不同處理對桃形李采后病原菌防治效果

何瑩蓉 林海雁 曹宗威 胡巧萍 李銀平 胡會剛 莫億偉

摘 要 桃形李采后極易發(fā)生病害，難以保鮮，為了控制桃形李采后病害的發(fā)生，通過對分離到的病原菌擴(kuò)展青霉菌株（Penicillium expansum，TXL-01）進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和對其它水果致病性試驗，分別用硝普鈉、葡萄籽提取物和NaHCO3在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行抑菌實驗。結(jié)果表明：形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)致病菌菌絲有分枝和橫隔膜，具帚形孢子囊，能產(chǎn)生大小不同的2種類型孢子；對多種水果侵染后均能致病，說明致病菌對宿主要求專一性不高；硝普鈉和葡萄籽提取物只能在前3 d抑制病原菌的生長，但是在第4 天以后與對照無明顯差異；NaHCO3濃度為0.10%和0.15%時，培養(yǎng)到第6天時能顯著抑制病原菌生長；當(dāng)NaHCO3為0.2%時，培養(yǎng)到第12天時內(nèi)還能抑制病原菌生長；再分別以0.10%、0.15%、0.20% NaHCO3和0.20% NaHCO3+1.0%殼聚糖（Chitosan）復(fù)合處理桃形李采后果實，發(fā)現(xiàn)0.20% NaHCO3處理雖然也能減少果實腐爛率，但結(jié)合1.0% Chitosan涂膜處理對果實保鮮效果更好，可以顯著抑制致病菌的發(fā)生，降低果實發(fā)病率，說明NaHCO3和Chitosan復(fù)合處理可以應(yīng)用于桃形李的采后保鮮。

關(guān)鍵詞 桃形李；擴(kuò)展青霉；碳酸氫鈉；硝普鈉；抑菌試驗

中圖分類號 S667.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Shengzhou Nane can easily accelerate the process of water loss， softening， microbial attacking and decay of fruits during post-harvest storage. The shelf life of fresh fruit is very short， and the fruit can deteriorate within a few days under ambient temperature. In order to control the fruit disease in harvested period， studies were conducted on the morphology of the isolated pathogen from fruit and its host range to other fruits. Three substances including nitroprusside， grape seed extract， and sodium bicarbonate were used on antibacterial tests. In addition， sodium bicarbonate in combination with 1.0% chitosan was used as the preservation treatment in Shengzhou Nane. Morphological observation showed that the pathogen had diaphragm and broom-shaped sporangia branches and could produce two kinds of spore in different sizes. A variety of infected fruits revealed that the requirement for the pathogens host range specificity was not so high. Nitroprusside and grape seed extract could inhibit the growth of the pathogen for the former 3 days， while there was no significant difference between the treatment and control after 4 days. Sodium bicarbonate with concentration of 0.10%， 0.15% could remarkably inhibit the growth of the pathogen for 6 days cultivation， and the inhibition lasted 12 days and with concentration of 0.20%， In addition， 0.20% sodium bicarbonate combined with 1.0% Chitosan was used for postharvest plum could remarkably reduce the decay rate of fruits， indicating a better effect. Thus， the combinational treatment could significantly inhibit the occurrence of the pathogen and reduce morbidity in the fruit. As a result， an improvement in storability and thus prolonged storage time were achieved for Shenzhou Nane fruits during post-harvest period.

Key words Shengzhou Nane； Penicillium expansum； sodium bicarbonate； nitroprusside； antibacterial test

