高效降解多菌靈芽孢桿菌菌株D—A—2的篩選及鑒定

馬晨　王全

摘要[目的]篩選能高效降解多菌靈的菌株。[方法]對土壤中能高效降解多菌靈菌株D-A-2進(jìn)行分離篩選及鑒定。[結(jié)果]采用管碟法從土壤中初篩得到24株具有活性的菌株，光譜法復(fù)篩得到6株降解能力較強(qiáng)的菌株，并對D-A-2菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定、生理生化特性鑒定和16S rDNA全序列分析。[結(jié)論]D-A-2菌株降解能力最強(qiáng)，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

關(guān)鍵詞多菌靈；降解細(xì)菌；分離；鑒定；枯草芽孢桿菌

中圖分類號S482.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）36-0135-02

Abstract[Objective]To screen the bacterial strains that can effectively degrade carbendazim.[Method]Carbendazimdegrading bacillus strain DA2 in the soil was isolated and identified.[Result] 24 strains with activity were obtained from the soil by cylinderplate method from the soil，6 strains with strong degrading ability were obtained by spectroscopic method.Morphological identification，physiological and biochemical characterization and sequence analysis of 16S rDNA analysis were carried out for strain DA2.[Conclusion]DA2 strain had the strongest degradation ability，which was initially characterized as Bacillus subtilis.

Key wordsCarbendazim；Degeneration bacterium；Isolation；Identification；Bacillus subtilis

多菌靈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的一種苯并咪唑類殺蟲劑，具有高效、低毒、廣譜、內(nèi)吸性等特點(diǎn)，能有效防治病蟲害[1]。但多菌靈化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在土壤中降解半衰期較長[2]，造成了農(nóng)田土壤和農(nóng)產(chǎn)品污染。研究表明，多菌靈可引起肝病[3]，甚至導(dǎo)致染色體畸變[4]，對人體健康有著極大的危害。因此，研究如何降解土壤中的多菌靈具有一定意義。當(dāng)前國內(nèi)外已報道可以降解多菌靈的菌株有假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）[5]、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）[6-7] 、羅爾斯通氏菌（Ralstonia sp.）[8]、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）[9] 和一株木霉菌株（Trichonderma sp.）等[10-11]。該試驗(yàn)篩選獲得一系列降解多菌靈的菌株，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征、生理生化鑒定以及16S rDNA序列的分析，對菌株進(jìn)行鑒定，以期為菌株的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1土樣與藥劑試驗(yàn)土樣來自于保定市周邊被多菌靈污染的土樣；多菌靈購自紅日農(nóng)化有限公司，濃度為80%。

1.2培養(yǎng)基參照沈萍等的《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[12]。

1.3生理生化鑒定及 16S r DNA 鑒定試劑生理生化鑒定試劑參照東秀珠等的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]；

16S r DNA 鑒定試劑參照奧斯伯的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[14]。

1.4降解菌分離和篩選

1.4.1土樣采集。從保定市附近被多菌靈污染的農(nóng)田土壤地表以下10～15 cm深處按5點(diǎn)取樣法取樣，各取50～100 g，做好標(biāo)記。

1.4.2制備菌懸液。稱取5 g土樣放入45 mL無菌水中，充分混勻（用力振蕩5 min）制得菌懸液。90 ℃水浴鍋加熱處理10 min，以富集產(chǎn)芽孢細(xì)菌。

1.4.3產(chǎn)芽孢細(xì)菌富集培養(yǎng)。取上述菌懸液5 mL接于配好的富集培養(yǎng)基（多菌靈濃度50 mg/L）中，30 ℃、180 r/min 培養(yǎng)48 h后，取3.0 mL新鮮的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到多菌靈濃度為100 mg/L的富集培養(yǎng)基中；30 ℃、 180 r/min培養(yǎng)48 h后，取3.0 mL新鮮的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到多菌靈濃度為200 mg/L的富集培養(yǎng)基中； 30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，混勻備用。

1.4.4菌株分離與篩選。取第3次富集培養(yǎng)液進(jìn)行系列稀釋，取10-4、10-5、10-6這3個稀釋度的菌液各100 μL接于固體篩選培養(yǎng)基上，涂布均勻，30 ℃培養(yǎng)48～72 h至長出菌落。挑取平板上形態(tài)、顏色不同的菌落劃線于NA平皿中檢測純度。純化后編號并轉(zhuǎn)接于NA斜面上30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后4 ℃冰箱保存以備復(fù)篩。

