黃瓜根際促生真菌的篩選及促生效應(yīng)研究

滕安娜 趙京嵐 王燕

摘要 [目的]篩選黃瓜根際促生真菌，并探索其促生效應(yīng)。[方法]以解磷、產(chǎn)IAA和拮抗黃瓜枯萎病菌能力為篩選標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定初篩菌株的多項(xiàng)促生能力；通過(guò)種子萌發(fā)和盆栽試驗(yàn)測(cè)定菌株對(duì)黃瓜的促生效應(yīng)；通過(guò)形態(tài)鑒定和rDNA-ITS序列分析對(duì)促生菌株進(jìn)行分類(lèi)學(xué)鑒定。[結(jié)果]從連作黃瓜根際土壤中分離到1株同時(shí)具解磷、產(chǎn)IAA和拮抗黃瓜枯萎的真菌，該菌株孢子懸浮液能有效促進(jìn)黃瓜種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。形態(tài)學(xué)和分類(lèi)學(xué)鑒定結(jié)果顯示該菌株為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。[結(jié)論]所篩選的促生真菌能有效改善黃瓜連作障礙，為開(kāi)發(fā)研制黃瓜專(zhuān)型促生制劑提供良好的種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞 連作障礙；根際促生真菌；哈茨木霉

中圖分類(lèi)號(hào) S642.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）06-0039-02

Screening of Plant Growth-promoting Rhizofungi and the Promoting Effects on Cucumber

TENG An-na1 ，ZHAO Jing-lan1，WANG Yan2

（1.Department of Biotechnology Engineering，Taishan Polytechnic，Taian，Shandong 271000；2.Dongying Entry-Exit Insperction and Quarantine Bureau，Dongying，Shandong 257000）

Abstract [Objective]To screen plant growth-promoting rhizo fungi and study the growth-promoting effect. [Method]The growth-promoting effects of screening rhizofungi were measured by the standard of the abilities of phosphate solubilization， production of indoleacetic acid （IAA） and antagonistic activity against Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum.Seeding germination and pot experiments were conducted to measure the growth-promoting effects on cucumber.The growth-promoting rhizofungi were classified and indentified by morphological and rDNA-ITS sequence analysis. [Result]One strain was isolated which had the abilities of phosphate solubilization， production of IAA and antagonistic activity against F. oxysporum f.sp.cucumerinum. The spore suspension of this strain could improve germination and promote cucumber seedling growth， which was indentified as Trichoderma harzianum by morphological and rDNA-ITS sequence analysis.[Conclusion]The isolated growth-promoting rhizofungi could solve the continuous cropping obstacles of cucumber and will be helpful for developing the specially microbial inoculants or bio-organic fertilizers of cucumber.

Key words Continuous cropping obstacles；Plant growth-promoting rhizofungi；Trichoderma harzianum

黃瓜是設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中的主要栽培作物，其連作障礙日益嚴(yán)重，土壤肥力下降，枯萎病發(fā)病嚴(yán)重，造成黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)下降。連作障礙已成為制約我國(guó)黃瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。

根際是由植物根系與土壤微生物之間相互作用形成的獨(dú)特圈帶，其中植物根際促生細(xì)菌（Plant growth-promoting rhizobacteria）研究較為廣泛，大量數(shù)據(jù)顯示，這類(lèi)促生菌一般具有固氮、解磷、釋鉀、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等能力或至少其中1種能力，可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量[1]。真菌作為土壤微生物群落的重要組成部分，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響，但目前對(duì)根際促生真菌（Plant growth-promoting rhizofungi）的研究和報(bào)道較少。

促生菌對(duì)植物有一定的種屬專(zhuān)一性和選擇性。為解決黃瓜連作障礙問(wèn)題，該研究從其根際土壤中篩選具有促生效應(yīng)的真菌，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具促生防病效果的根際真菌提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃瓜根際土壤采自泰山職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)習(xí)基地；黃瓜種子為新津研4號(hào)；病原菌為黃瓜枯萎病原真菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）。

1.2 促生真菌篩選

取10 g黃瓜根際土壤加入到裝有90 mL無(wú)菌水的三角瓶中，28 ℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，梯度稀釋后，分別取0.1 mL稀釋液涂布于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取菌落形態(tài)各異的真菌，純化后編號(hào)保存。

1.2.1 解磷能力測(cè)定。

將分離純化的菌株點(diǎn)接至含不溶性磷酸鹽的培養(yǎng)基中，通過(guò)透明圈試驗(yàn)，篩選出具備解磷能力的菌株[2]。解磷能力定量測(cè)定采用鉬酸銨比色法，以不接菌培養(yǎng)基中有效磷含量為對(duì)照[3]。

