石蠟切片方法的改良

趙亞林 閆青地 馮佳佳 肖鋒 楊卓 王鳳茹 董金皋

摘要[目的]快速且安全高效制作石蠟切片。[方法]采用不同的方法，對(duì)植物材料進(jìn)行透明和脫蠟以及包埋處理，把材料制成透明的玻片標(biāo)本，利用正丁醇代替二甲苯作為透明劑和脫蠟劑，其他和傳統(tǒng)的石蠟切片方法相同。[結(jié)果]正丁醇既能與乙醇混合，又能與中性樹膠相融合；正丁醇作用相對(duì)較緩和，透明后的組織平整，沒有明顯的收縮、變形現(xiàn)象，并且不存在透明時(shí)間過長(zhǎng)的問題，還減少了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的傷害。[結(jié)論]該方法可以快速地制作石蠟切片，且安全有效。

關(guān)鍵詞石蠟切片；透明劑；正丁醇；花

中圖分類號(hào)S-03文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）32-0006-03

Method Improvement of Paraffin Section

ZHAO Yalin，YAN Qingdi，F(xiàn)ENG Jiajia，WANG Fengru*，DONG Jinggao* et al（College of Life Science，Agricultural University of Hebei/Key Laboratory of Plant Physiology and Molecular Pathology in Hebei Province，Baoding，Hebei 071001）

Abstract[Objective] The aim was to make paraffin section safely and fast.[Method] Different methods were used to transparent and dewax the plant material and embedding，and the material was made into a transparent glass slide，and the nbutanol could instead of xylene.The other steps were the same as the traditional paraffin section method.[Result] The nbutanol not only could be mixed with ethanol，but also could be mixed with neutral gum.The nbutanol was relatively gentle，could obtain transparent tissue after formation，had no obvious shrinkage，deformation and transparent problem of long time，and reduced the damage to experimental staff.[Conclusion] The method could make paraffin section safely and fast.

Key wordsParaffin section；Clearing agent；nbutanol；Flower

石蠟切片是植物或者動(dòng)物組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的方法。在傳統(tǒng)的石蠟切片時(shí)，常采用二甲苯作透明劑和脫蠟劑。二甲苯的細(xì)胞學(xué)毒性主要體現(xiàn)在誘導(dǎo)線粒體解偶聯(lián)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[1-2]，石蠟切片不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也可以作為病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的重要方法，而且也已相當(dāng)廣泛地用于其他學(xué)科領(lǐng)域的研究中。教學(xué)中，光學(xué)顯微鏡下觀察切片標(biāo)本多數(shù)是石蠟切片法制備的?；畹募?xì)胞或組織多為無色透明，各種組織間和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區(qū)別；由于組織離開機(jī)體后很快就會(huì)死亡和產(chǎn)生組織腐敗，原有的結(jié)構(gòu)形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，因此，組織要經(jīng)固定、石蠟包埋、切片、染色等步驟，以免細(xì)胞組織死亡，從而能清晰辨認(rèn)其形態(tài)結(jié)構(gòu)。

有關(guān)石蠟切片技術(shù)方法改進(jìn)的研究較多，也有文獻(xiàn)報(bào)道利用葵酸丁酯作為透明劑[3]，經(jīng)過長(zhǎng)期的石蠟切片觀察，人們用正丁醇代替二甲苯作為脫水劑和透明劑，發(fā)現(xiàn)其具有軟化組織的作用，不易使材料變脆，有利于切出完整的蠟帶，使得切片的難度得到改善，并使石蠟切片技術(shù)逐漸擴(kuò)展、滲入許多新領(lǐng)域，作為基礎(chǔ)技術(shù)提供有效的實(shí)驗(yàn)或使用樣品。石蠟包埋組織切片還可用于細(xì)胞原位核酸分子雜交技術(shù)中，對(duì)材料中被雜交的DNA分子進(jìn)行定位、含量分析或觀察基因表達(dá)水平；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)可用于固定、石蠟包埋組織的DNA分析[4]，使研究進(jìn)入了分子水平，但這些技術(shù)在短期內(nèi)尚不能做常規(guī)使用。石蠟切片的步驟復(fù)雜，要做出理想的石蠟切片，人們還需要從各步的細(xì)節(jié)著手并進(jìn)行簡(jiǎn)化[5]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物組織。用鋒利的刀片切取新鮮的擬南芥組織材料，同時(shí)取材應(yīng)注意以下事項(xiàng)：①應(yīng)取新鮮的材料，動(dòng)作迅速，避免擠壓損壞組織。②取材不易過老，否則切片有難度（過老的材料必須在滑走切片機(jī)上進(jìn)行）；對(duì)縱切的材料適當(dāng)多取材，如根尖、莖尖等。

