Th17/Treg細胞在健脾方防治克羅恩大鼠中的作用機制

吳璐一 翁志軍 季光

摘要 目的：觀察Th17/Treg細胞平衡在健脾方防治TNBS誘導的克羅恩大鼠中的作用機制；方法：24只清潔級雄性SD大鼠隨機分為：1）正常對照組NG（n=8）：從造模第2周起雙蒸水灌胃，1次/d，灌胃量按1 mL/100 g，共3周；2）TNBS模型組MG（n=8）：從第1周開始TNBS灌腸，灌腸劑量（mL）=體重（g）×0.003 mL/g，1次/周，造模持續(xù)共4周；3）模型+健脾方防治組JP（n=8）：從造模第2周開始，在TNBS灌腸后的第2天新增中藥健脾方灌胃治療，灌胃量按1 mL/100 g，1次/d，灌胃持續(xù)3周；采用ELISA、免疫組織化學、real-time PCR等技術(shù)觀察各組大鼠血液、結(jié)腸黏膜中與Th17、Treg分化和功能密切相關(guān)的IFN-γ、IL-17、RORγt、FoxP3蛋白與基因的表達差異；結(jié)果：健脾方能通過下調(diào)Th1細胞釋放的IFN-γ，進而來調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡，同時也能通過下調(diào)Th17細胞分泌IL-17、RORγt炎性反應因子的分泌和促進Treg細胞分泌的抗炎因子FoxP3來調(diào)節(jié)Th17/Treg的平衡，進而達到防治TNBS誘導的大鼠克羅恩病的作用。結(jié)論：健脾方能夠通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞平衡中多個關(guān)鍵細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子的方式，達到預防和治療TNBS誘導的大鼠克羅恩病炎性反應程度之目的。

關(guān)鍵詞 克羅恩??；健脾方；IFN-γ；IL-17；RORγt；FoxP3

Abstract Objective：To observe the mechanism of TH17/Treg cells in the prevention and treatment for trinitrobenzene sulfonic acid （TNBS）-induced rats with Crohn′s disease using a spleen-invigorating prescription （SIP）. Methods：A total of 24 SPF grade male Sprague–Dawley （SD） rats were randomly divided into 3 groups： （1） the normal rat control group （NG； n=8） received intragastrically administered double-distilled water once daily at 1 mL/100 g for 3 weeks； （2） the TNBS model group （MG； n=8） received enemas with TNBS once weekly at a dosage of body weight （g）×0.003 ml/g for 4 weeks； and （3） the TNBS model + SIP and treatment group （JP； n=8） was treated with an additional Chinese SIP 1 week after undergoing TNBS enema. The Chinese medicine was administrated intragastrically once daily for another 3 weeks at a dosage of 1 mL/100 g. Multiple techniques， including enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）， immunohistochemistry， and real-time PCR， were used to observe the differential expression of particular genes and proteins in blood and colonic mucosa of rats which belong to different groups. This study focused on genes and proteins that are highly associated with Th17 and Treg cell differentiation and function， including interferon （INF）-γ， IL-17， retinoid-related orphan nuclear receptor （ROR） γt， and FoxP3. Results：SIP effectively adjusted Th1/Th2 homeostasis by downregulating the Th1-secreted cytokines INF-γ. By downregulating Th17-secreted inflammatory factors， IL-17 as well as RORγt and suppressing the secretion of FoxP3， SIP also promoted Th17/Treg homeostasis. Then， the symptoms of TNBS-induced rat colonitis were successfully prevented and treated.Conclusion：SIP prevented and treated inflammation associated with TNBS-induced rat with Crohn′s disease by regulating multiple key cytokines and transcription factors related to Th1/Th2 and Th17/Treg cell homeostasis.

