寧夏春小麥矮稈基因分子標(biāo)記檢測(cè)分析

劉鳳樓　賈影影　陳麗萍

摘要[目的]分析寧夏春小麥育種材料常用矮稈基因的分布，為本地小麥改良株高性狀提供理論依據(jù)。[方法]以寧夏大學(xué)小麥遺傳育種實(shí)驗(yàn)室212個(gè)（其中54個(gè)材料由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)）春小麥育種親本為材料，調(diào)查其株高、穗長(zhǎng)、穗下莖節(jié)等農(nóng)藝性狀，利用分子標(biāo)記檢測(cè)分析材料中常用矮稈基因Rht-B1b（Rht1）、Rht-D1b（Rht2）和Rht8的分布。[結(jié)果]中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)材料的株高、穗長(zhǎng)、穗莖節(jié)的平均值（分別為69.2、7.8、28.5 cm）明顯低于現(xiàn)有親本材料（分別為83.6、11.1、32.0 cm）。矮稈基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)166份材料攜帶Rht-B1b基因，占總檢測(cè)材料的75.1%；88份材料含有Rht-D1b基因，占39.8%；191份材料含Rht8基因，占總檢測(cè)材料的86.4%。攜帶Rht-D1b基因的9個(gè)材料同時(shí)含有Rht-B1b和Rht8基因。其中，引進(jìn)材料中Rht8、Rht-B1b、Rht-D1b分別占85.1%、72.0%、33.3%，與整體材料中各矮稈基因分布相似。[結(jié)論]目前寧夏春小麥育種材料中普遍含有矮稈基因Rht8，其次是Rht-B1b，但主栽品種和主推品種以及核心育種親本材料均含有Rht-D1b，即現(xiàn)有親本材料中含Rht8+Rht-B1b的材料所占比例較Rht8+Rht-D1b多，但新培育的品種以含有Rht8+Rht-D1b為主。這可能是主栽品種寧春4號(hào)（Rht8+Rht-D1b）在當(dāng)?shù)亻L(zhǎng)期種植，并作為育種骨干親本被長(zhǎng)期利用的結(jié)果。

關(guān)鍵詞春小麥；矮稈基因；Rht-B1b；Rht-D1b；Rht8；分子標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào)S512.1+2；S338 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）36-0127-04

Abstract[Objective]To study the distribution of common dwarfing genes in spring wheat breeding materials in Ningxia for providing theoretical basis to improve the plant height traits of local wheat.[Method]For improving the plant height，specific molecular markers were used to detect the distribution of dwarfing genes Rht-B1b， Rht-D1b and Rht8 in Ningxia spring wheat.Agronomic traits such as plant height， spike length， peduncle length， length of the second and third internode from top were investigated in 212 spring wheat genotypes（among them，54 spring wheat genotypes were introduced from Chinese Academy of Agricultural Sciences）.[Result]The average value of plant height，spike length and peduncle length of local materials （83.6，11.1，32.0 cm） were significantly higher than the introduced genotypes （69.2，7.8，28.5 cm）.Dwarfing genes analysis revealed that 166 （75.1%） genotypes with Rht-B1b，88 （39.8%） genotypes with Rht-D1b，191（86.4%） genotypes with Rht8. Besides，there are 9 introduced genotypes containing all three genes，and the distribution of the three genes in the introduced materials were similar with the local materials that each gene Rht8，Rht-B1b，Rht-D1b accounted for 85.1%，72.0%，33.3% of the total amount respectively.[Conclusion]The Rht8 gene extensively distributed in Ningxia spring wheat then Rht-B1b.Although，the local varieties and breeding cultivars were all bringing with Rht-D1b but Rht8+Rht-B1b genotypes were much more than Rht8+Rht-D1b.The reason for new released varieties mainly containing Rht8+Rht-D1b is possibly because of the local cultivar Ningchun 4（Rht8+Rht-D1b）cultivated for long time and as a primary breeding material adopted in local area.

