杉木未成熟胚胚性愈傷組織誘導影響因素探析

陳琴 陳代喜 勞廣杰 黃開勇 梁機 莫勇德

摘要： 該研究從基因型、6BA濃度、外植體接種方式和合子胚發(fā)育階段等方面，分析杉木未成熟胚胚性愈傷組織誘導的影響因素。結(jié)果表明：基因型、6BA濃度、外植體接種方式和合子胚發(fā)育階段均對胚性愈傷組織誘導頻率有不同程度影響。6種基因型中，有3種基因型誘導出胚性愈傷組織，其中基因型S18胚性愈傷組織誘導頻率最高，為11.7%。6BA濃度在1.0～1.5 mg·L1范圍內(nèi)時，基因型S18的胚性組織誘導頻率較高。以在去皮種子的一端切開一個小口的接種方式為最優(yōu)，將合子胚剝出的方式易造成合子胚褐化死亡，將未剝皮的種子切開一個小口后直接接入培養(yǎng)基的方式不利于愈傷組織生成。適合胚性愈傷組織誘導的合子胚發(fā)育階段為受精至胚器官分化階段，合子胚進入成熟階段后不利于胚性愈傷組織誘導，合子胚易生長成完整植株。

關(guān)鍵詞： 杉木， 未成熟胚， 胚性愈傷組織， 誘導

中圖分類號： Q943.1

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）05058705

Abstract： Cunninghamia lanceolata is a fastgrowing and highyield timber forest species endemic in China. It has many advantages of fast growth， high production， good quality and wide use， and plays an important role in the forestry production in South China. In this research， an experiment of embryogenic callus induction was carried out. In the experiment， six different genotypes of C. lanceolata improvement species were used as initial explant， and four factors affecting embryogenic callus induction were studied and analysed. These four factors were the key elements on embryogenic callus formation， and they were as follows： genotypes， 6BA combination， inoculating ways and developmental stages of immature zygotic embryos including. The results showed that the factors of genotypes， 6BA combination， inoculating ways and developmental stages of immature zygotic embryos all had significant effects on the induction rate of embryogenic callus， but the influence degree each were not identical. Three genotypes in six genotypes obtained embryogenic callus， and one of the genotype （S18） had the highest induction rate of embryogenic callus with 11.7%. When the range of 6BA combinations was from 1.0 mg·L1 to 1.5 mg·L1， the genotype S18 had the highest induction rate. The best method of inoculating was to peel and cut a small hole on end of seed. It was not a good inoculating way to take out zygotic embryos from endosperm， and the zygotic embryos were easy to die in that way. The inoculating method of only cutting a small hole on end of seed and nonpeeling was unsuited for embryogenic callus induction. The suitable developmental stage for embryogenic callus induction was from fertilization stage to embryo organ differentiation stage， and it was difficult to obtain embryogenic callus when the zygotic embryos entered into the mature stage. The results indicated that the zygotic embryos which already entered into the mature stage were used as initial explants in the experiment of embryogenic callus induction， and they grew into a complete plant， not callus.

Key words： Cunninghina lanceolata， immature zygotic embryo， embryogenic callus， induction

隨著傳統(tǒng)生物技術(shù)快速向現(xiàn)代生物技術(shù)轉(zhuǎn)變，體細胞胚胎發(fā)生已成為針葉樹細胞工程植株再生的重要途徑（施季森，2000；陳金慧等，2008）。植物體細胞胚胎發(fā)生是體細胞在人工無菌培養(yǎng)條件下，未經(jīng)過受精過程而發(fā)育出新個體的形態(tài)發(fā)生過程（呂守芳，2003；溫亞峰，2011）。目前，已從40多種針葉樹種培養(yǎng)產(chǎn)生出體細胞胚，主要集中于云杉屬和松屬（Becwar et al，1990；黃健秋等，1995；Salajova & Salaj，2005；Felipe et al，2008；Yildirim et al，2006；Park et al，2006；Zhang et al，2007；Li et al，2008）。

杉木（Cunninghina lanceolata） 隸屬于杉科杉木屬，其生長好、產(chǎn)量高、木材紋理直、結(jié)構(gòu)細、耐腐力強、用途廣泛，是我國重要速生商品用材樹種（黃安民等，2006）。關(guān)于杉木體細胞胚胎發(fā)生已開展部分研究工作，席夢利等（2005，2006）分別以成熟合子胚、子葉和下胚軸為外植體誘導出胚性愈傷組織，成功實現(xiàn)植株再生，但其胚性愈傷組織最高誘導率僅有 13.3%，且易褐化，大多不能長出形態(tài)健全的子葉胚或長出畸形子葉胚；鄭仁華（2008）以不同發(fā)育階段的未成熟合子胚為外植體進行胚性愈傷組織誘導，接種的3 349個合子胚中，僅108個產(chǎn)生胚性愈傷組織，且誘導頻率極低；溫亞峰（2011）以杉木未成熟合子胚為外植體進行誘導試驗，胚性愈傷組織誘導率最高為15.2%。從以上研究結(jié)果來看，胚性愈傷組織誘導十分困難，其誘導頻率受基因型、激素濃度等多方面影響，而胚性愈傷組織誘導是體細胞胚胎發(fā)生的最初環(huán)節(jié)，這一環(huán)節(jié)完成的好壞決定了下一階段是否順利進行。因此，本研究以廣西杉木不同基因型的未成熟胚為材料，從基因型、激素濃度、合子胚發(fā)育階段和接種方式4個方面展開研究，探析影響胚性愈傷組織形成的原因，為后期的研究提供參考。