Key Words Colonitis；Spleen-invigorating；IFN-γ；IL-17；RORγt；FoxP3

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.049

T細胞介導的免疫反應在IBD組織破壞的發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用[1-2]，目前研究發(fā)現(xiàn)，幼稚CD4+T淋巴細胞可分為Th1、Th2、Th17和Treg，4個主要功能成熟的亞群，分別通過不同的轉(zhuǎn)錄途徑和特征性的細胞因子執(zhí)行不同的生物學功能[3]。如Th1細胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）等細胞因子，具有抗細胞內(nèi)細菌、病毒感染等作用[4-5]。而Th2型細胞則分泌IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子，參與介導體液免疫和變態(tài)反應[6]。Th17細胞是一類不同于Th1和Th2細胞的CD4+T細胞，Th17特異性分泌白介素17（IL-17）效應因子，IL-17A是IL-17家族的原型，其主要介導炎性反應，IL-17啟動了其下游NF-κB、p38MAPK等信號轉(zhuǎn)導途徑，通過協(xié)同及負調(diào)控等信號轉(zhuǎn)導機制影響眾多炎性因子的轉(zhuǎn)錄和表達[5]。同時維甲酸相關(guān)孤核受體γt（Retinoid-related Orphan Nuclear Receptor γt，RORγt）是Th17細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，參與自身免疫性疾病、感染和腫瘤等多種病理過程，在自身免疫性疾病和機體防御反應中具有重要的意義[7]。Treg依賴特異性轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白P3（FoxP3）以維持穩(wěn)定表達，釋放IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等細胞因子來抑制自身反應性T細胞的增殖活化，維持自身免疫耐受[8]。CD4+T細胞的亞群各自發(fā)揮不同的功能，并相互制約并且在一定的條件下可以互相轉(zhuǎn)化[9]。研究發(fā)現(xiàn)，與Th1和Th2相關(guān)的細胞因子IFN-γ和IL-4能夠抑制Th17亞群的分化，而Treg對Th1、Th2和Th17 3種效應細胞均有抑制作用[10]。同時，Treg和Th17在不同的環(huán)境下也可以相互轉(zhuǎn)化，說明了這些亞群之間存在非常復雜的關(guān)系[11-12]。

腸道初始Th細胞活化后會向不同的亞型細胞分化如Th1、Th2、Th17和Treg細胞，并各自在調(diào)控免疫反應中發(fā)揮了不同的作用。它們參與了免疫炎性反應級聯(lián)反應中抗原的識別，細胞信號通路的激活，炎性反應效應的放大，下游炎性反應因子的釋放等諸多環(huán)節(jié)。研究表明miRNA作為Th細胞分化的重要調(diào)控因素，課題組前期研究結(jié)果提示，CD患者結(jié)腸黏膜存在較多的miRNAs表達異常，參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[13-14]。因此，干預其中任何一個必要環(huán)節(jié)都可能起到緩解病情的作用[15]。中醫(yī)藥治療IBD的特點是多途徑、多層次、多靶點并且可以長期維持用藥治療[16-17]，不良反應較少。實驗研究發(fā)現(xiàn)，健脾方成分治療CD效應顯著[18-19]，且具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，但以往針對健脾方預防和治療CD的機制研究有待于逐步揭示和闡明，有必要對此進行深入探討。本實驗是以CD中Th17/Treg細胞平衡為切入點。初步揭示健脾方在預防和治療CD的可能作用機制，為推廣健脾方在臨床預防和治療CD方面的應用提供實驗的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 24只SPF級雄性SD大鼠，重（160±10） g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002]，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院實驗動物中心，所有大鼠均自由飲水（藥）、攝食，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度為（24±2）℃，濕度為（55±10）%，光照時間為12 h（8：00-20：00）。適應性飼養(yǎng)后，大鼠無不良反應、飲食飲水正常者，大鼠按體重由小到大編號，采用完全隨機法分組并納入實驗。所有實驗對動物的處理符合中國科學技術(shù)部指導建議。

1.1.2 藥物 健脾方由以下中藥（補骨脂15 g、白頭翁15 g、馬齒莧30 g、茯苓9 g、白術(shù)9 g、藿香9 g）組成，根據(jù)《中藥藥理學研究方法學》標準，將中藥加入蒸餾水中，煎煮2次，合并2次藥液，4層紗布過濾，水浴鍋95 ℃濃縮體積為555.5 mL的藥液。置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)《中藥藥理學》（全國高等中醫(yī)藥院校教材《中藥藥理學》陳長勛主編，上?？茖W技術(shù)出版社，2006年10月第1版，191頁，表22-3）用藥劑量按人鼠等效劑量灌胃，大鼠為1 mL/100 g。