1.4.5復(fù)篩。對初篩所得菌株，挑取少量斜面菌苔轉(zhuǎn)接于多菌靈濃度為50 mg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，過膜，除去菌體，于紫外分光光度計(jì)281 nm下測定上清液中農(nóng)藥殘留量，以不加菌為空白對照。

1.5細(xì)菌鑒定方法

1.5.1形態(tài)鑒定。將細(xì)菌劃線接種于NA平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)。參照東秀珠等[13]的方法進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色，顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)。

1.5.2生理生化鑒定。參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[12-13，15]上的方法對菌株進(jìn)行生理生化鑒定，包括糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、纖維素分解試驗(yàn)、產(chǎn)氨試驗(yàn)、膿青素產(chǎn)生試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、熒光色素試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、丙二酸鹽試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、3-酮基乳糖試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、反硝化試驗(yàn)、亞硝酸還原試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)、酯酶試驗(yàn)。

1.5.316S rDNA基因序列測序。

1.5.3.1提取基因組?；罨?xì)菌，培養(yǎng)10～12 h。取1 mL菌液，10 000 r/min離心10 min，棄去上清。加30 μL 0.05 mmol/L NaOH吹吸使菌體懸起來混勻。沸水浴15 min，10 000 r/min離心2～3 min，取上清即為DNA。將DNA放入冰箱，用時稀釋10倍。

1.5.3.2PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為模板5.0 μL、E 0.2 μL、H2O 9.3 μL、Buffer 2.5 μL、dNTP 2.0 μL、引物（1）0.5 μL、引物（2）0.5 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性 30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸80 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸 30 min。

1.5.3.3電泳檢測。制膠：（小板10孔）瓊脂糖0.2 g+20 mL TAE，加熱2 min。

點(diǎn)樣：樣品5 μL/孔+5 μL Buffer 混勻，點(diǎn)樣后蓋好，電泳30 min。

2結(jié)果與分析

2.1土樣中降解菌分離篩選

采用管碟法初步篩選出24株具有降解活性的菌株，光譜法復(fù)篩得到6株活性較強(qiáng)的菌株，將其命名為D-A-1、D-A-2、D-A-3、D-A-4、D-A-5、D-A-6。

2.2多菌靈降解菌降解效率測定

通過測定求得多菌靈降解效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.038 0x+0.003 2，相關(guān)系數(shù)為0.999 4（圖1）。

2.3菌株鑒定

2.3.1形態(tài)鑒定。通過對6株菌菌落形態(tài)的觀察，初步判斷均為細(xì)菌菌落，圓形或近圓形、污白色不透明、濕潤、邊緣不整齊，革蘭氏陽性菌，有芽孢。

2.3.2生理生化試驗(yàn)結(jié)果。D-A-2菌株可以利用檸檬酸鹽、丙二酸鹽，能分解葡萄糖（但不能進(jìn)一步產(chǎn)生酸代謝）、蔗糖、纖維素、含氮有機(jī)物、蛋白胨并生成吲哚，能水解淀粉，具有硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、過氧化氫酶、苯丙氨酸脫氨酶、脲酶，可以進(jìn)行反硝化，能產(chǎn)生熒光色素，有膿青素產(chǎn)生，不能分解乳糖，酯酶試驗(yàn)不產(chǎn)生暈圈，不是銅綠假單胞菌。

綜合以上生理生化特性鑒定結(jié)果，對照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[15]，初步鑒定菌株 D-A-2屬于芽孢桿菌屬。

2.3.316S rDNA提取純化及測序結(jié)果。對多菌靈降解效力最強(qiáng)的D-A-2進(jìn)行了基因組DNA的提取純化，電泳圖譜如圖2所示。

3結(jié)論與討論

綜上對篩選菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特征的研究，初步確定D-A-2分別為芽孢桿菌屬，為確定種屬，對D-A-2進(jìn)行了16S rDNA基因測序，確定該菌株為枯草芽孢桿菌，其在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對多菌靈的降解率為4.00%。

接下來可以進(jìn)一步確定此菌的降解效果以及降解機(jī)理，為投入實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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