響應面法優(yōu)化多花勾兒茶果實多酚提取工藝及其抗氧化活性研究

姚姝鳳 成江 劉小攀 唐克華 董愛文

摘要[目的]優(yōu)化多花勾兒茶果實中多酚提取工藝，并以葉多酚為對照，考察其果實多酚體外抗氧化能力。[方法]運用Box-Behnken Design響應面法優(yōu)化多花勾兒茶果實提取工藝，并通過測定其總抗氧化能力，清除DPPH·自由基、清除羥基自由基及超氧陰離子自由基清除率考察其抗氧化能力。[結果]最優(yōu)條件：乙醇體積分數(shù)51.66% 、料液比1〖DK〗∶35、提取時間2.5 h，該條件下多花勾兒茶果實多酚的得率為5.684 0 mg/g。同條件下提取多花勾兒茶果實及葉的多酚，且均具有較強抗氧化能力。[結論]多花勾兒茶果實多酚具有一定清除自由基能力，開發(fā)前景廣闊。

關鍵詞多花勾兒茶；多酚；響應面優(yōu)化法；抗氧化

中圖分類號R284文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0124-05

Abstract[Objective] The extraction conditions of total polyphenols from the fruits of Berchemia floribunda were optimized and the antioxidants activities were investigated with the leaves as comparison. [Method] The optimal conditions to achieve the maximum yield of polyphenols were determined by the BoxBehnken design response surface methodology and the antioxidant activities of the total polyphenols were evaluated in vitro by scavenging capabilities of DPPH radical， hydroxyl radical and superoxide radical and total antioxidant capacity. [Result] Under the optimized conditions： ethanol volume fraction 51.66%， solidliquid ratio 1〖DK〗∶35 and extraction time 2.5 h， the experimental total polyphenols from fruits were 5.684 0 mg/g. And the polyphenols from fruits and leaves under the same extraction conditions both have high antioxidant activities. [Conclusion] Total polyphenols from the fruits of B. floribunda have a certain free radical scavenging capacity with broad prospects for development.

Key wordsBerchemia floribunda；Polyphenol；Response surface methodology；Antioxidant

基金項目張家界市科技局科技計劃項目（2015FJ1149）；吉首大學校級科研項目（15JDY018）。

作者簡介姚姝鳳（1991—），女，山西大同人，碩士研究生，研究方向：林產化學加工工程。*通訊作者，研究員，碩士生導師，從事資源植物開發(fā)與利用研究。

收稿日期2016-12-23

多花勾兒茶（Berchemia floribunda）系鼠李科勾兒茶屬植物[1]，在湖南省分布廣泛，野生資源豐富，大多分布于海拔 1 200 m以下灌叢、山路旁、林緣等地，具有較大開發(fā)利用價值[2]。該屬植物為民間傳統(tǒng)藥用與茶用植物，其根、莖可入藥，嫩葉可代茶。目前，已從該屬植物中得到黃酮類、苷類等多種具有生物活性的成分[3]。多花勾兒茶具有止咳平喘、抑菌、保肝、抗腫瘤等多重功效[4]，具有很高的研究與應用價值。多酚具有很好的清除自由基能力，特別是其中的活性成分原花青素已為癌癥、炎癥、衰老等的防治提供了新的理論與方法，成為國內外的研究熱點[5]。目前已有蘋果多酚[6]、石榴多酚[7]、野櫻桃多酚[8]、葡萄多酚[9]等的研究報道。茶多酚為良好的抗氧化劑，具有抗癌、抗衰老、抗輻射、降血脂等多重功效[10-11]，成為茶葉與茶飲料等保健品開發(fā)的重要指標。多花勾兒茶在民間主要以嫩葉做茶用，被譽為“觀音茶”，其果實則很少被利用，處于自生自滅狀態(tài)。筆者對多花勾兒茶果實多酚的提取方法進行了優(yōu)化，并考察其體外抗氧化能力[12-13]，同時與葉中多酚含量及抗氧化能力進行比較，旨在為多花勾兒茶的進一步綜合開發(fā)與利用提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