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.023

嵊州桃形李果實心形，味甜且香氣較濃，汁液豐富酸甜可口，可食率達(dá)97.8%，成熟于7月中旬，正值產(chǎn)地高溫多雨季節(jié)。高溫條件下，桃形李果實采后呼吸旺盛迅速軟化而易受多種病原菌侵染。項目組前期對嵊州桃形李采后保鮮研究發(fā)現(xiàn)，常溫條件下果實難以保鮮，極易發(fā)生病害，但若貯藏溫度過低則易出現(xiàn)冷害現(xiàn)象，冷害后果皮和果肉均發(fā)生褐化變色失去食用價值，因此桃形李采后病害防治和保鮮技術(shù)還需深入研究。水果采后保鮮通常有物理、化學(xué)、單一或復(fù)合涂膜保鮮法等[1-2]，其中化學(xué)殺菌劑對水果采后病原菌防治相對較好，但若頻繁使用則引起病原菌產(chǎn)生抗藥性和農(nóng)藥殘留超標(biāo)等問題[3]，隨著公眾對農(nóng)藥殺菌劑殘毒日益關(guān)注，化學(xué)殺菌劑應(yīng)用范圍已受到了不少限制[4]，因此安全有效的采后病害防控技術(shù)顯得更價值。葡萄籽提取物具有強(qiáng)烈抑菌和抗氧化作用，如經(jīng)葡萄籽提取物處理后能顯著抑制鴨梨黑斑病和青霉病的發(fā)生[5]，還能降低桃果實貯藏期的腐爛率和減輕果肉褐變系數(shù)[6]；同時殼聚糖在果蔬保鮮方面已有廣泛的應(yīng)用并取得良好的效果[7-8]，并有顯著抑菌效果[9-10]。但葡萄籽提取物和殼聚糖應(yīng)用在桃形李采后保鮮方面則少有報道。

硝普鈉作為一種新型保鮮劑，通常被用作NO供體，用硝普鈉溶液浸泡果實比直接用NO處理所需無氧條件下處理更為有效，目前已應(yīng)用于菠菜、蘆筍、香蕉等蔬果的保鮮[11-13]；而碳酸氫鈉（NaHCO3）被公認(rèn)為是一種安全、價格低廉的化學(xué)物質(zhì)，在食品工業(yè)有著廣泛應(yīng)用，NaHCO3能夠抑制多種果實病原真菌的生長，抑制采后病害的發(fā)生，增強(qiáng)果實對病原菌侵染的抗性[14-15]，潘寒姁等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，NaHCO3和抗壞血酸復(fù)合處理還能有效地抑制蘋果切片的褐變，并能控制微生物污染。但硝普鈉和NaHCO3這2種藥劑在應(yīng)用于桃形李采后保鮮也未見相關(guān)的報道。本文以前期實驗中從桃形李果實中分離到的主要致病菌擴(kuò)展青霉菌（Penicillium expansum）為材料，重點探討其致病能力及其無公害的防治方式，為其采后保鮮提供新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

碳酸氫鈉（NaHCO3，分析純）和硝普鈉（Na2[Fe（CN）5NO]·2H2O，分析純），葡萄籽提取物（寶雞潤木農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，純度95%），致病菌擴(kuò)展青霉菌（Penicillium expansum，TXL-01）（本實驗室從病果上分離純化后，經(jīng)分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定的菌種）。

1.2 方法

對病原菌按常規(guī)的方法培養(yǎng)后，觀察在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d菌落形態(tài)，再用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲及孢子形態(tài)。參考朱迎迎等[17]的刺傷接種法鑒定病原菌對不同品種水果的致病性，每種處理接種3個果實，以接種蒸餾水為對照，保鮮袋封口后，置于（30+1）℃，相對濕度為85%～90%的人工氣候箱內(nèi)貯藏，第2～3天后開始統(tǒng)計果實發(fā)病情況，以果實表面明顯看到菌斑的擴(kuò)大為發(fā)病，計算發(fā)病率。

不同試劑對病原菌的抑菌效果試驗，在前期實驗的基礎(chǔ)上，分別將0.2%硝普鈉、0.2%葡萄籽提取物和不同濃度的NaHCO3（0、0.15%、0.20%）加入PDA培養(yǎng)基中，再分別接種1 mL 105個/mL菌液，然后置于（30+1）℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，從第3天開始觀察培養(yǎng)基上病原菌生長及菌落大小，一直觀察到第14天。

