網(wǎng)地藻多糖清除DPPH?自由基活性的動(dòng)力學(xué)研究

馮學(xué)珍 伍善廣 韋啟球 陸苑 裴世成

摘要： 該研究通過(guò)超聲輔助并采用醇沉、脫蛋白、脫色、干燥的方法，分別檢測(cè)低（0.1 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、高（0.5 mg·mL1）三種濃度下的網(wǎng)地藻多糖對(duì)DPPH·自由基的清除能力，探討質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基活性的變化規(guī)律。按照一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程和二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程分別建立反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。結(jié)果表明：不同的質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基活性均有影響，網(wǎng)地藻多糖質(zhì)量濃度提高，其清除DPPH·自由基的能力逐漸加強(qiáng)，當(dāng)網(wǎng)地藻多糖濃度為 0.5 mg·mL1時(shí)，反應(yīng)20 min，網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基的清除率最高為86.06%，其清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）為0.25 mg·mL1。準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合的線性相關(guān)性較差，相關(guān)系數(shù)R2的范圍分別為0.848～0.891；準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合的相關(guān)系數(shù)R2的范圍為0.902～0.967，因此采用二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合方程能較好地描述網(wǎng)地藻多糖對(duì)DPPH·自由基的清除能力。網(wǎng)地藻多糖在低（0.1 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、高（0.5 mg·mL1）三種濃度時(shí)對(duì)DPPH·的二級(jí)反應(yīng)的清除速率常數(shù)（k2）分別為0.011、0.054、0.421。這說(shuō)明網(wǎng)地藻多糖隨著反應(yīng)濃度逐漸升高其清除DPPH·自由基的速度越來(lái)越快，清除自由基能力也越來(lái)越強(qiáng)，結(jié)合IC50值來(lái)共同評(píng)價(jià)抗氧化能力，IC50值越小，反應(yīng)速率值越大，表明其抗氧化活性越好，這與實(shí)驗(yàn)得出的數(shù)據(jù)一致。

關(guān)鍵詞： 網(wǎng)地藻， DPPH·自由基， 抗氧化， 反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

中圖分類號(hào)： Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 10003142（2017）05064706

Abstract： In order to study the kinetics of DPPH· free radical scavenging activity of Dictyota dichotoma polysaccharides， the polysaccharide was prepared which was extracted from Dictyotadichotoma by ultrasonicassisted technology， ethanol precipitation， deproteinization， decolorization and desiccation， and the effects of mass concentration and reaction time on DPPH· free radical scavenging activity of Dictyotadichotoma polysaccharides， low （0.1 mg·mL1）， medium （0.25 mg·mL1） and high （0.5 mg·mL1） concentrations were investigated. And the reaction kinetic model was established based on firstorder and secondorder reaction kinetic sequation， respectively. The mass concentration and reaction time significantly affected the DPPH· free radical scavenging activity of Dictyotadichotoma polysaccharides. Dictyotadichotoma polysaccharides of high concentration scavenged DPPH· was more quickly than that of lower concentration. The highest DPPH· scavenging rate of Dictyota dichotoma polysacharides was 86.06% when the mass concentration was 0.5 mg·mL1 and the reaction time was 20 minutes which half maximal inhibitory concentration（ IC50） was 0.25 mg·mL1. The fitting correlation coefficient （R2） of firstorder and secondorder reaction kinetics equation were 0.848-0.891 and 0.902-0.967， respectively， indicating that secondorder was better than firstorder model in representing DPPH· free radical scavenging activity of Dictyotadichotoma polysaccharides. The secondorder elimination rate constants （k2） for three different concentrations （0.1， 0.25 and 0.5 mg·mL1） of Dictyotadichotoma polysaccharides were 0.011， 0.054， 0.421， respectively. In conclusion， the scavenging ability of Dictyotadichotoma polysaccharides to DPPH· was stronger when its concentration was higher， and the scavenging ability of Dictyotadichotoma polysaccharides to DPPH· was evaluated by elimination rate constants （k2） and half maximal inhibitory concentration（IC50）. The activity of antioxidative was better and better when k2 was bigger and bigger and IC50 was smaller and smaller， which conformed the results of experiments.