材料：試驗用多花勾兒茶果實及嫩葉采自張家界市永定區(qū)天門山后的崇山。提取前將多花勾兒茶果實和葉于50 ℃烘干，粉碎過30目篩，密封備用。

標準品：沒食子酸標準對照品（89.9%），中國食品藥品檢定研究院（ID：ECS9-AJWK）。

試劑：1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·），上海伊卡生物科技有限公司；無水乙醇、鎢酸鈉、磷鉬酸、濃磷酸、碳酸鈉、氯化鈉、L-抗壞血酸（Vc）、三羥甲基氨基甲烷、焦性沒食子酸、硫酸鈷等化學試劑均為國產分析純。

儀器設備：

AEG-220電子分析天平（日本）SHIMADZU，HH-6恒溫水浴鍋（富華儀器），KQ-250E超聲波清洗器，GZX-9146 MBE 型數(shù)顯鼓風干燥箱，PE-52AA旋轉蒸發(fā)器，U-3900紫外分光光度計（日本）HITACHI。

1.2試驗方法

1.2.1檢測方法[14]及標準曲線繪制。

配制 0.1 mg/mL沒食子酸標準溶液。用該標準溶液配成10、20、30、40、50、60、80 μg/mL的沒食子酸溶液。Folin-Denis（FD）試劑配制及顯色方法，具體步驟如下：分別吸取1.0 mL沒食子酸溶液于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL FD試劑，搖勻，再加入Na2CO3 2.0 mL，加蒸餾水定容至刻度線，室溫放置1 h，以蒸餾水為對照，測定A760 nm值。以標準溶液濃度為橫坐標，A760 nm值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2單因素試驗。

選擇乙醇-水溶液作為提取溶劑，準確稱取多花勾兒茶果實1.000 g（平行3份），固定提取溫度60 ℃，提取時間1.5 h，液料比1〖DK〗∶20，考察不同乙醇體積分數(shù)0、10%、30%、50%、70%、90%對多花勾兒茶果實多酚提取率的影響。固定乙醇體積分數(shù)50%，提取溫度60 ℃，提取時間1.5 h，考察不同料液比1〖DK〗∶10、1〖DK〗∶15、1〖DK〗∶20、1〖DK〗∶25、1〖DK〗∶30、1〖DK〗∶35對多酚提取率的影響。固定乙醇體積分數(shù)50%，提取溫度60 ℃，料液比1〖DK〗∶25，考察不同水浴提取時間0.5、1.0、1.5、20、2.5、3.0 h對多酚提取率的影響。固定乙醇體積分數(shù)50%，提取時間1.5 h，液料比1〖DK〗∶25，考察不同水浴提取溫度：室溫、40、50、60、70、80 ℃對多酚提取率的影響。水浴提取前室溫下超聲處理 20 min，提取過濾后的濾液稀釋10倍，按“1.2.1”的方法顯色，測定吸光值，考察最優(yōu)條件。

1.2.3響應面優(yōu)化試驗。

依據(jù)單因素試驗結果，選擇乙醇體積分數(shù)、料液比和提取時間為優(yōu)化因素，多酚得率為響應值，使用軟件Design-expert 8.0.6采用BOX-Benhnken設計進行響應面優(yōu)化試驗，并建立二次回歸模型。響應面優(yōu)化試驗的因素水平編碼設計[15]見表1。

1.2.4粗多酚的制備與含量的測定。

分別以多花勾兒茶果實、葉為原料，按響應面優(yōu)化試驗預測的最優(yōu)條件進行提取，獲得的多酚粗提液經旋轉蒸發(fā)脫去乙醇，得到濃縮液，稀釋后測定粗多酚含量。

粗多酚含量=C·V /m × 100%

式中，C為比色管中總多酚的濃度（μg/mL）；V為按測定濃度稀釋后的體積；m為果實、葉子粉質量。

1.2.5體外抗氧化能力的測定[16]。

1.2.5.1總抗氧化能力。采用普魯士蘭法測定多花勾兒茶果實和葉粗多酚不同濃度試樣吸光度，并以VC作為陽性對照，每個濃度梯度設3個平行。吸光度越高，表示抗氧化性越好。

1.2.5.2清除DPPH·自由基能力[17]。

用95%乙醇配制質量濃度為2.0×10-2 mg/mL的DPPH·標準溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），

