探討降糖消渴顆粒對高脂飲食誘導2型糖尿病腎臟氨基末端激酶信號通路的影響

常智躍 高思華 穆倩倩

摘要 目的：運用降糖消渴顆粒治療高脂飲食誘導2型糖尿病并探討其對腎臟氨基末端激酶信號通路的影響。方法：72只Wistar大鼠，在SPF級條件下飼養(yǎng)，根據(jù)隨機數(shù)字表法分為干預組、對照組和正常對照組，每組24只，通過鏈脲佐菌素（STZ）30 mg/kg腹腔注射協(xié)同高脂飲食誘導2型糖尿病進行動物造模，造模后干預，正常對照組予標準飼料；對照組予高糖高脂飼料；干預組予高糖高脂飼料，降糖消渴顆粒根據(jù)大鼠體重9 g/kg的計算灌胃劑量，1次/d。療程8周。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA法）檢測大鼠的血糖（Glu）、三酰甘油（TG），總膽固醇（TC）、血肌酐（Scr）；常規(guī)HE染色，觀察各組腎臟結構變化；實時熒光聚合酶鏈式反應（q-PCR）檢測腎組織中氨基末端激酶（JNK）和胰高血糖樣肽-1（GLP-1）mRNA的表達，蛋白質印跡法（Western Blot）檢測腎組織中JNK信號通路的激活情況情況，JNK、磷酸化氨基末端激酶（p-JNK）和GLP-1的蛋白表達情況。結果：1）干預組經(jīng)治療后Glu、TC、TG和Scr較對照組顯著下降（P<0.05）。2）干預組較對照組明顯改善腎小球結構改變的情況（P<0.05）。3）與正常對照組比較，對照組中p-JNK蛋白表達顯著升高（P<0.05），GLP-1基因和蛋白顯著降低（P<0.05）；經(jīng)治療后干預組p-JNK蛋白較對照組降低（P<0.05），而GLP-1基因和蛋白升高（P<0.05）。結論：降糖消渴顆?？烧{節(jié)糖、脂質代謝，發(fā)揮保護腎臟作用，其作用機制可能與抑制JNK信號通路，上調GLP-1有關。

關鍵詞 降糖消渴顆粒；高脂飲食；2型糖尿?。荒I臟；氨基末端激酶信號通路

Abstract Objective： To study the Jiangtangxiaoke granule in the treatment of high fat diet induced type 2 diabetes and to investigate its effect on renal N-terminal kinase signal pathway. Methods： All 72 Wistar rats were reared in SPF conditions， and were randomly divided into an intervention group， a control group and a normal control group， 24 rats in each. By streptozotocin （STZ） intraperitoneal injection of 30 mg/kg synergy， high fat diet induced type 2 diabetes animal models were built. After the model intervention， the normal control group received standard diet； the control group was treated with high glucose and high fat diet； the intervention group treated with high glucose， high fat diet， and Jiangtangxiaoke granules were calculated according to the body weight of 9 g/kg rats by gavage once daily. Treatment lasted 8 weeks. Using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA method） to detect rats blood glucose （Glu）， triglyceride （TG）， total cholesterol （TC）， serum creatinine （Scr）； routine HE staining， observing the changes of renal structure in each group； real time fluorescent polymerase chain reaction （q-PCR） detection （amino terminal kinase） and JNK （glucagon like peptide-1 GLP-1） and Western blotting （Western Blot） to detect the activation of JNK signaling pathway， JNK （phosphorylated N-terminal kinase） p-JNK and GLP-1.Results： 1） The Glu， TC， TG and Scr in the intervention group were significantly lower than those in the control group （P<0.05）. 2） Compared with the control group， the changes of glomerular structure were significantly improved in the intervention group （P<0.05）. 3） Compared with the normal control group， the expression of p-JNK protein in control group increased significantly （P<0.05）， GLP-1 gene and protein significantly decreased （P<0.05）； after treatment， the intervention group of p-JNK protein was lower than that of the control group （P<0.05）， and GLP-1 （P<0.05） gene and protein increased. Conclusion： Jiangtangxiaoke granules can regulate sugar， lipid metabolism， protect the kidney function， its mechanism may be related to the inhibition of the JNK signaling pathway and regulation of GLP-1.