1材料與方法

1.1 材料

采自廣西柳州市融安縣西山林場杉木第二代種子園。采種母樹分別為杉木優(yōu)良家系S18、杉木優(yōu)良家系S26、杉木優(yōu)良家系S17、杉木優(yōu)良家系G21、杉木優(yōu)良家系L39和杉木優(yōu)良家系L9。球果采集時間分別為2014年6月18日（受精或原胚階段）、7月24日（胚器官分化階段）、8月20日（進入成熟期）。采下的球果用自封塑料袋密封并放入冰盒帶回實驗室，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 外植體消毒

將球果洗凈，用濾紙吸干表面水分，剝出未成熟種子，在超凈工作臺上，先用75%酒精消毒45 s，用無菌水沖洗2次，然后轉(zhuǎn)入0.1% HgCl2溶液中，震蕩，消毒8 min，無菌水沖洗6次，每次2 min，接種備用。

1.3 接種

采用3種方式進行接種。方式一：用解剖刀將種子一端切開一個小口后直接接種于培養(yǎng)基上。方式二：剝?nèi)シN皮，將去皮種子一端切開一個小口，將胚乳一起接種于培養(yǎng)基上。方式三：剝?nèi)ヅ呷樘舫龊献优呓臃N于培養(yǎng)基上。

1.4 胚性愈傷組織的誘導

胚性愈傷組織誘導基本培養(yǎng)基為MS，分別添加0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L1 6BA，4.0 mg·L12， 4D，2.0 mg·L1 KT，500 mg·kg1谷氨酰胺，500 mg·kg1水解酪蛋白，7.0 g·L1瓊脂，30 g·L1蔗糖，pH值5.8。每個培養(yǎng)瓶接種1個外植體，每個處理重復3次，每個重復接種10瓶。培養(yǎng)室溫度為（24 ± 1）℃，光照培養(yǎng)，光照強度為1 000～1 300 lx。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計胚性愈傷組織誘導率。

胚性愈傷組織誘導率（%）=長出胚性愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù) × 100%

2結(jié)果與分析

2.1 基因型的影響

以2014年6月18日采集的6種基因型為材料，將剝皮種子切開一個小口后接種于附加1.0 mg·L1 6BA、4.0 mg·L1 2，4D、2.0 mg·L1 KT的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，結(jié)果見表1。接種7 d后，合子胚開始膨脹，15 d后，從切口處開始有白色或淺黃色愈傷組織膨脹出來。培養(yǎng)40 d后，愈傷組織誘導率和胚性愈傷組織誘導率在不同基因型之間存在一定差異，參試的6種基因型中，有3種基因型誘導出胚性愈傷組織。其中，基因型S18表現(xiàn)較突出，愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導率均達最高值，分別為47.9%和11.7%；其次為基因型G21，分別為44.6%和10.6%；基因型S17、L39和L9 三種基因型生成了愈傷組織，但未誘導出胚性愈傷組織。

2.2 分裂素6BA的影響

以基因型S18（7月24日摘）為材料，將剝皮種子切開一個小口后接種于附加0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L1 6BA、4.0 mg·L12，4D、2.0 mg·L1 KT的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，結(jié)果見表2。添加1.5和2.0 mg·L1 6BA的兩種處理，培養(yǎng)6 d后外植體開始膨脹，其他處理培養(yǎng)8 d后陸續(xù)開始膨脹，16 d后，部分外植體開始有白色或淺黃色愈傷組織從切口處膨脹出來。6BA濃度在0.0～1.5 mg·L1范圍變動時，愈傷組織誘導率隨6BA濃度的升高而提高。6BA濃度在0.0～1.0 mg·L1范圍變動時，胚性愈傷組織誘導率隨6BA濃度的升高而提高，6BA濃度為1.0 mg·L1時，胚性愈傷組織誘導率最高為13.3%，其次是6BA濃度為2.0 mg·L1時；當6BA濃度在1.0～2.0 mg·L1范圍變動時，胚性愈傷組織誘導率與6BA濃度的變化均無明顯相關(guān)性。