測定多花勾兒茶果實及葉粗多酚清除DPPH·自由基能力，VC作為陽性對照。按下式計算DPPH·清除率（y）：

式中，Ac為3 mL DPPH溶液 + 3 mL 蒸餾水的吸光度；As為3 mL DPPH 溶液+3 mL 樣品液的吸光度；Ai為3 mL樣液+3 mL 95%乙醇的吸光度。

安徽農業(yè)科學2017年〖SM）〗〖SM（W〗〖SM）〗

1.2.5.3清除羥基自由基能力[18]。

采用亞硝基R鹽-Co3+ 褪色法測定多花勾兒茶果實及葉多酚清除羥基自由基能力，取潔凈試管，依次加入下列溶液：2 mL pH 9.2 緩沖溶液，1 mL 0.50 mmol/L CoSO4 溶液，1 mL 1.56 mmol/L亞硝基 R 鹽（以下簡稱 Nit-R）溶液，1 mL體積分數(shù)0.1% H2O2溶液，蒸餾水稀釋至10 mL，搖勻，37 ℃恒溫水浴反應 45 min，在波長412 nm 測定吸光度 Ab，同時測定不加 H2O2的體系的吸光度 A0。表觀羥自由基產生量可用ΔA=A0-Ab表示。在體系中加 H2O2之前加入一定量的抗氧劑樣品，測量其吸光度 As，同時測定以水代替過氧化氫的吸光值AS0，則表觀羥自由基清除率：

1.2.5.4清除超氧陰離子自由基能力[19]。

采用鄰苯三酚自氧化法測定多花勾兒茶果實及葉多酚清除超氧陰離子自由基能力。抗氧化體系：pH 7.3的Tris-HCl 緩沖液6.0 mL，抗氧化樣品0.5 mL（37 ℃水浴10 min），25 mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液（PR）1 mL（提前37 ℃下預熱）?；靹?，反應4 min后，用0.5 mL濃鹽酸終止反應，在320 nm處測定吸光度Ai，同時測定不加PR，以10 mol/L鹽酸，測定樣品本底吸光值Aj。以等體積pH為7.3的Tris-HCI 緩沖液作為空白吸光度（A0）。

2結果與分析

2.1標準曲線繪制

以沒食子酸為標準品，采用Folin-Denis比色法760 nm下測定，繪制標準曲線（圖1）。回歸方程為y=0.008 5x+0.003 5（r=0.999 3），說明在0～80 μg/mL線性關系良好。

2.2單因素試驗

2.2.1乙醇體積分數(shù)對多花勾兒茶果實多酚得率的影響。

從圖2可見，乙醇體積分數(shù)在50%～70%時，多花勾兒茶果實多酚得率較高，但乙醇體積分數(shù)超過70%，得率反而下降。這是由于多酚本身的酚羥基結構使極性相對較大，乙醇比例過高影響了多酚的浸出。因此，以50%乙醇作為提取溶劑。

2.2.2料液比對多花勾兒茶果實多酚得率的影響。

從圖3可見，在料液比為1〖DK〗∶30時，多花勾兒茶果實多酚浸出量基本達到飽和，液料比過低，多酚提取不充分，液料比過高，不僅增加成本，而且濃縮時間過長多酚易被氧化[20]。綜合考慮多酚得率、溶劑成本等因素，確定料液比為1∶30。

2.2.3水浴時間對多花勾兒茶果實多酚得率的影響。

從圖4可見，提取時間為2.0 h時多花勾兒茶果實多酚得率達到最大，達到飽和。超過2.0 h，得率反而下降。這可能是由于提取時間延長，使多酚發(fā)生了不同程度的分解。因此，確定提取時間為2.0 h。

2.2.4水浴溫度對多花勾兒茶果實多酚得率的影響。

從圖5可見，提取溫度在60 ℃時多花勾兒茶果實多酚得率最大，溫度繼續(xù)升高，得率反而下降。這可能是由于多酚在高溫下發(fā)生不同程度的分解和異構化[21]，且高溫使多酚抗氧化活性降低[22]，浸出更多的雜質。因此，以60 ℃作為多酚提取的最佳溫度，這與前人[23-25]研究結果一致。

