銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠的急性毒性評價

王未名 裘紀瑩 劉孝永 辛雪 孫華 陳蕾蕾 張翔 王易芬 陳相艷

摘要[目的]評價銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的食用安全性。[方法]選擇健康小鼠進行急性毒性試驗，開展了大劑量預試驗及小鼠最大給藥量試驗，并測定了該劑量下的小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)。[結果]大劑量預試驗小鼠均未死亡，未有異常反應，不能測出LD50。最大給藥量試驗顯示，小鼠灌胃給藥后除銀杏花粉組1只小鼠意外死亡外，其他小鼠均未發(fā)生死亡或中毒癥狀，活動、臟器等均未見異常。銀杏花粉和銀杏花粉發(fā)酵飲料的最大給藥量分別為21.1 g/kg體重和80.0 mL/kg體重，此最大給藥量遠高于可能攝入的最高劑量；同時在此劑量下銀杏花粉及其發(fā)酵飲料能夠增加雄性小鼠的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)。[結論]銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠沒有急性毒性作用，并且提示對雄性小鼠可能具有一定的免疫增強作用。

關鍵詞銀杏花粉；小鼠；急性毒性；最大給藥量

中圖分類號TS201.6文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）05-0077-02

Abstract[Objective] To evaluate the edible safety of ginkgo pollen and its fermentation beverage. [Method] Healthy mice were chosen for acute toxicity test. Highdose pilot study and maximum dose experiment were carried out， as well as determination of the thymus and spleen coefficients of the mice in this dose. [Result] The mice in the highdose pilot study were all alive， no abnormal reaction， and the LD50 could not be measured. The maximum dose experiment showed that except the accidental death of one mouse， no other death or poisoning symptoms occur， and the activities and organs were all normal. The maximum dose of ginkgo pollen and its fermentation beverage were 21.1 g/kg and 80.0 mL/kg， respectively. These dose were much higher than those could be ingested， and the thymus and spleen coefficients of the mice in this dose were increased. [Conclusion] There are no acute toxic effects of ginkgo pollen and its fermentation beverage on mice， and prompting that they might have some immune enhancement effects on male mice.

Key wordsGinkgo pollen；Mice；Acute toxicity；Maximum administration dosage

基金項目山東省自然科學基金三院聯(lián)合基金項目（ZR2014YL020，ZR2016YL022）；國家科技支撐計劃（2015BAD16B02）；山東省農(nóng)業(yè)科學院青年科研基金項目（2014QNM47）；泰山學者專項工程項目；山東省農(nóng)業(yè)科學院青年英才培養(yǎng)計劃。

作者簡介王未名（1957—），男，山東濟南人，研究員，從事植物保護與農(nóng)產(chǎn)品加工研究。*通訊作者，研究員，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。

收稿日期2016-12-09

銀杏花粉是銀杏雄株的花粉，營養(yǎng)豐富并且富含黃酮、萜內(nèi)酯等活性組分。研究顯示，銀杏花粉24種游離氨基酸總量達62.316 mg/g，鉀離子含量達26.301 mg/g[1]，黃酮類化合物總量約為20.44 mg/g[2]，其中蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-（4→1）-β-L-吡喃鼠李糖苷和山柰酚含量分別為120.90、114.00和222.10 μg/g[3]，具有廣闊的開發(fā)利用價值。目前在銀杏花粉的開發(fā)利用方面有部分報道，如孫謹先[4]報道了一種銀杏花粉膠囊及其制備方法，曹福亮等[5]開展了銀杏花粉食品的加工工藝研究，裘紀瑩等[6]以銀杏花粉為原料研究開發(fā)了銀杏花粉發(fā)酵飲料，但銀杏花粉原料以及報道產(chǎn)品的安全性研究尚少見報道，這大大限制了銀杏花粉在普通食品及功能性食品領域的應用。因此，筆者開展了銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠的急性毒性研究，旨在為銀杏花粉的食用安全性提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

銀杏花粉供試品。銀杏花粉采自山東省郯城縣，干燥過100目篩，供試品采用蒸餾水配制成264 mg/mL的混懸液。

1.1.2

銀杏花粉發(fā)酵飲料供試品。由山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術重點實驗室自行研制，該發(fā)酵飲料的銀杏花粉含量為50 mg/mL，乳酸菌活菌量為109 CFU/mL。

1.1.3

試驗動物。SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，年齡在3～4個月，體重18～22 g。供試鼠及飼料均由山東大學實驗動物中心提供。飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，自由進水、進食。鼠籠墊料及飲水壺每2 d更換并進行清洗，以保持清潔。

1.2方法

1.2.1大劑量預試驗。取禁食（正常飲水）18 h的小鼠20只，隨機分為銀杏花粉組和銀杏花粉發(fā)酵飲料組，每組雌雄各半。采用口服灌胃法，每組劑量為0.04 mL/g體重[7]，記錄試驗動物反應情況。

1.2.2最大給藥量試驗[8]。取小鼠60只，禁食12 h（不禁水），隨機分為銀杏花粉、銀杏花粉發(fā)酵飲料、空白對照組3組，每組20只，雌雄各半。2個給藥組按0.04 mL/g體重給小鼠灌胃相應藥液，2次/d；空白對照組給予小鼠同等體積的蒸餾水灌胃。計算1 d內(nèi)的給藥量，進行急性毒性試驗觀察，連續(xù)觀察14 d。期間每天觀察并記錄小鼠的飲食、活動、大小便及有無死亡等情況。觀察期結束，將小鼠脫臼處死解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸等臟器的改變情況；并取小鼠胸腺、脾臟，電子天平稱重，計算胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)，進行統(tǒng)計分析。

