]Taking lateral bud from outstanding hybrid tomato plants as explant， MS culture medium as the base，to screen out the induction and enrichment medium for adventitious bud by addition of different ratios of 6BA and IAA. Meanwhile， to screen out the rooting medium by adding different concentrations of NAA. [Result] By static culturing at the temperature of 25-26 ℃ with illumination at 3 000 lx for 12 h/d，the testing explant can be inducted to a well growing adventitious bud in the culture medium containing MS+6BA 2.4 mg/L+IAA 0.60 mg/L. This adventitious bud also can be massively enriched. Rooting status showed well in 1/2MS culture medium with NAA at the concentration of 0.5 mg/L. [Conclusion] The optimization system of fixed tomato heterosis by plant tissue culture can massively and quickly enrich the lateral bud of tomato with heterosis as tissue cultured seedlings， which can be used for fixing the heterosis of tomato and speeding up the cultivation of new tomato species.

Key wordsTomatoes；Plant tissue culture；Fixed；Heterosis

番茄（Lycopersicon esculentum）為一年生果菜，原產(chǎn)于南美洲，是全世界栽培較普遍的果菜之一。我國(guó)各地均普遍栽培，夏秋季出產(chǎn)較多。隨著栽培面積不斷增加，番茄品種不斷更新?lián)Q代，新品種在生產(chǎn)上不斷應(yīng)用。

傳統(tǒng)的番茄改良技術(shù)主要采用有性雜交和在大田條件下大面積選擇，一般是通過(guò)品種間雜交選育具有較強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)的組合，再通過(guò)不同的親本繁殖和雜交制種方式生產(chǎn)出一代雜交種子供生產(chǎn)應(yīng)用。但是，一般要將與多基因相關(guān)雜合性狀進(jìn)行固定， 相對(duì)于單一或者少數(shù)基因相關(guān)性狀的固定， 其分離世代多， 育種難度大，且生產(chǎn)上常規(guī)種子繁殖存在繁殖系數(shù)低、易混雜等不足。在育種初期世代中選拔優(yōu)良個(gè)體， 然后通過(guò)組織培養(yǎng)方式進(jìn)行種苗繁殖以固定雜種優(yōu)勢(shì)的育種方式，為番茄品種快速選育和種苗繁殖提供了新的途徑[1-2]。

利用植物無(wú)性繁殖技術(shù)對(duì)選育出的番茄雜種優(yōu)勢(shì)優(yōu)秀植株直接進(jìn)行種苗生產(chǎn)，省卻了自交系純化、繁制種的煩瑣程序，可以快速高效地利用雜種優(yōu)勢(shì)。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)番茄雜交優(yōu)勢(shì)組合優(yōu)秀植株的種苗，能很好地保持其雜種優(yōu)勢(shì)，不受有性雜交過(guò)程中基因重組導(dǎo)致的性狀分離對(duì)生產(chǎn)性栽培的不良影響，能更好地利用雜交出現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)效應(yīng)，提高育種效率，快速育成優(yōu)勢(shì)明顯的雜交品種。雖然有關(guān)番茄再生體系的研究較多，但是采用側(cè)芽研究番茄再生體系的報(bào)道很少，尤其是采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)固定雜種優(yōu)勢(shì)和快繁雜交優(yōu)良組合種苗的方法鮮見(jiàn)報(bào)道[3-9]。該研究用云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所選育番茄雜交優(yōu)良組合的植株側(cè)芽作試材，建立番茄雜種優(yōu)勢(shì)組合植株側(cè)芽組培快繁體系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1外植體的獲得。番茄雜種優(yōu)勢(shì)組合“7728”的種子，經(jīng)過(guò)催芽處理、育苗、定植大田，按照番茄田間栽培的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行管理，待植株生長(zhǎng)到盛果期時(shí)，選擇各種性狀表現(xiàn)優(yōu)秀的植株，取其健壯側(cè)芽作為外植體。

1.1.2外植體的準(zhǔn)備。將“1.1.1”得到的外植體去除葉片，剪成帶1～2個(gè)節(jié)間5 cm左右的莖段，用洗滌劑洗滌后，流水沖洗20 min，70%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，轉(zhuǎn)入0.1%升汞溶液中浸泡15 min后，再用無(wú)菌水沖洗4次，最后將其浸泡于無(wú)菌水中待用。

1.2培養(yǎng)基選擇MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA 及6-BA與IAA濃度之比為4∶1或6-BA與IAA濃度之比為10∶1的IAA。不經(jīng)過(guò)愈傷組織階段，直接誘導(dǎo)不定芽，具體的培養(yǎng)基配方如下。