1.1.2試劑與儀器。

由于石蠟切片的步驟繁多，所以每一步試劑的選擇都會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生重要影響。常將固定、脫水、透明、脫蠟、復(fù)水、染色等步驟在有蓋容器中進(jìn)行；更換試劑時(shí)，動(dòng)作要迅速，以減少空氣中的水分對(duì)試劑濃度的影響，也可避免切片吸收空氣中的水分而影響最終的制片質(zhì)量，并且盡量減少切片上殘留的試劑，以降低試劑間的相互影響。主要儀器有石蠟切片機(jī)（AO）、恒溫加熱儀、磨刀機(jī)（Leica SP9000）、光學(xué)顯微鏡（OL-YMPUS IX71）。

1.2方法

1.2.1固定。

固定液的作用是使細(xì)胞的新陳代謝瞬時(shí)停止，并保持細(xì)胞或組織的形態(tài)構(gòu)造及其內(nèi)含物的狀態(tài)不發(fā)生變化，達(dá)到使組織變硬從而便于切片[6]，增強(qiáng)內(nèi)含物的折光度，令細(xì)胞易于著色的目的，同時(shí)具有防腐作用。以新鮮配制固定液效果較好。固定的時(shí)間依材料的種類、性質(zhì)、大小等而定。良好的固定劑，應(yīng)是穿透力強(qiáng)，使細(xì)胞立刻致死，原生質(zhì)全部凝固；不發(fā)生任何變形，增強(qiáng)折光率，并且不妨礙染色。固定時(shí)間過長(zhǎng)或固定液濃度高會(huì)使組織變硬，減弱固定液對(duì)組織的滲透能力，造成組織中間部分固定不好[7]。

1.2.2脫水。

脫水劑是與水在任何比例下都能均勻混合的液體，脫水要徹底，以利于后續(xù)步驟操作。傳統(tǒng)所用的脫水方法是將材料靜置脫水，而經(jīng)過改進(jìn)的方法是將脫水容器放在搖床上進(jìn)行，可使材料均勻充分脫水，既節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間，又可以提高工作效率。常用的脫水劑有乙醇、正丁醇等，在以正丁醇作為脫水劑時(shí)，應(yīng)從低濃度到高濃度，以避免組織過度收縮帶來的不良后果；正丁醇可與水、乙醇相混合，而且也能溶解石蠟，所以兼具脫水和透明作用，不會(huì)引起植物材料過度收縮和硬化。

1.2.3透明。透明是脫水和透蠟的橋梁，其作用是使透明劑置換掉組織中的脫水劑，使得組織的折光系數(shù)增強(qiáng)。把脫水處理后的材料依次放在100%乙醇（2/3）+正丁醇（1/3）（30 min）、100%乙醇（1/3）+正丁醇（2/3）（30 min）、純正丁醇（30 min）透明劑中（表1），期間最好更換1次透明劑，使組織得到充分透明[8]，為后續(xù)浸蠟做準(zhǔn)備。正丁醇用作透明劑的優(yōu)勢(shì)是：其作用相對(duì)緩和，透明后的組織平整，沒有明顯的收縮、變形現(xiàn)象，并且不存在透明時(shí)間過長(zhǎng)的問題。同時(shí)甲苯、香柏油等也常用作透明劑。在病理學(xué)上，也常常使用正丁醇代替二甲苯作為組織透明劑，也取得了理想效果[9]。

1.2.4浸蠟。

浸蠟是包埋劑取代透明劑的過程。把透明處理好的材料放在提前融化的石蠟中，恒溫箱溫度應(yīng)調(diào)整至高于石蠟熔點(diǎn)2～3 ℃，配制體積比為1∶1的正丁醇-純石蠟混合液，使用純石蠟替換上一級(jí)溶液，每隔 12 h 換一次純石蠟溶液，共替換 3 次[10]。

1.2.5包埋。

傳統(tǒng)使用的方法是將充分浸蠟的材料倒入已事先疊好的牛皮紙紙盒中，石蠟?zāi)糖耙獢[正材料方向，將包埋盒放入冷水中迅速冷卻備用；該試驗(yàn)探索利用長(zhǎng)方形金屬包埋框?qū)M織進(jìn)行包埋處理，包埋框的長(zhǎng)度和寬度能夠進(jìn)行調(diào)節(jié)，包埋前將金屬框放在平鋪的玻璃板上，將充分浸蠟的材料倒入已事先備好的金屬框架中，利用熱的解剖針擺正材料方向[11]。在石蠟完全凝固但未變硬之前取下金屬框?qū)?/p>