Key words： Dictyota dichotoma， DPPH·， antioxidation， reaction kinetics

網(wǎng)地藻（Dictyota dichotoma）是褐藻門(mén)、褐藻綱、網(wǎng)地藻目、網(wǎng)地藻科、網(wǎng)地藻屬的一種海洋藻類。主要生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶的海洋中，溫帶海岸低潮帶也有，我國(guó)各沿海均有分布。廣西北部灣海域地處熱帶和亞熱帶，資源環(huán)境較好，所盛產(chǎn)的海洋藻類有十幾種，網(wǎng)地藻為其一（鄧家剛等，2008）。海藻多糖是一類多組分的海洋多糖類物質(zhì)，因其來(lái)源于海洋，加之海藻多糖具有抗炎、抑菌、抗氧化等藥理活性，成為目前海洋藥物研究的熱點(diǎn)之一（韓玲等，2012；周慶峰等，2009；吳淳濤等，2011）。關(guān)于網(wǎng)地藻的研究主要集中于對(duì)其化學(xué)成分（宋福行等，2006）和抑菌藥理活性（鄭怡等，2004）的研究，其它領(lǐng)域相對(duì)較少。本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上（馮學(xué)珍等，2014，2013），對(duì)網(wǎng)地藻多糖的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，為開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑奠定基礎(chǔ)。

抗氧化活性的測(cè)定方法較多（穆楠等，2010；趙慧芳等，2011），其中DPPH·是一種相對(duì)較穩(wěn)定的以氮原子為中心的自由基，具有較強(qiáng)還原能力，可與抗氧化劑反應(yīng)以檢測(cè)其抗氧化能力，因其測(cè)定方法簡(jiǎn)便易行、靈敏度高、重現(xiàn)性好，成為目前常用的抗氧化活性檢測(cè)方法之一（趙慧芳等，2011； Zhang et al，2016）。DPPH·自由基在乙醇溶液中顯紫色，當(dāng)與抗氧化劑反應(yīng)時(shí)其顏色會(huì)減退，褪色程度與抗氧化劑的抗氧化能力及數(shù)量呈定量關(guān)系，且不同抗氧化劑對(duì)DPPH·自由基反應(yīng)的速率存在差異（Zhang et al，2016；GrajedaIglesiasa et al，2016）。本研究采用DPPH·自由基檢測(cè)網(wǎng)地藻多糖的抗氧化能力，并對(duì)其清除DPPH·自由基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了探討。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料供試的網(wǎng)地藻于2013年采自廣西北部灣海域，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所雷新明博士鑒定為鹿角網(wǎng)地藻（Dictyota cervicornis），經(jīng)水洗、干燥后備用；1，1二苯基2三硝基苯肼（DPPH·）（分析純，Sigma公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；DL180J智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；臺(tái)式離心機(jī)TDL5A（飛鴿）；AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確配制質(zhì)量濃度為0.05 mg·mL1的DPPH·標(biāo)準(zhǔn)母液，無(wú)水乙醇稀釋倍數(shù)為1/2、1/3、1/4、1/5、1/6的DPPH·溶液，于517 nm處測(cè)定其吸光度。以濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度A（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（趙慧芳等，2011；Zhang et al， 2016；GrajedaIglesiasa et al， 2016）。

1.2.2 網(wǎng)地藻多糖樣品的制備將干燥后的網(wǎng)地藻粉末稱重，乙醇浸泡過(guò)夜揮干，加30倍蒸餾水，75 ℃，pH 7.0超聲（功率200 W）提取30 min，離心，濃縮，80%乙醇沉淀，靜置過(guò)夜，沉淀干燥稱重。Sevage法脫蛋白（潘雪豐，2015），活性炭脫色，乙醇沉淀，無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚反復(fù)洗滌，干燥即得網(wǎng)地藻多糖的樣品粉末（馮學(xué)珍等，2014）。

1.2.3 網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基清除曲線的繪制將樣品粉末用無(wú)水乙醇配制成高（0.5 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、低（0.1 mg·mL1）三個(gè)質(zhì)量濃度的樣品液，每個(gè)質(zhì)量濃度配制三份樣品液，離心后取樣品液2 mL，加入0.025 mg·mL1的DPPH·溶液2 mL，混勻后在30 ℃反應(yīng)20 min，采用動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)法于517 nm處測(cè)定不同時(shí)間的吸光度A（趙慧芳等，2011；Zhang et al，2016；GrajedaIglesiasa et al，2016），直至吸光度基本不變?yōu)橹?。同時(shí)用無(wú)水乙醇作參比測(cè)定吸光度，按照以下公式計(jì)算清除率（馮學(xué)珍等，2013； Zhang et al，2016），以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，DPPH·自由基清除率（%）為縱坐標(biāo)繪制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液的清除率與時(shí)間反應(yīng)的曲線。