嵊州桃形李（Shengzhou Nane）從浙江省嵊州市金庭鎮(zhèn)華堂桃形李合作社果園采收后，挑選大小一致、色澤相當(dāng)，無病蟲害約8～9成成熟果實，在18 ℃條件下運回實驗室。分別用0、0.10%、0.15%、0.20% NaHCO3及0.20% NaHCO3+1.0%水溶性殼聚糖（Chitosan）浸泡果實5 min后取出，每種濃度處理30個果實，4次重復(fù)，共處理120個果實，并在18 ℃空調(diào)房內(nèi)晾干表面水分后，用保鮮袋包裝后貯藏于相對濕度為80%～85%，模擬室外環(huán)境溫度（29+1）℃人工氣候箱內(nèi)貯藏，在貯藏第9天后統(tǒng)計果實發(fā)病情況，以出現(xiàn)明顯病斑計為發(fā)病果，統(tǒng)計發(fā)病果占總果數(shù)百分率。果實發(fā)病率=發(fā)病果數(shù)/總果數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)采用SPSS14.0軟件進(jìn)行方差分析，并利用Duncan多重比較，進(jìn)行差異顯著性分析，p<0.05表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃形李采后主要病害的癥狀和病原菌的形態(tài)特征

桃形李采后病害癥狀和病原菌形態(tài)特征見圖1。由圖1可知，桃形李果實采后貯藏過程中很快出現(xiàn)病害癥狀，果實表面呈現(xiàn)不規(guī)則果皮開裂情況，同時出現(xiàn)明顯的水漬狀病斑，病斑部位有白色或灰色絨狀物，隨后病斑擴(kuò)大與其他病斑愈合形成更大病斑（圖1-a）。通過分離純化致病菌后經(jīng)顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)菌絲體有橫隔膜，并能進(jìn)行分枝狀生長（圖1-b），同時具有帚形孢子囊（圖1-c），能產(chǎn)生大小不同的2種類型孢子（圖1-c，d），經(jīng)過前期的分子鑒定，確定為擴(kuò)展青霉菌（Penicillium expansum，TXL-01菌株）。

2.2 桃形李采后病原菌對其他水果的侵染力分析

為探討病原菌對不同水果的寄主適應(yīng)性，分別對梨、蘋果、油桃、香瓜、圣女果、葡萄、香蕉、芒果、黃瓜和火龍果等進(jìn)行刺傷法接種實驗，發(fā)現(xiàn)香蕉、芒果、香瓜、圣女果、葡萄和蘋果都能誘導(dǎo)致病，說明病原菌對寄主要求的專一性不高，具有廣譜性特點，但可能是由于不同水果所含養(yǎng)分不同，在接種相同劑量的菌液后，不同水果上表現(xiàn)出的生長速率因品種不同而各異。其中對梨、蘋果和油桃接種后這3種果實出現(xiàn)病癥最快，接種后第3天就明顯看到接種的部位發(fā)生明顯病斑，而圣女果和葡萄在第4天就明顯出現(xiàn)病癥，香瓜、香蕉、芒果則在第5天后才能出現(xiàn)明顯病癥。但黃瓜和火龍果在接種7～10 d內(nèi)都沒有致病，說明這種致病菌不適宜在這2種水果上生長，因而無法誘導(dǎo)這2種水果產(chǎn)生病害，其原因還須深入研究。

2.3 不同濃度藥劑處理對菌落生長的影響

不同藥劑處理對菌落生長的影響圖2。由圖2可知，在PDA培養(yǎng)基上加入不同濃度藥劑后，菌落的生長速率也不同。其中0.20%硝普鈉和葡萄籽提取物在培養(yǎng)前3 d有一定的抑菌效果，但第4天菌落開始恢復(fù)生長（圖2-a、b），到培養(yǎng)的第6天后，與對照完全沒有差異。說明硝普鈉和葡萄籽提取物對桃形李致病菌沒有抑菌效果，因此在生產(chǎn)上不宜應(yīng)用。