Key wordsSpring wheat；Dwarfing gene；Rht-B1b；Rht-D1b；Rht8；Molecular marker

20世紀(jì)60年代以來(lái)，作物矮化育種已成為近代作物高產(chǎn)育種的重大突破。人們將矮稈基因在作物改良中的應(yīng)用稱(chēng)為“綠色革命”。自此，人們對(duì)矮稈基因的研究和利用從未間斷。利用矮稈基因調(diào)節(jié)株高是世界各國(guó)小麥育種的核心目標(biāo)之一，同時(shí)也是培育高產(chǎn)和超高產(chǎn)小麥品種的主要策略之一[1]。適度地降低植株株高常與提高小麥抗倒伏性、提高收獲指數(shù)和產(chǎn)量潛力相關(guān)。矮稈基因Rht-B1b（Rht1）、Rht-D1b（Rht2）和Rht8的利用極大地促進(jìn)了世界范圍內(nèi)小麥產(chǎn)量的增加。常規(guī)育種與分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的緊密結(jié)合已經(jīng)成為今后小麥育種的發(fā)展方向。各國(guó)普遍重視簡(jiǎn)便、實(shí)用和可靠的分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，驗(yàn)證與利用，分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為準(zhǔn)確快速檢測(cè)鑒定矮稈基因提供了可能[2]。小麥Rht （Reduced height） 基因是目前生產(chǎn)上利用較多的控制株高的主效基因。Rht-B1b（Rht1）、Rht-D1b（Rht2）和Rht8是我國(guó)常用的矮稈基因[3]。了解現(xiàn)有小麥品種和骨干親本的矮稈基因分布有助于對(duì)株高和產(chǎn)量潛力的改良。該研究以寧夏現(xiàn)有春小麥品種（系）及親本材料為對(duì)象，分析材料的相關(guān)農(nóng)藝性狀和常用矮稈基因的分布情況，拓寬對(duì)現(xiàn)有春小麥品種（系）及親本材料遺傳背景的了解，為寧夏春小麥品種選育中株高性狀的選擇與利用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

212份春小麥品種（系）及親本材料，其中，54份從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)的矮稈材料編號(hào)為P01～P54；165份本地材料編號(hào)為P001～P165，包含寧春4號(hào)、寧春40號(hào)、寧春44號(hào)、寧春45號(hào)、寧春50號(hào)、寧春53號(hào)，寧2038，J058等現(xiàn)有品種或品系以及由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院和寧夏農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)中心饋贈(zèng)的矮稈材料MagnifM1；54份引進(jìn)材料中部分晚熟被淘汰，最終保留了47份材料。

1.2農(nóng)藝性狀測(cè)量小麥成熟期，每個(gè)材料隨機(jī)選取3個(gè)樣點(diǎn)收獲5～10株，并從中選取3個(gè)完整植株，分別測(cè)量株高、穗長(zhǎng)、穗下莖節(jié)長(zhǎng)、倒二莖節(jié)長(zhǎng)、倒三莖節(jié)長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)平均值。

1.3DNA提取

在小麥拔節(jié)前取各材料幼葉樣品1～2 g，采用SDS法提取樣品DNA，用瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定DNA濃度。

1.4矮稈基因Rht-B1b（Rht1）、Rht-D1b（Rht2）和Rht8分子標(biāo)記檢測(cè)

1.4.1PCR擴(kuò)增引物。矮稈基因Rht8、 Rht-B1b和Rht-D1b標(biāo)記序列信息見(jiàn)表1。其中Rht-D1a 和Rht-B1a 分別為 Rht-D1b （Rht2）基因和Rht-B1b （Rht1）基因位點(diǎn)的野生型，被檢測(cè)材料的Rht1和 Rht2基因位點(diǎn)分別應(yīng)用其對(duì)應(yīng)的突變型和野生型2對(duì)特異引物進(jìn)行相互驗(yàn)證檢測(cè)。缺失數(shù)據(jù)采用PCR試劑盒重復(fù)試驗(yàn)，并進(jìn)一步檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.4.2PCR擴(kuò)增體系。PCR反應(yīng)體系為10 μL：10×Taq DNA 聚合酶Buffer 1.0 μL，1 mmoL/L dNTP 1.0 μL，25 ng/μL DNA模板2.0 μL，1 μmoL/L Forward Primer 1.5 μL，1 μmoL/L Reverse Primer 1.5 μL，25 mmol/L Mg2+ 0.6 μL，5 U/μL Taq 聚合酶0.1 μL，ddH2O補(bǔ)至10 μL。

1.4.3PCR擴(kuò)增程序。95 ℃5 min；95 ℃30 s，60 ℃/63 ℃/ 68 ℃ 45 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min，4 ℃保存。