Key Words Jiangtangxiaoke granule； High fat diet； Type 2 diabetes mellitus； Kidney； N-terminal kinase signal pathway

中圖分類號：R242；R255.4文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.045

糖尿病腎病（Diabeticnephropathy，DN）是糖尿病嚴重的微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病過程較為緩慢，具有隱匿性。近8%的DN患者最終發(fā)展至尿毒癥，最終導致死亡，目前DN的發(fā)病機制尚無統(tǒng)一定論，多種原因在此過程有重要作用，程序性細胞死亡存在于機體各類組織中，持續(xù)性的內質網(wǎng)應激反應可觸發(fā)機體細胞凋亡加劇，而DN發(fā)病時可誘發(fā)明顯的內質網(wǎng)應激反應，因此細胞凋亡在DN的發(fā)生發(fā)展過程中的影響逐漸受到重視。氨基末端激酶信號通路JNK是啟動細胞凋亡的重要通路，C-JUN通路的激活導致細胞大量凋亡最終出現(xiàn)組織損傷，因此我們推測，各種干預措施如果可抑制JNK通路的激活，就可以在一定程度上逆轉DN的腎臟組織損傷。

降糖消渴顆粒是以中醫(yī)整體觀為指導，結合現(xiàn)代中藥炮制方法制作而成的中成藥制劑，臨床上不乏其報道，大量醫(yī)賢認為其不但可以改善血脂水平，還可治療胰島素抵抗，最終調節(jié)血糖。然后對于降糖消渴顆粒的作用機制目前仍處于探索階段，基于我們推測結論設想：糖消渴顆粒改善糖尿病及其并發(fā)癥的作用機制是否通過C-JUN信號通路進行橋接？為此，我們進行一系列研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 72只Wistar大鼠（購買于南京君科生物工程有限公司）體重均在180～200 g之間。

1.1.2 試劑與儀器 鏈脲佐菌素（上海生工生物有限公司），超凈工作臺購自蘇州安泰公司，水合氯醛（武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 根據(jù)隨機數(shù)字表法分為干預組、對照組和正常對照組，每組24只，同等環(huán)境下，正常供水和墊料，適應性喂養(yǎng)一周后，對照組和干預組的大鼠均采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食12 h后采用鏈脲佐菌素（STZ）30 mg/kg腹腔注射，協(xié)同高脂飲食誘導2型糖尿病；正常對照組標準飼料飼養(yǎng)即可。2型糖尿病大鼠造模成功的標準參照課題組前期文獻[1]。

1.2.2 干預方法 動物造模后開始干預，具體如下：1）正常對照組：在SPF級條件下標準飼料，單籠飼養(yǎng)；2）對照組：在SPF級條件下高糖高脂飼料，單籠飼養(yǎng)；3）干預組：在SPF級條件下高糖高脂飼料，降糖消渴顆粒溶于蒸餾水中，濃度為1.0 g/mL，根據(jù)大鼠體重9 g/kg的計算灌胃劑量，1次/d。療程為8周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 大鼠血糖、血脂和腎功能的檢測 治療前后每組6只大鼠麻醉處死，取下腔靜脈血4 mL，離心取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA法）檢測大鼠的血糖（Glu）、三酰甘油（TG），總膽固醇（TC）、血肌酐（Scr），試劑盒均購于上海西塘生物試劑有限公司，操作根據(jù)試劑盒說明書進行，用酶標儀450 nm檢測OD值。