2.3 接種方式的影響

以基因型S18（7月24日摘）為材料，采用三種不同方式將外植體接種于附加1.0 mg·L1 6BA、

4.0 mg·L1 2，4D、2.0 mg·L1 KT的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，結(jié)果見表3。三種接種方式對愈傷組織和胚性愈傷組織的誘導均有影響。方式一：接種15 d后外植體仍無明顯變化，僅種皮逐漸變褐色。培養(yǎng)40 d后，部分外植體膨脹，少部分外植體從切口處伸出一小段白色物體，為種胚外伸，所有外植體均無愈傷組織生成。方式二：接種15 d后，可見大部分外植體膨脹，少數(shù)外植體從切口處產(chǎn)生白色或淺黃色愈傷組織。培養(yǎng)40 d后，有11.7%的外植體生成胚性愈傷組織。方式三：接種15 d后，有36.7%外植體褐化死亡，少部分外植體膨脹。培養(yǎng)40 d后，極少數(shù)外植體生成白色愈傷組織，僅有1個外植體生成的愈傷組織為胚性愈傷組織。

2.4 發(fā)育階段的影響

以基因型S18（6月18日、7月24日、8月20日采摘）為材料，將剝皮種子切開一個小口后接種于附加1.0 mg·L1 6BA、4.0 mg·L1 2，4D、2.0 mg·L1 KT的胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，結(jié)果見表4。

以處于受精或原胚階段（6月18日采摘）的合子胚為外植體，接種7 d后外植體開始膨脹，16 d后可見愈傷組織從切口處膨脹出，40 d后愈傷組織發(fā)生頻率為53.3%，胚性愈傷組織發(fā)生頻率為13.3%。以處于胚器官分化階段（7月24日采摘）的合子胚為外植體，接種7 d后外植體開始膨脹，16 d后可見愈傷組織從切口處膨脹出，40 d后愈傷組織發(fā)生頻率為47.9%，胚性愈傷組織發(fā)生頻率為11.7%。以處于進入成熟期階段（8月20日采摘）的合子胚為外

植體，接種9 d后外植體開始膨脹，23 d后可見愈傷組織從切口處膨脹出，40 d后愈傷組織發(fā)生頻率為26.7%，無胚性愈傷組織生成，有36.7%外植體發(fā)芽生長成植株。

3討論與結(jié)論

本研究基因型、6BA濃度、外植體接種方式和未成熟合子胚的發(fā)育階段均對胚性愈傷組織誘導頻率有不同程度的影響。同一培養(yǎng)基上，不同基因型誘導胚性愈傷組織發(fā)生的難易程度不同，這與鄭仁華（2008）和溫亞峰（2011）的研究結(jié)果一致。每一種基因型對激素種類及濃度的反應程度不同，為實現(xiàn)試驗的重復性及為今后規(guī)?；纾仨殞δ骋换蛐偷呐囵B(yǎng)體系進行篩選，做到基因型與培養(yǎng)體系精確配對。建議通過對大量優(yōu)良基因型展開試驗，篩選胚性愈傷組織誘導相對容易的基因型作為后續(xù)研究材料，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化某一基因型的培養(yǎng)體系，最終獲取適應該基因型的穩(wěn)定培養(yǎng)體系。

本研究對基因型S18，分裂素6BA濃度在1.0～1.5 mg·L1范圍時，胚性愈傷組織誘導頻率較高，激素濃度繼續(xù)增加時，胚性愈傷組織誘導頻率變幅較小，但外植體玻璃化頻率增加。外植體接種以剝?nèi)シN皮，在去皮種子的一端切開一個小口的方式最優(yōu)，這可能是合子胚在胚乳保護下，接種過程中受到傷害程度較小，合子胚褐化死亡的幾率較小，同時胚乳可持續(xù)為合子胚提供營養(yǎng)，使合子胚維持活力，分化能力更強。從剝出合子胚的方式來看，合子胚褐化死亡率較高，說明在接種過程中易受到機械傷害，有效外植體數(shù)量減少，降低了胚性愈傷組織誘導效率。不剝除種皮，直接將種子切開一個小口接入培養(yǎng)基的方式，可能由于種皮的阻礙作用，合子胚難以接觸培養(yǎng)基中的養(yǎng)分和激素，難以生成愈傷組織。

合子胚的發(fā)育階段以進入成熟期之前為宜，在受精階段和原胚階段愈傷組織誘導頻率較高，合子胚進入成熟期后，外植體直接生長成植株的頻率較高，胚性愈傷組織的誘導難度較大。這與溫亞峰（2011）的研究結(jié)果相一致，研究表明參試的6個基因型中，有5個在受精階段胚性愈傷組織誘導率最高，原胚階段次之。而席夢利和施季森（2006）從成熟合子胚上成功誘導出胚性愈傷組織，這與本研究結(jié)果相反。本研究將趨于成熟的合子胚接種后，多數(shù)直接生長成一顆完整的植株，少部分生成愈傷組織，但未從愈傷組織上看到胚狀體形成。這可能是由于接種方法不同或培養(yǎng)基中激素使用不同而造成的。對于趨于成熟或者已成熟的合子胚，是否可以通過橫切或截斷合子胚來破壞其完整結(jié)構(gòu)，或在激素使用上進行針對性調(diào)整等方式，使合子胚難以發(fā)展成完整植株，而是分化成愈傷組織，進而形成體胚，這些猜想可通過進一步研究來證明。

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