清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/A0] ×100（式1）

式1中，Ai： 2 mL樣品液+2 mL DPPH·的吸光度；Aj： 2 mL樣品液+2 mL無(wú)水乙醇的吸光度；A0： 2 mL無(wú)水乙醇+2 mL DPPH·的吸光度。

1.2.4 網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）的測(cè)定

配制系列濃度的網(wǎng)地藻多糖溶液作為樣品液，按照1.2.3的測(cè)定方法計(jì)算清除率，以網(wǎng)地藻多糖的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)繪圖，以測(cè)定網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基活性半數(shù)抑制率（IC50）（Zhang et al，2016）。

1.2.5 網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基活性的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

根據(jù)1.2.3的DPPH·自由基的清除曲線，按照以下反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程建立反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型（Simonin，2016）。

一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式：

lnCt/C0=-k1t（式2）

式2中，DPPH·剩余率=Ct/C0×100%；清除率a=1-DPPH·剩余率=（1-Ct/C0） ×100%。

因此，Ct/C0=1-a，代入式（2），則有一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式：

ln（1-a） = -k1t

二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式：

1/Ct = k2 t +1/C0（式3）

將Ct = C0*（1-a）， 代入上式（3），則有二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式：

1/1-a=k2C0t-1

式中，C0表示DPPH·自由基在t=0時(shí)的濃度（mg·mL1）；Ct表示DPPH·自由基在t min時(shí)的濃度（mg·mL1）；a表示DPPH·自由基清除率；k1表示擬一級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)（min1）； k2表示擬二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)（mg·mL1·min1）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、計(jì)算和分析。

2結(jié)果與分析

2.1 DPPH·標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.2.1的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1，其回歸方程y=43.79x，R2=0.999（極顯著相關(guān)），在0.008～0.025 mg·mL1范圍內(nèi)DPPH·自由基濃度與吸光度之間有較好的線性關(guān)系。

2.2 網(wǎng)地藻多糖對(duì)DPPH·自由基的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

高、中、低三個(gè)不同質(zhì)量濃度的樣品溶液清除DPPH·自由基的活性曲線見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，隨著網(wǎng)地藻多糖質(zhì)量濃度的不斷提高，其清除DPPH·自由基的能力逐漸加強(qiáng)，表明在一定范圍內(nèi)網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基的能力與其濃度呈明顯的量效關(guān)系，高濃度情況下網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基的清除率最高，為86.06%，低濃度情況下網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基的清除率最高為24.01%，這是由于高濃度的網(wǎng)地藻多糖含有的抗氧化功能集團(tuán)（羥基、酚羥基）多于低濃度的網(wǎng)地藻多糖，能更有效地清除自由基。

由圖2還可見(jiàn)，不同質(zhì)量濃度的樣品溶液清除DPPH·自由基的反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間也不相同，高、中、低三種濃度下反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間為12.4、14.2、17.4 min，高濃度條件下反應(yīng)清除速度比低濃度下快，因此要探討質(zhì)量濃度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基活性的變化規(guī)律。

2.3 網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）的測(cè)定

由圖3可見(jiàn)，清除率隨網(wǎng)地藻多糖質(zhì)量濃度的增加逐漸增高，當(dāng)網(wǎng)地藻多糖濃度為5.0 mg·mL1時(shí)，清除率可達(dá)到88%，之后隨著網(wǎng)地藻多糖質(zhì)量濃度的增加，清除率緩慢增加，之后基本保持不變，由圖3可推測(cè)網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）為0.25 mg·mL1。

2.4 網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基活性的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

由圖2可知，在一定時(shí)間內(nèi)，測(cè)試液中網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基清除率與其反應(yīng)時(shí)間呈正相關(guān)，因此可用DPPH·清除率隨時(shí)間t的變化規(guī)律來(lái)表示網(wǎng)地藻多糖的抗氧化活性隨時(shí)間t的變化規(guī)律。假定網(wǎng)地藻清除DPPH·自由基的清除率對(duì)時(shí)間的變化規(guī)律符合準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式。以ln（1-a）（y）為縱坐標(biāo)，以時(shí)間t（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得出準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式，低濃度下的準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為y = -0.009x-0.128，R2 = 0.891；中濃度下的準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為y = -0.029x - 0.328，R2= 0.872；高濃度下的準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為y = -0.088x - 0.686，R2=0.848，見(jiàn)圖4所示，相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