1.2.3.2 腎臟結構的形態(tài)學觀察 治療后每組各處死6只大鼠，麻醉后打開腹腔分離出腎臟組織于液氮中保存，備后續(xù)檢測用。取出腎臟于10%多聚甲醛中固定，并根據(jù)標準組織學技術石蠟包埋，連續(xù)切片，每片4 μm，常規(guī)HE染色，觀察各組腎臟結構變化。

1.2.3.3 氨基末端激酶信號通路指標檢測 治療后實時熒光聚合酶鏈式反應（q-PCR）檢測腎組織中（氨基末端激酶）JNK和（胰高血糖樣肽-1）GLP-1mRNA的表達和蛋白質印跡法（Western Blot）檢測腎組織中JNK信號通路的激活情況JNK、（磷酸化氨基末端激酶）p-JNK和GLP-1蛋白的表達情況。所有試劑盒均購自上海太陽生物技術有限公司，操作步驟均嚴格參照說明書進行。以β-actin作為內參。

1.3 統(tǒng)計學方法 運用軟件SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，計量資料用（±s）表示，采用t檢驗或秩和檢驗；計數(shù)資料采用卡方檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 降糖消渴顆粒對大鼠血糖、血脂和腎功能的影響 與正常對照組比較，對照組和干預組Glu、TC、TG和Scr均升高（P<0.05）；干預組經(jīng)治療后Glu、TC、TG和Scr較對照組顯著下降（P<0.05）。

2.2 治療后各組大鼠腎臟病理組織變化 如圖1所示，治療后，正常對照組大鼠的腎臟未見明顯的腎小球結構改變、增生和充血；對照組則出現(xiàn)明顯的腎小球結構改變，且腎小球變大充血、系膜細胞增生變厚；干預組較對照組明顯改善腎小球結構改變的情況。

2.3 治療后腎臟組織中JNK和GLP-1基因表達情況 3組JNK的表達無明顯統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與正常對照組比較，對照組中GLP-1顯著降低（P<0.05）；經(jīng)治療后干預組GLP-1較對照升高（P<0.05）。見表2。

2.4 治療后各組腎臟組織中JNK 、p-JNK和GLP-1蛋白表達情況3組JNK的表達無明顯統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與正常對照組比較，對照組中p-JNK顯著升高（P<0.05），GLP-1顯著降低（P<0.05）；經(jīng)治療后干預組p-JNK較對照組降低（P<0.05），而GLP-1升高（P<0.05）。見表3。

3 討論

《黃帝內經(jīng)·靈樞》一書中描述：“五臟皆柔弱者，善病消癉”，首次提到五臟六腑羸弱易導致功能，最終引發(fā)消渴。氣機是推動五臟六腑功能活動的主要物質條件，脾腎是氣虛首先責任臟器，而脾腎分別的機體的先后天之本，此二臟虛衰又可影響其他臟器。糖尿病乃中醫(yī)學“消渴”范疇，以氣虛為首發(fā)病因，繼而累陰出現(xiàn)氣陰兩虛，最終氣陰兩虛是消渴病發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)[1-2]。降糖消渴顆粒主要含有人參、麥冬、生地黃、黃連、丹參及香椿葉。其中人參為君藥，具有大補元氣之功，此外還可益肺補脾，麥冬及生地黃具有滋陰生津止渴之功效，此外還有清熱除煩的作用，現(xiàn)代藥理學研究證實人參可提高機體免疫力、其調節(jié)糖分及脂質代謝的作用被甚為關注；麥冬及生地黃聯(lián)合運用共為臣藥，可增強君藥養(yǎng)陰生津之作用，中藥藥理學顯示麥冬可激活垂體腎上腺皮質系統(tǒng)，降低血糖，生地黃同時具有調控血糖的作用，并且可增強CD4+淋巴細胞中Th1、Th2的分泌，從而增強免疫力。方中加少量的黃連，取清熱瀉火之功，不但可去除人參過熱之劣勢，又可消除奇氣陰兩虛所致之燥熱消渴，為佐藥。其主要成分可增強白細胞吞噬細菌的能力，不但有顯著的抗菌作用，還可抗病毒。丹參乃活血化瘀之品，有活血、祛瘀、養(yǎng)血之功，其主要成分丹參酮可明顯擴血管效應，可增強機體對缺氧的耐力，調整血液流變學動力，達到降脂、降糖等作用[3-4]。香椿葉有清熱解毒、消炎、止血等功效，其與丹參共為使藥，共奏活血、清熱、消脂之目的[5]。古代醫(yī)家認為氣陰兩虛始終貫穿消渴病的發(fā)生發(fā)展，滋陰益氣可使臟腑功能得復，在本研究中我們對不同組別進行血糖，三酰甘油，總膽固醇、血肌酐等指標的客觀檢測，結果顯示加用降糖消渴顆粒可明顯改善DN的糖脂代謝，這提示降糖消渴顆粒確可實現(xiàn)治療糖尿病及其并發(fā)癥的目的。