1.1.3 試劑與儀器 TNBS（Sigma公司）、EnVision試劑盒（Rabbit/mouse，Dako公司）、兔抗大鼠一抗IL-17A、RoRγt、Foxp3（Sigma公司）、SYBRGreen PCR試劑盒（上海捷瑞生物工程公司）、c DNA合成試劑盒（Fermentas）、Trizol（Invitrogen）、DAB（Biobastic，Inc，美國）、PCR儀（eppendorf公司）、全自動組織脫水機SAKURA-PB-150（日本櫻花檢驗儀器株式會社）、StepOneTM plus實時熒光定量PCR（Applied Biosystems公司）、ABI-7500型Real-time檢測儀（美國應用生物儀器公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 分組 24只清潔級雄性SD大鼠隨機分為：1）正常對照組；2）TNBS模型組；3）模型+健脾方防治組。

1.2.1.2 模型制備 按照Morris[20]等方法制備CD大鼠模型，5%TNBS與50%的乙醇按2∶1比例混合而成，3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠（按體重計，0.1 mL/100 g），使其身體垂直，處于倒立位，每次灌腸劑量：灌腸液（mL）=體重（g）×0.003 mL/g，5 mL注射器連接灌腸針順大鼠直結(jié)腸生理曲度緩緩從肛門插入約6～9 cm，注入灌腸液。灌腸后將大鼠倒立體位約5 min。每周第1天灌腸1次，共4次，持續(xù)4周。

1.2.2 給藥方法 24只清潔級雄性SD大鼠隨機分為：1）正常對照組NG（n=8）：從造模第2周起雙蒸水灌胃，1次/d，灌胃量按1 mL/100 g，共3周；2）TNBS模型組MG（n=8）：從第1周開始TNBS灌腸，灌腸劑量（mL）=體重（g）×0.003 mL/g，1次/周，造模持續(xù)共4周；3）模型+健脾方防治組JP（n=8）：從造模第2周開始，在TNBS灌腸后的第2天新增中藥健脾方灌胃治療，灌胃量按1 mL/100 g，1次/d，灌胃持續(xù)3周。

1.2.3 檢測指標與方法 以3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠（按體重計，0.1 mL/100 g），腹主動脈取血，靜置約0.5 h后離心分離血清，-80 ℃冰箱保存用于ELISA檢測。截取距離肛門6～9 cm處病變明顯結(jié)腸，沿腸系膜縱行剖開，用預冷的4 ℃生理鹽水沖洗后，肉眼觀察并記錄黏膜損傷情況。每只大鼠結(jié)腸標本分3份，其中2份液氮保存用于Real-time PCR檢測。另一份用10%的中性緩沖甲醛溶液固定，石蠟包埋組織，切片厚度為4 μm，用于Masson染色和免疫組化實驗檢測。所有實驗對動物的處理符合中國科學技術(shù)部指導建議。

1.2.3.1 結(jié)腸組織病理觀察（HE染色） 切片常規(guī)脫蠟至水、蘇木素核染、鹽酸酒精分化、伊紅胞質(zhì)染色、梯度酒精脫水及二甲苯透明，中性樹膠封片干燥后經(jīng)Olympus-BX53顯微鏡進行圖像采集（×400）。

ELISA技術(shù)檢測健脾方對克羅恩病大鼠血清INF-γ表達的影響：本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中大鼠IFN-γ（Sigma，USA）水平。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠大鼠IFN-γ濃度。

1.2.3.2 Real-time PCR法檢測 大鼠結(jié)腸組織L-17A、FoxP3 mRNA：組織總RNA的抽提，組織勻漿，采用Trizol法提取總RNA，檢測濃度、純度、完整性。取相等量的總RNA，采用SYBRGreen PCR試劑盒（上海捷瑞生物工程公司）逆轉(zhuǎn)錄cDNA，用于Real-time qPCR.Real-time PCR所用引物序列。見表1。