1.4.4PCR結(jié)果檢測(cè)。Rht1及Rht2基因野生型和突變型的PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中以溴酚藍(lán)作為指示劑，用溴化乙錠染色，0.5×TBE緩沖液120 V恒壓電泳（DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀）40 min。電泳結(jié)果由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院遺傳育種實(shí)驗(yàn)室全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察并保存。Rht8基因的擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)銀染檢測(cè)后記錄目的條帶。

2結(jié)果與分析

2.1農(nóng)藝性狀調(diào)查結(jié)果

2.1.1212份材料株高分布。由圖1可知，212份材料株高集中在56.48～102.85 cm，其中67.39 cm處有一個(gè)峰值，主要是由于北京引進(jìn)材料株高整體偏低所引起（平均株高為69.24 cm）。另外一個(gè)峰值由剩余167個(gè)材料株高數(shù)據(jù)產(chǎn)生，這些材料的株高平均值為83.57 cm。由調(diào)查數(shù)據(jù)得出北京引進(jìn)材料整體株高低于本地材料，材料中也有極端高和極端矮的類(lèi)型。

2.2矮稈基因分子標(biāo)記檢測(cè)分析

2.2.1矮稈基因Rht1檢測(cè)分析。

由圖6部分材料矮稈基因Rht1檢測(cè)分析結(jié)果可以看出，寧春4號(hào)、寧春44號(hào)、寧春40號(hào)、寧春45號(hào)、寧春50號(hào)和寧2038無(wú)Rht1基因，同時(shí)，矮稈材料MagnifM1和P19、P001、P007均不含Rht1基因。檢測(cè)結(jié)果中僅寧春53號(hào)，高代材料J058和P12含有Rht1基因突變位點(diǎn)。

3結(jié)論與討論

利用楊松杰等[4]、張曉科等[6]檢測(cè)的Rht-B1b 和Rht-D1b基因及Rht8基因的標(biāo)記引物，該試驗(yàn)分析了212份寧夏現(xiàn)有春小麥親本材料及骨干品種（系）主要矮稈基因的分布情況。Rht-B1b和Rht-D1b基因在全國(guó)各個(gè)生態(tài)區(qū)育成品種中的分布頻率不同[5]，Rht-B1b高頻率分布地域出現(xiàn)在黃淮冬春麥區(qū)，而Rht-D1b基因高頻率分布地域就出現(xiàn)在北部春麥區(qū)。由于不同品種的遺傳背景不同，所含矮稈基因的類(lèi)型和數(shù)目不同，很難對(duì)Rht-B1b和Rht-D1b基因的效應(yīng)進(jìn)行單獨(dú)分析[7]。Rht8基因在我國(guó)廣泛分布[8]，這與該試驗(yàn)中

各材料檢測(cè)的結(jié)果一致。農(nóng)藝性狀測(cè)定分析結(jié)果表明，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院引進(jìn)的47份材料株高、穗長(zhǎng)、穗下莖節(jié)長(zhǎng)平均

值（分別為69.2、7.8、28.5 cm）明顯低于現(xiàn)有親本材料（分別

為83.6、11.1、32.0 cm），在配制雜交組合時(shí)可以考慮利用引

進(jìn)材料進(jìn)行矮稈育種。

212份材料矮稈基因檢測(cè)結(jié)果表明，目前寧夏春小麥育種材料中普遍含有矮稈基因Rht8，其次是Rht-B1b（Rht1），但主栽品種和主推品種以及核心育種親本材料均含有Rht-D1b（Rht2），即現(xiàn)有的育種親本材料中攜帶Rht8+Rht-B1b的材料所占比例較Rht8+Rht-D1b多。新培育的品種以含有Rht8+Rht-D1b為主，這可能是主栽品種寧春4號(hào)（Rht8+Rht-D1b）在當(dāng)?shù)亻L(zhǎng)期種植，并作為育種骨干親本被長(zhǎng)期利用的結(jié)果。

此外，該研究還檢測(cè)到了9份同時(shí)含有Rht8、Rht-B1b、Rht-D1b 這3個(gè)矮稈基因的材料。這與唐娜等[9]對(duì)現(xiàn)有品種的分析結(jié)果不同。這些包含3個(gè)矮稈基因的材料均為外引材料，且都表現(xiàn)出極端矮小、晚熟的特性，一般不會(huì)在生產(chǎn)實(shí)際中被利用，僅在遺傳學(xué)分析中才會(huì)有少量的應(yīng)用。

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