在PDA培養(yǎng)基中分別加入0.10%、0.15%和0.20% NaHCO3后，在處理的前6 d，所有菌落都不能生長。但在第8天后，在0.10%和0.15%也出現(xiàn)部分菌落的生長；而加入0.20% NaHCO3的培養(yǎng)基培養(yǎng)到第9天時也沒有發(fā)現(xiàn)新的菌落產(chǎn)生（圖2-e），但在培養(yǎng)到第12天后，散落孢子萌發(fā)形成的菌落開始生長，到第14天則大量生長（圖2-f），說明NaHCO3能顯著抑制桃形李病原菌的生長，因此可以在生產(chǎn)上應(yīng)用。

2.4 不同濃度NaHCO3及與殼聚糖復(fù)合處理對桃形李采后腐爛的防病效果

與對照處理相比，不同濃度NaHCO3處理后，果實采后貯藏過程中腐爛率均明顯低于對照。從圖3可知，采后果實經(jīng)0、0.10%、0.15%和0.20%NaHCO3溶液浸泡處理后，果實腐爛率分別為43.14%、38.86%、31.14%和23.45%，除了0.10%處理與對照沒有顯著差異外，其它2個濃度處理均顯著低于對照處理（p<0.05）。若在0.20% NaHCO3基礎(chǔ)上再加入1.0% Chitosan復(fù)合處理后，果實腐爛率僅為17.96%，更顯著低于對照處理的果實腐爛率（p<0.05），說明NaHCO3處理在采后貯藏過程中能顯著抑制桃形李果實表面病原菌的生長；若同時加以Chitosan涂膜處理后，在果實表面就形成一個保護(hù)膜，進(jìn)一步減少果實表面的失水率，對維持果實硬度也有明顯的促進(jìn)作用，并且殼聚糖形成保護(hù)膜也減少了病原菌對果實侵染，使得果實發(fā)病率更低，因此這種復(fù)合處理技術(shù)可在桃形李采后保鮮應(yīng)用。

3 討論

3.1 病原對宿主的要求具有廣譜性

本研究表明，從桃形李果實上分離到擴(kuò)展青霉菌菌株能引起多種水果發(fā)生病害，說明這種病菌對宿主要求不高，具有廣譜性致病特點。如對蘋果和梨接種后，在第2天就出現(xiàn)明顯病害癥狀，可能這一類果實所含養(yǎng)分適宜病原菌生長，同時這個菌株對梨、蘋果、葡萄、油桃、櫻桃、杏等果實有誘導(dǎo)致病作用。因此，生產(chǎn)上和貯運期間應(yīng)注意防止病原菌交叉感染，這與歐李褐腐病的病原菌相似[18]。但試驗也發(fā)現(xiàn)，對黃瓜和火龍果接種病原菌后，在10 d內(nèi)均不能誘導(dǎo)這2種果實發(fā)病，說明該病原菌對宿主有選擇性，其原因可能與不同品種果實所含養(yǎng)分不同或是病原菌所需要生長條件有關(guān)，具體原因有待于深入研究。

3.2 不同藥劑的作用效果

前人對植物提取物抑菌試驗已有不少研究，如香茅精油對櫻桃番茄灰葡萄孢菌和鏈格孢菌具有很好抑菌作用[19-20]，而黃柏和金銀花正丁醇組分則對楊樹潰瘍病菌生長均有顯著抑制作用[21]。而葡萄籽提取物含豐富的多酚混合物，是一種高效天然抗氧化劑物質(zhì)[22]，如楊晶琪等[23]發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物對鴨梨黑斑病和青霉病均有抑制作用。本試驗發(fā)現(xiàn)，在PDA培養(yǎng)基內(nèi)葡萄籽提取物僅在培養(yǎng)前3 d對桃形李原菌有抑制作用，在培養(yǎng)第4天后，與對照已無明顯差異，可能隨著培養(yǎng)時間延長就無法抑制病原菌生長。這與前人發(fā)現(xiàn)土槿皮、高良姜、黃柏、丁香和蒲公英等提取物對柑桔青綠霉菌有較好抑菌效果不同[24]，因此葡萄籽提取物對桃形李的擴(kuò)展青霉菌這一菌株沒有抑制作用。當(dāng)在PDA培養(yǎng)基中加入NO生成劑硝普鈉后，也只在前4 d在對病原菌具有一定的抑制效果，而在第5天后則與對照沒有差異，本研究結(jié)果與前人發(fā)現(xiàn)硝普鈉處理能抑制火龍果采后病害的結(jié)果不一致[25]，可能由于不同的病原菌對相同藥劑的敏感性差異有關(guān)。基于本研究結(jié)果，葡萄籽提取物和硝普鈉均不適宜作為桃形李采后擴(kuò)展青霉菌的抑菌藥劑。