1.2.1誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基。MS+6-BA 0.4 mg/L+ IAA 0.10 mg/L；MS+6-BA 0. 8 mg/L+ IAA 0.20 mg/L；MS+6-BA 1.2 mg/L+ IAA 0.30 mg/L；MS+6-BA 1.6 mg/L+ IAA 0.40 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+ IAA 0.50 mg/L；MS+6-BA 2.4 mg/L +IAA 0.60 mg/L；MS+6-BA 2.8 mg/L+ IAA 0.70 mg/L；MS+6-BA 3.2 mg/L+IAA 0.80 mg/L；MS+6-BA 0.4 mg/L+IAA 0.04 mg/L；MS+6-BA 0.8 mg/L+ IAA 0.08 mg/L；MS+6-BA 1.2 mg/L+ IAA 0.12 mg/L；MS+6-BA 1.6 mg/L+IAA 0.16 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+ IAA 0.20 mg/L；MS+6-BA 2.4 mg/L+ IAA 0.24 mg/L；MS+6-BA 2.8 mg/L+IAA 0.28 mg/L；MS+6-BA 3.2 mg/L+IAA 0.32 mg/L。

1.2.2生根培養(yǎng)基。1/2 MS（對(duì)照）；1/2 MS+NAA 0.2 mg/L；1/2 MS+NAA 0.5 mg/L；1/2MS+NAA 0.8 mg/L；1/2MS+NAA 1.0 mg/L。

以上培養(yǎng)基的蔗糖濃度為30 g/L、瓊脂濃度為5 g/L，生根培養(yǎng)基中再添加0.05 g/L的活性炭，pH均調(diào)整為5.8。

1.3培養(yǎng)方法與培養(yǎng)條件

待接種工作準(zhǔn)備就緒后，取出待用外植體，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，切成帶1個(gè)腋芽1 cm左右的莖段，接種于不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。誘導(dǎo)不定芽時(shí)每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種3個(gè)外植體，每個(gè)處理10瓶。誘導(dǎo)不定芽生根接種時(shí)，將不定芽接種于生根培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)瓶中接種20個(gè)不定芽，每個(gè)處理3次重復(fù)。接種完畢，將培養(yǎng)瓶置于如下環(huán)境條件中靜止培養(yǎng)：溫度25～26 ℃，光照強(qiáng)度3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.4數(shù)據(jù)處理與計(jì)算公式

采用 Microsoft Excel 與 SPSS 分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用 LSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

不定芽誘導(dǎo)率=分化的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù) × 100%

分化不定芽數(shù)=誘導(dǎo)得到的不定芽數(shù)/接種的外植體數(shù)

生根率=不定芽生根的數(shù)量/接種的不定芽數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1不定芽誘導(dǎo)

2.1.16-BA與IAA濃度之比為4∶1對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響。

將番茄雜交組合優(yōu)良植株的側(cè)芽接種到6-BA與IAA濃度之比為4∶1的培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，25 d后統(tǒng)計(jì)污染、出芽情況，計(jì)算分化不定芽數(shù)目及不定芽誘導(dǎo)率。

由表1可知，在6-BA與IAA濃度之比為4∶1的情況下， 6-BA 濃度為 2.0 mg/L 以上時(shí)，未受污染的外植體誘導(dǎo)出的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)100%，即接種的每個(gè)側(cè)芽（污染的側(cè)芽除外）均被誘導(dǎo)出不定芽；在 6-BA 濃度為 2.4 mg/L 時(shí)，平均每個(gè)未受污染的外植體誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)目為 4.5 個(gè)，顯著高于其他6-BA濃度水平的誘導(dǎo)數(shù)目，且不定芽葉片伸展、平整，葉色正常，生長(zhǎng)點(diǎn)清晰，狀態(tài)良好；在 6-BA 濃度為 3.2 mg/L 時(shí)，平均每個(gè)未受污染的外植體誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)目只有3.6個(gè)，而且不定芽呈現(xiàn)?；癄顟B(tài)。

2.1.26-BA與IAA濃度之比為10∶1對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響。

將番茄雜交組合優(yōu)良植株的側(cè)芽接種到6-BA與IAA濃度之比為10∶1的培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，25 d后統(tǒng)計(jì)污染、出芽情況，計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率及分化不定芽數(shù)目。

由表2可知，在6-BA與IAA濃度之比為10∶1的情況下， 6-BA 濃度為 2.4 mg/L 以上時(shí)，未受污染的外植體誘導(dǎo)出的不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)100%，即接種的每個(gè)側(cè)芽（污染的側(cè)芽除外）均被誘導(dǎo)出不定芽；在 6-BA 濃度為 2.4 mg/L 時(shí)，平均每個(gè)未受污染的外植體誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)目為 4.4個(gè)，顯著高于其他6-BA濃度水平的誘導(dǎo)數(shù)目，且不定芽葉片伸展、平整，葉色正常，生長(zhǎng)點(diǎn)清晰，狀態(tài)良好；在 6-BA 濃度為 3.2 mg/L 時(shí)，平均每個(gè)未受污染的外植體誘導(dǎo)出的不定芽數(shù)目只有3.7個(gè)，而且誘導(dǎo)出的不定芽呈現(xiàn)玻化狀態(tài)。

綜合表1、2結(jié)果可以看出，番茄雜交組合優(yōu)良植株的側(cè)芽誘導(dǎo)不定芽較適宜的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.4 mg/L+IAA 0.60 mg/L。