假設(shè)網(wǎng)地藻清除DPPH·自由基的清除率對(duì)時(shí)間的變化規(guī)律符合準(zhǔn)二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式。以1/（1-a）（y）為縱坐標(biāo)，以時(shí)間t（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得出準(zhǔn)二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式，低濃度下的準(zhǔn)二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為y = 0.011x + 1.135，R2 = 0.902；中濃度下的準(zhǔn)二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為y = 0.054x + 1.355，R2 = 0.918；高濃度下的準(zhǔn)二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程為y = 0.054x + 1.355，R2 = 0.918，見(jiàn)圖5所示，相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

由表1可知，準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型擬合的線性相關(guān)性較差，相關(guān)系數(shù)R2為0.848～0.891。而用準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行擬合，其相關(guān)系數(shù)R2為0.902～

0.967，網(wǎng)地藻多糖對(duì)DPPH·的清除作用說(shuō)明符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。通過(guò)準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合方程計(jì)算出在實(shí)驗(yàn)條件下，網(wǎng)地藻多糖初始濃度分別為0.1、0.25、0.5 mg·mL1時(shí)，網(wǎng)地藻多糖對(duì)DPPH·的清除作用二級(jí)動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)分別為0.011、0.054、0.421。二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)通常被認(rèn)為與抗氧化物質(zhì)的自由基清除能力有關(guān)，速率常數(shù)越大，即清除反應(yīng)的速率越快，因此網(wǎng)地藻多糖隨著濃度的逐漸升高清除DPPH·自由基的速度越來(lái)越快，其清除自由基能力也越來(lái)越強(qiáng)，這與實(shí)驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)一致。

3討論與結(jié)論

海藻多糖清除DPPH·自由基活性的研究報(bào)道有草葉馬尾藻多糖（張朝燕，2012）、羽藻和刺松藻多糖（宋厚芳，2010）等，也有研究者報(bào)道了多種天然藥物中多糖類物質(zhì)清除DPPH·自由基活性的研究，如刺五加多糖（孟繁磊等，2010）、青錢(qián)柳多糖（葛霞等，2011）、荷葉多糖（涂宗財(cái)?shù)龋?013）等，多糖清除DPPH·自由基活性的研究大多是對(duì)DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）的測(cè)定，沒(méi)有進(jìn)行清除動(dòng)力學(xué)的研究，本研究采用IC50值結(jié)合反應(yīng)速率來(lái)共同評(píng)價(jià)多糖清除DPPH·自由基活性的能力，為開(kāi)發(fā)天然抗氧化劑提供數(shù)據(jù)支持。

本研究采用超聲輔助提取網(wǎng)地藻多糖，采用醇沉，脫蛋白，脫色，干燥的方法制備網(wǎng)地藻多糖的樣品粉末。分別檢測(cè)了低（0.1 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、高（0.5 mg·mL1）三種濃度下的網(wǎng)地藻多糖對(duì)DPPH·自由基的清除能力，當(dāng)網(wǎng)地藻多糖濃度為 0.5 mg·mL1時(shí)，反應(yīng)20 min，網(wǎng)地藻多糖清除DPPH·自由基的清除率最高為86.06%，因此網(wǎng)地藻多糖具有一定的抗氧化能力，其清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）為0.25 mg·mL1。按照反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程建立反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，結(jié)果表明二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合方程能較好地描述網(wǎng)地藻多糖對(duì)DPPH·自由基的清除能力，其相關(guān)系數(shù)R2的范圍為0.902～0.967。網(wǎng)地藻多糖在低（0.1 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、高（0.5 mg·mL1）三種濃度時(shí)，對(duì)DPPH·的清除速率常數(shù)分別為 0.011、0.054、0.421。說(shuō)明網(wǎng)地藻多糖隨著濃度的逐漸升高其清除DPPH·自由基的速度越來(lái)越快，其清除自由基能力也越來(lái)越強(qiáng)。IC50值越小，反應(yīng)速率值越大，說(shuō)明其抗氧化活性越好，因此網(wǎng)地藻多糖比草葉馬尾藻多糖、羽藻和刺松藻多糖具有更好的抗氧化活性（張朝燕，2012；宋厚芳，2010），有望將其開(kāi)發(fā)為一種天然的抗氧化劑。

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