3.3 碳酸氫鈉和殼聚糖復(fù)合處理抑制果實病原菌生長可能作用機(jī)制

本研究發(fā)現(xiàn)，在PDA培養(yǎng)基上加入適量濃度NaHCO3能顯著抑制病原菌生長，但培養(yǎng)時間超過12 d時，菌絲部分恢復(fù)生長，說明在一定時期內(nèi)NaHCO3處理有效；經(jīng)不同NaHCO3處理采后果實，發(fā)病率也明顯低于對照，這與前人用2% NaHCO3結(jié)合酵母拮抗菌提高蟠桃采后抗病能力結(jié)果類似[26]，但使用濃度有所不同，可能是不同水果所需適宜的濃度差異有關(guān)。究其NaHCO3處理降低果實發(fā)病率的原因，一是改變培養(yǎng)基pH值所致，如唐靜等[27]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基加入NaHCO3濃度為8.0 g/L時（對應(yīng)pH值7.71），對菌絲生長抑制率達(dá)79.68%，若用NaOH溶液將培養(yǎng)基pH值提高到10.0時，抑制率反而降低為40.58%，說明NaHCO3抑制菌絲生長不僅僅是pH改變所致；另有可能是CO32-和HCO3-也能抑制菌絲生長，如采用Na2CO3調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值至10.0，對楊樹潰瘍病菌絲生長抑制率接近100.0%，所以推測Na2CO3或NaHCO3這2種藥劑對菌絲生長有抑制作用，如Na2CO3能控制Penicillium digitatum引起柑橘綠霉病和由Penicillium

italicum引起柑橘青霉病[28]，而電解碳酸氫鈉（eNaHCO3）則能抑制Penicillium digitatum的萌發(fā)和生長，并能降低柑橘采后發(fā)病率，提高采后保鮮效果[29]，這可能與青霉素合成相關(guān)基因表達(dá)受到抑制，同時抑制孢子萌發(fā)、菌絲生長及分生孢子形成有關(guān)[30-31]，因此適宜濃度NaHCO3可控制桃形李采后由擴(kuò)展青霉菌引起病害的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然0.20% NaHCO3能在培養(yǎng)基上抑制擴(kuò)展青霉菌生長，但在采后用0.20% NaHCO3處理后短期內(nèi)能降低果實腐爛率，若貯藏時間過長則腐爛率又增加，將來在使用濃度上可能還需增加一定劑量，才能更好地抑制病害發(fā)生。而經(jīng)NaHCO3和CTS復(fù)合處理能抑制桃形李采后病害發(fā)生，一方面NaHCO3能抑制病原菌生長，同時CTS涂膜后，在果實表面形成半透膜，不但能降低果實呼吸速率，防止果實過度失水和提高果實硬度。此外，CTS對病原菌有抑菌作用，能防止環(huán)境中其他有害微生物侵染，這與前人報道經(jīng)CTS處理后對不同水果的青霉菌均有抑制效果類似[9-10，32]。因此，桃形李果實經(jīng)NaHCO3和CTS復(fù)合處理后能降低果實病害提高保鮮效果，此項技術(shù)可為桃形李采后擴(kuò)展青霉菌的防治提供了新思路。

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