1.2.2 產(chǎn)IAA能力測(cè)定。

將分離純化后的菌株接種于液體查氏培養(yǎng)基中（含誘導(dǎo)物色氨酸0.5 g/L），用Salkowski試劑篩選出產(chǎn)IAA的菌株。用分光光度法定量檢測(cè)產(chǎn)IAA能力，以不添加誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中IAA含量為對(duì)照[4]。

1.2.3 抑菌能力測(cè)定。

將黃瓜枯萎病菌（提前2 d接種）和已分離純化的菌株接種至PDA培養(yǎng)基中，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)篩選出能拮抗黃瓜枯萎的菌株，并于顯微鏡下觀察菌絲體的作用方式。

1.3 種子萌發(fā)試驗(yàn)

將待測(cè)菌孢子懸浮液加入半固體MS培養(yǎng)基中至終濃度1×106個(gè)/mL 。精選大小一致、顆粒飽滿、無(wú)缺損的黃瓜種子，表面消毒后播于上述半固體MS培養(yǎng)基中，以無(wú)菌水為對(duì)照，36 h后測(cè)黃瓜萌發(fā)率，10 d后測(cè)黃瓜胚根生長(zhǎng)狀況[5]。

1.4 盆栽試驗(yàn)

待黃瓜幼苗兩葉一心時(shí)選取大小一致的植株，用待測(cè)菌孢子懸浮液（1×106個(gè)/mL）進(jìn)行灌根處理，以無(wú)菌水為對(duì)照，15 d后測(cè)量黃瓜幼苗的株高、地上鮮重以及植株葉片磷、硝態(tài)氮、葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素的含量[6]。

1.5 菌株鑒定

根據(jù)菌落和孢子形態(tài)特征及rDNA-ITS序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，采用NCBI的BLAST以及Clustalx1.83、MEGA5.1軟件進(jìn)行多重序列比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Bootstrap值=1 000）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel與SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 促生真菌篩選

通過(guò)初篩共獲得12株真菌，其中T3-5兼具解磷（圖1）和產(chǎn)IAA能力（圖2），并對(duì)黃瓜枯萎病菌有良好的拮抗作用和重寄生作用（圖3、4），將該菌株作為供試菌株用于種子萌發(fā)和盆栽試驗(yàn)。

2.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

T3-5孢子懸浮液可有效提高黃瓜種子萌發(fā)率并促進(jìn)胚根發(fā)育（圖5），與對(duì)照相比，黃瓜種子萌發(fā)率提高23.3%，胚根長(zhǎng)增加12.6%，側(cè)根原基數(shù)目增加26.2%。

2.3 盆栽試驗(yàn)

T3-5孢子懸浮液灌根處理15 d可促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)（圖6），株高、地上鮮重分別比CK增加 11.38%、38.47%，葉片磷含量、硝態(tài)氮含量、葉綠素a含量、葉綠素b含量、類(lèi)胡蘿卜素含量分別提高了19.86% 、12.72%、56.24%、21.23%、39.59%。

2.4 菌株鑒定

菌落暗綠色，背面不變色。孢子梗叢束疏松，瓶梗短，基部變細(xì)，中間膨大。分生孢子球形，短倒卵形。根據(jù)分子測(cè)序結(jié)果與該菌株相近的ITS 序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖6），該菌株與哈茨木霉（Trichoderma harzianum）位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一分支，并與木霉屬的其他種有所區(qū)別。

3 討論

黃瓜種植面積不斷擴(kuò)大，并實(shí)現(xiàn)周年生產(chǎn)，但其連作障礙日益凸顯，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要采用農(nóng)業(yè)和化學(xué)措施來(lái)緩解連作障礙問(wèn)題，但由于化肥、農(nóng)藥的大量使用對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染，因此生防菌的施用成為連作障礙防治研究熱點(diǎn)。該研究從黃瓜根際土壤中篩選出1株具有促生防病效果的哈茨木霉T3-5，擬為開(kāi)發(fā)研制黃瓜專(zhuān)型促生制劑提供良好的種質(zhì)資源。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，T3-5具有解磷、產(chǎn)IAA和拮抗黃瓜枯萎病菌能力，這與已報(bào)道的哈茨木霉特性相吻合。國(guó)內(nèi)外已有大量研究報(bào)道木霉屬菌株可以促進(jìn)植物種子萌發(fā)、植株生長(zhǎng)和開(kāi)花、提高作物產(chǎn)量等[7]，但對(duì)于木霉菌用于解決連作黃瓜障礙問(wèn)題研究較少。該研究所篩選菌株的孢子懸浮液能有效促進(jìn)連作黃瓜幼苗生長(zhǎng)，對(duì)于該菌株的促生效果、促生機(jī)制及菌肥的制備還有待進(jìn)一步研究探討。

參考文獻(xiàn)

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