1.2.3.3 免疫組化檢測大鼠結(jié)腸組織IL-17A、RORγt、FoxP3蛋白水平 切片0.3%H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶20 min；20%正常羊血清室溫孵育30 min；滴加一抗在37 ℃下孵育2 h，IL-17A、RORγt、FoxP3一抗（sigma，USA）；EnVision試劑（HRP/R）加入后保留30 min；DAB顯色1～2 min；蘇木素襯染色，樹脂封片；采用Olympus-BX53顯微鏡進行圖像采集（×400），數(shù)據(jù)分析采用Image-Pro PLUS軟件。

1.3 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。對數(shù)據(jù)作正態(tài)分布檢驗。數(shù)據(jù)若符合正態(tài)分布，組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊時采用最小顯著差法（Least significant difference，LSD）比較組間差異性，方差不齊時用Games-Howell比較組間差異性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠結(jié)腸組織病理HE染色 大鼠結(jié)腸HE染色結(jié)果如圖1所示。正常組大鼠結(jié)腸組織肉眼觀察結(jié)腸腸管粗細均勻，結(jié)腸壁厚薄一致，柔軟有彈性，腸黏膜面光滑整齊，黏膜皺襞完整，無出血點、糜爛及潰瘍。HE染色鏡下顯示結(jié)腸黏膜上皮無缺損，腺體排列整齊，黏膜及黏膜下層無充血、水腫、炎性細胞浸潤等異常改變，結(jié)構(gòu)完好。模型組：大鼠結(jié)腸黏膜上皮細胞壞死、脫落，腸壁全層大量炎性反應細胞浸潤，肉芽腫形成，纖維組織增生。健脾方組：清熱健脾方干預后，HE染色鏡下顯示結(jié)腸黏膜腺體排列較整齊，上皮修復中，黏膜下有少量水腫與炎性細胞。顯示清熱健脾方可有效改善克羅恩病大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)，減輕結(jié)腸組織損傷，具有良好的修復大鼠克羅恩病受損結(jié)腸組織的作用。

2.2 CD大鼠血清INF-γ濃度 我們選擇檢測與Th1細胞功能和分化密切相關(guān)的細胞因子IFN-γ來觀察健脾方對TNBS誘導的CD大鼠結(jié)腸炎性反應預防和治療作用，用ELISA檢測大鼠血清INF-γ濃度的變化，結(jié)果如下圖2。TNBS誘導的CD大鼠血清中INF-γ的濃度為（519.3±9.8）ng/mL，比正常組（395.2±85.2）ng/mL升高，健脾方能夠抑制TNBS誘導炎性反應過程中血清中INF-γ的升高的程度（458.9±10.6）ng/mL。

2.3 CD大鼠結(jié)腸組織Th17/Treg細胞調(diào)節(jié)因子IL-17A、FoxP3 mRNA的表達 采用Real-time PCR法觀察TNBS誘導的CD大鼠結(jié)腸組織中Th17/Treg細胞調(diào)節(jié)因子IL-17A、FoxP3 mRNA表達的變化，從基因?qū)用孀C實Th17/Treg細胞平衡紊亂在TNBS誘導CD病理機制中的作用，并揭示Th17/Treg細胞平衡在健脾方對CD結(jié)腸炎性反應形成初期防治中的作用機制。實驗結(jié)果如圖3，圖A為各組大鼠結(jié)腸組織IL-17A mRNA表達，正常組IL-17A mRNA為（0.206 7±0.270 6），模型組（1.025±0.235 4），高于正常組（P<0.01），健脾方能夠抑制CD大鼠結(jié)腸炎性反應形成初期這種增高的趨勢，為（0.274±0.139 8）（P<0.01）。圖B為各組大鼠結(jié)腸組織FoxP3 mRNA表達，正常組FoxP3 mRNA為（2.241±0.185），模型組（1.006±0.121 6），表達低于正常組（P<0.01），健脾方組能夠上調(diào)FoxP3 mRNA表達，為（1.334±0.456 4）（P<0.01）。