包埋塊進(jìn)行修塊處理，從而提高工作效率。

1.2.6切片、染色、封片。

調(diào)整切片機(jī)的厚度為10 μm，調(diào)節(jié)

刀口與蠟塊的距離、蠟塊的位置。將蠟帶置于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，加蒸餾水展平蠟帶后于42 ℃展片臺(tái)上烤干。將玻片放入染缸，再將甲苯胺藍(lán)染液加入染缸至淹沒玻片，染色10 min，再用雙蒸水清洗玻片，42 ℃烘箱中烘干。正丁醇浸泡玻片2次，每次10 min，取出玻片，在載玻片干之前滴加加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封片[12-14]。

2結(jié)果與分析

對(duì)擬南芥的花蕾固定結(jié)果見圖1。透明前后的擬南芥花見圖2。

利用3種方法分別對(duì)材料進(jìn)行透明處理，并對(duì)最終的結(jié)果進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)改進(jìn)的方法I透明效果較好，對(duì)后續(xù)材料的包埋和切片效果最理想，并且縮短了透明時(shí)間。

利用上述改進(jìn)的方法對(duì)擬南芥花藥進(jìn)行石蠟切片，正丁醇代替二甲苯作為透明劑和脫蠟劑，對(duì)不同發(fā)育時(shí)期擬南芥花進(jìn)行切片[15-16]，同樣能夠做出完整的石蠟切片（圖3）。在保證試驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)，很大程度上降低了二甲苯對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的傷害，是一種理想的二甲苯替代物。

3討論

傳統(tǒng)使用的透明劑和脫蠟劑是二甲苯，二甲苯是一種有芳香氣味的刺激性、易揮發(fā)液體，有毒性，主要對(duì)中樞神經(jīng)和植物神經(jīng)有麻痹和黏膜刺激作用，并對(duì)人牙周組織造成傷害，二甲苯對(duì)女性月經(jīng)及生殖結(jié)構(gòu)也有影響，是一種潛在的致癌物質(zhì)，對(duì)人體危害大[17-18]，廣大病理工作者一直在探索尋找二甲苯的代替物；正丁醇與二甲苯相比屬于低毒類化學(xué)藥品，除一次性吸入大量化學(xué)藥品會(huì)引起輕微的頭痛外，還沒有發(fā)現(xiàn)有其他毒性方面的報(bào)道[19]，為了保護(hù)實(shí)驗(yàn)人員的安全，工作人員應(yīng)注意佩戴口罩和手套等防護(hù)用具；同時(shí)，正丁醇屬于易燃液體，在使用時(shí)應(yīng)注意通風(fēng)透氣，以降低對(duì)工作人員的傷害。

同時(shí)利用甲苯胺藍(lán)作為染色劑，使組織的染色鮮亮，核質(zhì)分明，結(jié)構(gòu)清晰，克服了二甲苯作為透明劑時(shí)染色不佳的問題。擬南芥作為河北省植物生理與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究的模式植物，花藥可以作為植物生殖生長(zhǎng)的研究對(duì)象。該試驗(yàn)只是利用改進(jìn)的方法對(duì)擬南芥的花藥進(jìn)行石蠟切片的處理，后期還將該方法應(yīng)用于擬南芥的其他組織進(jìn)行石蠟切片，以期獲得更多數(shù)據(jù)。

4結(jié)論

利用改進(jìn)的方法對(duì)組織材料進(jìn)行處理，不僅節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，同時(shí)降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的傷害，提高了工作效率。但是對(duì)不同的材料處理所需的時(shí)間和方法也不盡相同，仍需進(jìn)一步研究。該研究對(duì)擬南芥的花藥進(jìn)行不同部位的石蠟切片[20]，利用正丁醇作為透明劑和脫蠟劑，大大降低了傳統(tǒng)透明試劑二甲苯對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的危害；利用包埋框?qū)Σ牧线M(jìn)行包埋處理，縮短了時(shí)間，并且提高了效率。用正丁醇處理材料，透明效果好，浸蠟充分，容易連續(xù)切片，脫蠟快速且干凈，組織結(jié)構(gòu)保持完整。綜上所述，正丁醇可以作為一種相對(duì)安全有效的二甲苯替代物，應(yīng)用于植物組織切片中。

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