2.2不定芽生根

將誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的生長(zhǎng)點(diǎn)清晰、葉色正常、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的不定芽，轉(zhuǎn)接至新的含有相同激素的增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)生長(zhǎng)至苗高3 cm左右時(shí)，再轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基上，14 d后觀察、統(tǒng)計(jì)不定芽基部切口處的生根情況及生根的不定芽數(shù)。

由表3可知，隨著NAA 濃度的增加，不定芽的生根率先增加后降低；當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，不定芽的生根率最高可達(dá)100%，且根數(shù)較多，根的表皮顏色潔白，根尖正常、水嫩；添加過(guò)量的NAA（如1.0 mg/L）時(shí)根的顏色微微發(fā)黃，根尖膨大，有的甚至呈現(xiàn)“馬蹄”形狀。

3討論

該研究通過(guò)直接誘導(dǎo)優(yōu)良番茄雜交組合優(yōu)秀植株的側(cè)芽分化產(chǎn)生不定芽的途徑，建立了再生率高達(dá)100%的番茄再生體系，為番茄雜交育種過(guò)程中盡早固定雜種優(yōu)勢(shì)提供了有效方法。6-BA是植物組織培養(yǎng)常用的細(xì)胞分裂素，廣泛應(yīng)用于番茄再生體系的建立，在該研究中，通過(guò)將6-BA與IAA 配合使用，誘導(dǎo)培養(yǎng)25 d后，統(tǒng)計(jì)不定芽的數(shù)目，盡管與李鐵松等[5]報(bào)道的數(shù)目相比較少，但是他們的結(jié)果是在誘導(dǎo)培養(yǎng)進(jìn)行35 d后統(tǒng)計(jì)得到的；通過(guò)比較6-BA與IAA的不同濃度配比，發(fā)現(xiàn)6-BA與IAA的濃度之比為4∶1時(shí)，不定芽誘導(dǎo)、增殖的效果最好，不定芽生長(zhǎng)速度也比6-BA與IAA的濃度之比為10∶1時(shí)的快。

此外還發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，誘導(dǎo)得到的不定芽數(shù)目會(huì)增加，喪失了分化能力的畸形芽的數(shù)目也會(huì)增加，并且接種的外植體會(huì)部分變褐或試管苗部分成為玻璃化苗。外植體變褐以后，不定芽的葉片也會(huì)有一些黃化，這樣的不定芽生長(zhǎng)緩慢，不易生根。試管苗玻璃化以后，分化能力降低，即使轉(zhuǎn)接到新鮮增殖培養(yǎng)基上也不能夠分化增殖新的生長(zhǎng)正常的不定芽，玻璃化苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上也不能誘導(dǎo)分化出不定根。導(dǎo)致不定芽玻璃化的主要因素是誘導(dǎo)不定芽時(shí)的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基的成分及配比、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)瓶封口膜的透氣性等[10]。縮短不定芽在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)時(shí)間，盡快將不定芽轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，不僅縮短了不定芽和試管苗在培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間，而且避免了外植體褐化和試管苗玻璃化的現(xiàn)象，同時(shí)，也可加快組培試管苗生產(chǎn)速度和降低組培試管苗培養(yǎng)生長(zhǎng)階段的成本。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

4結(jié)論

試驗(yàn)以番茄雜種優(yōu)勢(shì)品種“7728”優(yōu)秀植株的側(cè)芽為試驗(yàn)材料，以培養(yǎng)室溫度為25～26 ℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d的環(huán)境條件以及采用靜止培養(yǎng)的方式，研究了影響番茄側(cè)芽組織培養(yǎng)激素因子的濃度配比，建立了一個(gè)再生頻率高、所需時(shí)間短、試管苗狀態(tài)好的高效再生體系，即在MS + 6-BA 2.4 mg/L+ IAA 0.60 mg/L、蔗糖濃度30 g/L、瓊脂濃度5 g/L、 pH為5.8的培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)。25 d后，將誘導(dǎo)生長(zhǎng)出來(lái)并且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的不定芽叢轉(zhuǎn)接到相同濃度的新鮮增殖培養(yǎng)基上，在相同的環(huán)境條件下進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

當(dāng)不定芽增殖生長(zhǎng)到一定數(shù)量后，再將苗高在2 cm以上的不定芽轉(zhuǎn)接到1/2MS + NAA 0.5 mg/L、蔗糖濃度30 g/L、瓊脂濃度5 g/L、活性炭濃度0.05 g/L、pH 5.8的生根培養(yǎng)基中，在相同的環(huán)境條件和培養(yǎng)方式下進(jìn)行生根培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)這樣的植物組織培養(yǎng)流程，能夠獲得生長(zhǎng)狀態(tài)良好的番茄雜種優(yōu)勢(shì)組合優(yōu)秀植株的試管苗，用于固定番茄雜種優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用于生產(chǎn)。這一優(yōu)化體系的建立為實(shí)現(xiàn)盡早固定番茄雜種優(yōu)勢(shì)，創(chuàng)新番茄雜交育種方法，縮短番茄育種進(jìn)程奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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