2.4 CD大鼠結(jié)腸組織Th17/Treg細胞調(diào)節(jié)因子IL-17A、RORγt、FoxP3蛋白的表達 基于上述Th17/Treg細胞調(diào)節(jié)因子IL-17A、FoxP3 mRNA在TNBS誘導的CD大鼠結(jié)腸組織表達的變化，以及健脾方在炎性反應初期能夠起到對各個因子的基因發(fā)生調(diào)節(jié)作用的實驗結(jié)果，繼續(xù)觀察相應調(diào)節(jié)IL-17A、RORγt、FoxP3蛋白在CD大鼠結(jié)腸組織中表達變化情況及健脾方對這些細胞調(diào)節(jié)因子的影響，采用免疫組織化學法來觀察3個蛋白的表達結(jié)果如下：（圖4 A-L，×400倍圖像采集）。IL-17A主要表達于大鼠結(jié)腸黏膜上皮細胞和結(jié)腸黏膜上皮間質(zhì)非上皮細胞。正常組結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整、腺體排列規(guī)則有序，腸黏膜IL-17A呈弱陽性表達（10.69±5.16），如圖4，A。模型組結(jié)腸黏膜上皮有脫落，炎性反應細胞顯著增生，腸黏膜IL-17A表達高于正常組（23.26±9.91）（P<0.01），如圖4，B。健脾方對結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)較紊亂和炎性反應細胞增生具有防治作用，腸黏膜IL-17A呈中度-陽性表達（14.83±5.94）（P<0.01），如圖4，C。組間比較結(jié)果見圖D。RORγt主要表達于大鼠結(jié)腸黏膜上皮細胞。正常組結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，腸黏膜RORγt呈弱陽性表達（6.62±1.39），如圖4，E。模型組結(jié)腸黏膜上皮大量脫落，腺體結(jié)構(gòu)紊亂，腸黏膜RORγt呈強陽性表達（16.34±5.69）（P<0.01），如圖4，F(xiàn)。健脾方能夠在CD克羅恩病癥形成期間，改善結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)較紊亂和炎性反應細胞增生的程度，腸黏膜RORγt呈中度-陽性表達（15.35±3.11）（P<0.05），如圖4，G。組間比較結(jié)果見圖H。FoxP3主要表達于大鼠結(jié)腸黏膜上皮細胞和結(jié)腸黏膜間質(zhì)非上皮細胞。正常組結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，腸黏膜FoxP3呈強陽性表達（32.92±15.53）如圖4，I。模型組結(jié)腸黏膜上皮有脫落，結(jié)構(gòu)紊亂，腸黏膜FoxP3呈弱陽性表達（10.54±5.40）（P<0.01），如圖4，J。健脾方防治組結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)較整齊，腸黏膜呈弱陽性表達（14.83±3.39）（P<0.05），如圖4，K。組間比較結(jié)果見圖L。

3 討論

目前，臨床常用的治療CD的藥物主要有氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、炎性遞質(zhì)抑制劑、靶向生物免疫治療、抗生素[21]等。中醫(yī)藥治療CD的特點是多途徑、多層次、多靶點并且可以長期維持用藥治療，不良反應較少[16-17]。實驗研究發(fā)現(xiàn)健脾方中的中藥組份治療IBD療效肯定且具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[18-19]，但健脾方治療IBD的相關(guān)免疫機制研究很少，因此，有必要對此進行深入探討。在我們的研究中，證實了健脾方能夠抑制CD結(jié)腸炎性反應形成初期的炎性反應程度，模型制作過程中應用健脾方能夠起到很好的防治作用。本研究以CD4+T細胞亞群為突破點，研究Th17/Treg平衡在健脾方防治CD中的作用，探討健脾方治療CD的免疫機制。