1.2.3數(shù)據(jù)分析方法。文中數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0軟件進行顯著性分析。

2結果與分析

2.1大劑量預試驗

試驗得出，給藥后銀杏花粉組和銀杏花粉發(fā)酵飲料組的小鼠均活動自如，未發(fā)現(xiàn)明顯異常反應，且無一死亡，說明銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的安全性高，同時不能測出急性毒性的LD50值，故按預試驗的2倍劑量進行小鼠最大給藥量試驗。

2.2最大給藥量試驗結果

小鼠給藥劑量及觀察14 d的體重及死亡情況如表1所示。給藥后小鼠活動自如，未發(fā)現(xiàn)明顯異常反應，銀杏花粉組給藥后1只小鼠體重逐漸減輕，第5天死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)小鼠肺部明顯充血，其他臟器未見明顯異常，灌胃操作時發(fā)現(xiàn)銀杏花粉組藥液濃度過高，并且銀杏花粉不溶于水，灌胃時操作難度較大，需反復灌胃。所以該小鼠死亡的原因可能為反復操作引起了肺炎反應，應判定為意外死亡。其余小鼠全部存活，活動自如，毛發(fā)光滑，飲食正常，呼吸道、眼及口腔等處無異常分泌物，未發(fā)現(xiàn)任何中毒癥狀，體重均有增加。與空白對照組比較，銀杏花粉發(fā)酵飲料組的雄性小鼠體重極顯著增加（P<0.001）。14 d觀察期結束，將小鼠脫臼處死解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸等臟器，均未見明顯異常表現(xiàn)。

如上所述，在該1 d給藥劑量下，除銀杏花粉組1只小鼠意外死亡外，其他小鼠在觀察期內(nèi)均未發(fā)生死亡或中毒癥狀，活動、臟器等均未見異常。故試驗采用的1 d給藥劑量即為小鼠最大給藥量。

銀杏花粉最大給藥量（g/kg體重）=（單只小鼠日給藥量/小鼠平均體重）×1 000=21.1；

發(fā)酵飲料最大給藥量（mL/kg體重）=（單只小鼠日給藥量/小鼠平均體重）×1 000=80.0。

2.3銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)的影響

胸腺是小鼠體內(nèi)重要的免疫器官，胸腺系數(shù)指胸腺重量與體重的比值。脾臟是小鼠體內(nèi)最大的淋巴器官，脾臟系數(shù)指脾臟重量與體重的比值。胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)的變化與機體免疫功能變化密切相關[9]。給藥14 d后小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)結果見表2。與空白對照組相比，雌性小鼠組間的差異不顯著，而銀杏花粉組的雄性小鼠胸腺系數(shù)顯著增加（P<0.05），銀杏花粉發(fā)酵飲料組的雄性小鼠脾臟系數(shù)極顯著增加（P<0.01）。由此提示，銀杏花粉、銀杏花粉發(fā)酵飲料對雄性小鼠具有一定的免疫增強作用。

3結論與討論

該研究大劑量預試驗結果表明，銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠無毒無害，安全性高，不能測出急性毒性的LD50值。最大給藥量研究結果表明，1 d累計灌服銀杏花粉21.1 g/kg體重、銀杏花粉發(fā)酵飲料80.0 mL/kg體重劑量下，觀察14 d，小鼠無明顯異常反應。表明銀杏花粉及其發(fā)酵飲料小鼠灌胃給藥的最大給藥量分別為21.1 g/kg體重和80.0 mL/kg體重，此最大給藥量遠高于可能攝入的最高劑量，初步說明銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠沒有急性毒性作用。同時研究發(fā)現(xiàn)，銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的攝入能夠增加雄性小鼠的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)，提示其具有一定的免疫增強作用，而對雌性小鼠的免疫功能影響不顯著，其免疫增強作用是否與性別激素有關，需開展進一步的研究。

參考文獻

[1] 任浩，宿樹蘭，管漢亮，等.銀杏花粉中核苷、氨基酸及無機元素的成分分析[J].中草藥，2014，45（19）：2839-2843.

[2] 王國霞，曹福亮，汪貴斌，等.不同地區(qū)銀杏花粉黃酮和內(nèi)酯含量的差異性[J].南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2007，31（3）：34-38.

[3] 徐澄梅，任浩，錢大瑋，等.采用UPLC-TQ-MS同時測定銀杏花粉24種資源性化學成分[J].中國中藥雜志，2015，40（11）：2157-2162.

[4] 孫謹先.銀杏花粉膠囊及其制備方法：200510130954.5[P].2006-08-30.

[5] 曹福亮，汪貴斌，陳穎，等.銀杏花粉食品加工工藝的研究[J].林業(yè)科技開發(fā)，2005，19（4）：68-70.

[6] 裘紀瑩，陳相艷，劉孝永，等.銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮含量及總黃酮測定方法比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（10）：371-373.

[7] 中華人民共和國國家衛(wèi)生與計劃生育委員會.食品安全國家標準 急性經(jīng)口毒性試驗：GB 15193.3—2014[S].北京：中國標準出版社，2014.

[8] 張賓，王予輝.常用動物實驗操作指南[M].上海：上海中醫(yī)藥大學出版社，2007：204.

[9] 齊東江，徐阿曼.奧美拉唑對小鼠胸腺、脾臟免疫功能的影響[J].安徽醫(yī)藥，2015，19（9）：1665-1667.