臨床中我們可知DN患者可出現(xiàn)大量蛋白尿，這與患者腎小球足細胞的病變有關，此過程還存在多種相關蛋白因子受到破壞。根據(jù)腎臟的生理特性我們可知其具有選擇性濾過效應，是機體諸多蛋白復合物的關鍵屏障結構，上述蛋白復合物位于足細胞胞外間隙，彼此之間密切聯(lián)系，又存在相互排斥，但這種既聯(lián)系有排斥的關系維持細胞的正常生理結構[6-8]。在對不同組大鼠進行腎臟結構HE染色中我們發(fā)現(xiàn)，2組DN大鼠的腎臟結構均出現(xiàn)不同程度的的病理改變，主要表現(xiàn)在腎小球形態(tài)變化，變大且充血，存在不同程度的粘連，且其基底膜亦有明顯增厚，經(jīng)過降糖消渴顆粒干預后大鼠的腎臟形態(tài)學有了明顯改善，與正常對照組比較雖仍存在異常，但與未服用降糖消渴顆粒比較其病理表現(xiàn)有明顯逆轉。近年來諸多文獻證實糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中存在激活絲裂原活化蛋白激酶家族信號通路的激活，甚至不少研究人員視抑制此種激活是糖尿病的靶向，激活絲裂原活化蛋白激酶家族信號通路中JNK的主要通路之一，密切參與機體細胞凋亡、增殖等過程，JNK在一定條件下產(chǎn)生應激反應，導致JNK發(fā)生磷酸化，并予下游的轉錄因子相互作用，在根據(jù)轉錄的不同細胞因子類型調節(jié)凋亡程序[9-11]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)降糖消渴顆粒抑制JNK的磷酸化程度，這說明了降糖消渴顆粒通過抑制JNK信號通路的激活實現(xiàn)靶向治療目的，減少了腎臟組織細胞的凋亡，從而保護了腎臟組織。此外，我們還發(fā)現(xiàn)降糖消渴顆粒可增加GLP-1活性。2013年Hoche[12]對小鼠進行解剖檢測，結果顯示小鼠腎小球結構存在GLP-1蛋白，在沉默此基因后小鼠出現(xiàn)明顯的蛋白尿，且腎小球系膜也出現(xiàn)了擴張，因此學者推斷，GLP-1的分泌是腎臟維持正常功能的關鍵，在進一步的研究中，研究人員還發(fā)現(xiàn)GLP-1有抗纖維化效應[13-15]，據(jù)我們所知，DN的主要病理征即腎臟的纖維化，在本研究中我們亦通過形態(tài)學證實這一觀點，而GLP-1可抑制內皮細胞分化成成間充質細胞，從而減緩甚至逆轉纖維化進程。

總之，我們通過糖脂代謝指標、形態(tài)學以及分子生物指標證實降糖消渴顆粒可調節(jié)糖分、脂質代謝，發(fā)揮保護腎臟作用，其作用機制可能與抑制JNK信號通路，上調GLP-1有關。

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（2017-03-10收稿 責任編輯：徐穎）