3.1 Th1/Th2失衡與健脾方防治IBD Th1和Th2都參與了免疫炎性反應級聯(lián)反應中抗原的識別、細胞信號通路的激活、炎性反應效應的放大以及下游炎性因子的釋放等諸多環(huán)節(jié)，干預其中任何一個必要環(huán)節(jié)都可能起到緩解病情的作用[22]，因此，對Th1和Th2平衡的干預，成為IBD研究的熱點和治療的思路?；谶@種思路，我們設(shè)計此實驗初步探索健脾方治療CD的作用機制。Th1細胞主要分泌IL-2、IL-12、IFN-γ等細胞因子，IL-12和IFN-γ還能通過促進Th1分化和抑制Th2分化使Th1細胞處于優(yōu)勢。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子，其中IL-4和IL-13能夠通過促進Th2分化和抑制Th1分化使Th2細胞占優(yōu)勢[23]，Neunath等研究認為TNBS誘導的CD大鼠是呈現(xiàn)Th1細胞優(yōu)勢狀態(tài)而Th2細胞應答相對降低的克羅恩病癥[24-25]，因此，通過抑制Th1的優(yōu)勢狀態(tài)來調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡狀態(tài)能降低其炎性反應并使病情得到緩解。我們的實驗結(jié)果表明，在CD大鼠模型中，血清中Th1細胞因子IFN-γ含量升高，與正常對照組比較具有顯著性差異，表現(xiàn)出了炎性反應過程中Th1細胞處于優(yōu)勢的狀態(tài)，同時，增加的IFN-γ也可能進一步促進了這一優(yōu)勢狀態(tài)，對CD大鼠施加健脾方干預，血清中的IFN-γ含量有所降低，使IFN-γ的促炎失衡的狀態(tài)有所緩解。

3.2 Th17/Treg失衡與健脾方防治IBD 目前，恢復體內(nèi)的Th17/Treg平衡對動物實驗和IBD患者的療效均已得到不斷的驗證[26-30]。多種療法進一步的研究證實，ThI7/Treg轉(zhuǎn)化平衡是維持腸道免疫穩(wěn)態(tài)的重要因素，這可能成為人類導致IBD的原因之一[31]。除Th17細胞外，多種T細胞亞群均可分泌IL-17A[32]，臨床研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸黏膜組織和外周血中IL-17含量明顯升高[33]。在我們的CD大鼠結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)了IL-17A基因和蛋白都出現(xiàn)表達的上調(diào)，結(jié)腸組織HE染色也發(fā)現(xiàn)也出現(xiàn)大量的炎性細胞因子浸潤，應用健脾方干預后，能夠?qū)L-17A起到下調(diào)的作用。表明健脾方在緩解IL-17A相關(guān)炎性反應方面起到了積極的調(diào)節(jié)作用。RORγt是Th17分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)得到業(yè)界的認可[34-35]。實驗發(fā)現(xiàn)，CD大鼠的結(jié)腸組織中RORγt蛋白表達上調(diào)，從模型制作的第2周開始進行健脾方的干預，能夠下調(diào)RORγt，進而抑制T細胞向Th17細胞方向分化這個趨勢，所以可以推斷健脾方在防治CD過程中涉及可能涉及了Th17細胞分化的重要的細胞因子和轉(zhuǎn)錄因子，而且在恢復Th17/Treg細胞平衡方面發(fā)揮了積極的調(diào)節(jié)作用。

FoxP3是Treg亞群分化的特異性核轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控其分化發(fā)育和功能上起很重要的作用，F(xiàn)oxP3的缺乏導致CD4+、CD25+Treg細胞的缺失[36]。健脾方在CD結(jié)腸組織炎性反應初期的及早干預是否能夠抑制FoxP3的降低？我們的實驗中發(fā)現(xiàn)，大鼠結(jié)腸黏膜FoxP3 mRNA及其蛋白在經(jīng)過TNBS刺激后都出現(xiàn)了下調(diào)，病理損傷可能和FoxP3的下調(diào)有關(guān)，健脾方灌胃3周后，對FoxP3基因和蛋白具有正向調(diào)節(jié)作用，出現(xiàn)的結(jié)腸組織病理損傷的程度減輕可能與健脾方干預調(diào)節(jié)有關(guān)，可上調(diào)FoxP3的表達，抑制RORγt的產(chǎn)生，從而抑制初始CD4+T細胞分

化為Th17細胞[37-38]，表明RORγt/FoxP3平衡決定了初始CD4+T細胞受抗原刺激后向Th17細胞或Treg方向分化。

綜上所述，Th17/Treg相互轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制研究深化了對IBD免疫機制的認識，并且可能為治療IBD的研究提供新的策略。通過對細胞因子IL-17、轉(zhuǎn)錄因子F0XP3、RORγt的影響，健脾方能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2和Th17/Treg的平衡而恢復腸道免疫失衡狀態(tài)，這可能是健脾方防治IBD的免疫調(diào)節(jié)機制之一。

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（2017-05-03收稿 責任編輯：王明）