2.3響應面優(yōu)化試驗結果響應面設計及結果見表2，對試驗結果進行多元線性回歸分析，擬合得到的多花勾兒茶果實多酚提取的數(shù)學模型：

式中，Y為多酚得率（mg/g），A為乙醇濃度（%），B為料液比，C為水浴時間（h）。

對回歸方程進行方差分析，得到模型的P<0000 1，且失擬項P>0.05，表明數(shù)學模型擬合良好[26]。模型的調整確定系數(shù)R2Adj=0.980 2，相關系數(shù)R2=0.991 4，說明實際值與預測值具有較好的擬合相關性，該模型可以用來預測已知變量范圍內的多酚得率[ 27-28]。

方程的總模型、液固比（B）（P<0.000 1）、提取時間（C）（P=0.004 9）、二次項乙醇濃度、液料比與乙醇濃度的交互作用（AB）（P=0.000 2）對多酚得率的影響極顯著；而乙醇體積分數(shù)（A）對試驗結果影響不顯著。在所選取的各因素中，對結果的影響從大到小依次為液料比、提取時間、乙體積分數(shù)。

從圖6可見，液料比和乙醇體積分數(shù)交互作用較大地影響響應拋物曲線位置，說明乙醇體積分數(shù)和液料比2個因素存在著較強的交互作用；而乙醇體積分數(shù)和提取時間存在的交互作用較弱；不同的提取時間和液料比幾乎無交互作用。

通過Design-Expert軟件分析，得出多花勾兒茶果實多酚提取理論最佳工藝條件：乙醇體積分數(shù)51.66 %、提取時間2.5 h、料液比1〖DK〗∶35。在該條件下多花勾兒茶果實多酚平均得率為5.684 0 mg/g，RSD為1.324，與預測粗提取率5676 5 mg/g吻合良好，說明該方程與實際情況擬合性良好。

2.4抗氧化能力

2.4.1總抗氧化能力。

從圖7可見，總多酚濃度為5～400 μg/mL時，多花勾兒茶葉多酚與VC總抗氧化能力相差不大，而多花勾兒茶果實多酚總抗氧化能力較低。

2.4.2清除DPPH·自由基能力。

從圖8可見，多花勾兒茶果實多酚清除自由基的能力與VC相差不大，葉中總多酚清除DPPH·自由基的能力均強于果實中多酚。

2.4.3清除超氧陰離子自由基。

從圖9可見，總多酚濃度為5～400 μg/mL時，多花勾兒茶葉和果實多酚對超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力，但清除能力與VC比較低，其果實多酚清除能力強于葉多酚。

2.4.4清除羥自由基能力。

趙艷紅等[16]研究表明，采用亞硝基R鹽-Co3+ 褪色法測定精密度與重現(xiàn)性良好。從圖10可見，總多酚濃度為1～30 μg/mL時，多花勾兒茶葉和果實多酚對羥自由基均具有較強的清除能力，且與VC相差不大；總多酚含量高于40 μg/mL時，果實多酚提取物清除羥自由基能力高于VC。

3結論與討論

（1）該研究以多花勾兒茶果實為原料，采用 Folin-Denis法測定其多酚含量，在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken法優(yōu)化提取工藝條件，建立了多花勾兒茶果實多酚提取的二次回歸模型，且模型擬合良好。預測最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)51.66 %、料液比1〖DK〗∶35、提取時間2.5 h（提取溫度為60 ℃）。用所選提取條件提取多花勾兒茶果實、葉多酚，測定多酚得率分別為5.684 0、52.707 0 mg/g。體外抗氧化能力結果表明，多花勾兒茶果實和葉多酚均具有較好的體外抗氧化功效，對超氧陰離子自由基清除中，果實多酚顯示出比葉多酚更強的清除能力。

（2）多花勾兒茶果實多酚含量雖小于葉，多酚但果實多酚和葉多酚一樣，也具有較強的抗氧化能力，且對于超氧陰離子自由基表現(xiàn)出比葉多酚更強的清除能力。民間多用嫩葉做茶，而果實未被開發(fā)利用，造成資源浪費，該研究結果表明，果實和葉多酚對不同自由基清除能力不同。因此，就茶的開發(fā)而言，果實和葉的復合茶可能會有更好的功效，這有待于進一步研究。

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