光甘草定對單增李斯特菌生物被膜形成的影響

趙偉　宋歌

摘要：單增李斯特菌屬于典型的革蘭氏陽性致病菌，是一種嚴(yán)重的人畜共患食源性致病菌。由于生物被膜的形成使得對單增李斯特菌的防治變得更加困難。本試驗(yàn)首先將單增李斯特菌加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板恒溫培養(yǎng)48 h進(jìn)行生物被膜培養(yǎng)，然后分別加入終濃度為10 μg/ml、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL的光甘草定孵育后，于6 h后提取單增李斯特菌eDNA并測定其含量變化情況。同時(shí)利用結(jié)晶紫染色法觀察不同濃度的光甘草定作用2 h、4 h、6 h和8 h后單增李斯特菌生物被膜形成的影響情況。結(jié)果顯示光甘草定對單增李斯特菌eDNA和生物被膜形成均有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察光甘草定濃度下單增李斯特菌生物被膜的形成情況，為甘草抗菌能力的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用以及單增李斯特菌的防治提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：單增李斯特菌；生物被膜；光甘草定

中圖分類號：S 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：2096-3637（2017）06-0004-03

單增李斯特菌是一種人畜共患食源性病原菌，它主要以食物為傳染媒介，廣泛存在于自然界及各種食品中，且在4°C環(huán)境中仍可生長繁殖，可引起人、畜感染發(fā)病，死亡率高。食用了被單增李斯特菌污染的食物后可以引起李斯特菌病，李斯特菌中毒嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染。近年來，李斯特菌病在世界范圍內(nèi)都有發(fā)生，且發(fā)病具上升趨勢，引起國內(nèi)外廣泛重視。因此，單核細(xì)胞增生性李斯特菌不僅對畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要影響，而且對人們的健康帶來危害。

1 李斯特菌生物被膜

李斯特菌作為1種食源性疾病病原菌，因其分布廣泛、致病率致死率較高而惡名遠(yuǎn)揚(yáng)外，還因其會在食品、瓜果蔬菜等接觸表面吸附聚集分泌生物被膜，而對人類的清除防疫措施帶來了很大的麻煩。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，動態(tài)條件下，單增李斯特菌的生物被膜三維球形網(wǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，對理化因子、抗生素、殺菌劑等具有極強(qiáng)的抵抗力[1]。

許多研究證實(shí)了李斯特菌可以形成生物被膜，李燕杰等比較研究了銀染法、結(jié)晶紫染色法、掃描電鏡法3種不同方法定性觀察李斯特菌生物被膜的效果。研究表明，3種方法均可定性觀察李斯特菌生物被膜。在另一項(xiàng)研究中，李燕杰等采用微孔平板和結(jié)晶紫染色法觀察不同培養(yǎng)條件下單增李斯特菌生物被膜的形成與生長。研究表明，李斯特菌在35°C，中性略偏堿性條件下，TSB培養(yǎng)6～8 h可形成穩(wěn)定的生物被膜。單增李斯特菌的生物被膜主要分為胞外基質(zhì)和菌體，而胞外基質(zhì)又是由胞外DNA胞外蛋白和胞外多糖等組成[2]。單增李斯特菌生物被膜的形成受到胞外DNA胞外多糖、鞭毛糖蛋白、胞外結(jié)合蛋白和群感應(yīng)系統(tǒng)等的影響[3]。鞭毛在生物被膜的形成中起著關(guān)鍵的作用，介導(dǎo)運(yùn)動使浮游單增李斯特菌的游動、非活性物體表面的附著、單增李斯特菌的個(gè)體從載體表面的擴(kuò)散、與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用。鞭毛蛋白中的5種基因FlaR（鞭毛調(diào)節(jié)因子）、PrfA（正調(diào)控因子）、DegU（降解酶調(diào)節(jié)因子）、MogR（運(yùn)動基因調(diào)節(jié)因子）和GmaR（糖基轉(zhuǎn)移酶和運(yùn)動抑制子）。

有研究表明，胞外DNA與單增李斯特菌的最初粘附和早期形成有關(guān)[4]，主要是與胞外多糖結(jié)合后對生物被膜的形成造成影響單增李斯特菌染色后可觀察到細(xì)胞周圍存在致密的胞外多糖，目前對于胞外多糖和胞外結(jié)合蛋白對于單增李斯特菌的生物被膜的影響的研究不是很清楚，但是有研究發(fā)現(xiàn)，單增李斯特菌胞外蛋白在單增李斯特菌最初聚集到介質(zhì)表面起重要作用[5] 細(xì)菌群中細(xì)菌通過信息交流來感覺、整合、處理環(huán)境的現(xiàn)象稱為群體感應(yīng)。單增李斯特菌存在兩個(gè)群體感應(yīng)體系。為寡肽介導(dǎo)的 Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)和自誘導(dǎo)2（AI-2）LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)，Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)可直接正調(diào)控生物膜的形成，也可通過調(diào)控耐藥、毒力因子間接調(diào)控生物被膜的形成[6]。正因單增李斯特菌的致病率高、危害性大、易產(chǎn)生耐藥性、易在物體表面形成生物被膜，而對人類的生產(chǎn)生活帶來危害，為人類的對李斯特菌病預(yù)防和清理帶來危害。

2 研究的目的和意義

由于李斯特菌在自然界中廣泛存在，并可以形成生物被膜，使得李斯特菌對外界環(huán)境的抵抗力大大增強(qiáng)，且80%李斯特菌病的發(fā)生又是由生物被膜引起的。生物被膜引起的細(xì)菌多重耐藥性給臨床治療帶來了巨大的困難。而光甘草定（Glabridin）是中藥甘草的主要成分，是從藥用植物甘草根、莖中提取的一種具有高甜度、低熱量、安全無毒的有效活性成分，具有抗炎、抗變態(tài)反應(yīng)、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等作用，在各種疾病的臨床治療上取得確切療效。本研究通過觀察光甘草定在不同濃度下，對單增李斯特菌生物被膜的形成情況，以初步探討光甘草定對單增李斯特菌生物被膜的抗菌活性，為甘草抗菌能力的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用以及李斯特菌病的防控提供理論依據(jù)。

3 材料與方法

3.1 材料

3.1.1材料來源

光甘草定為洛陽藍(lán)冰貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。單增李斯特菌21634購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

3.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器

CO2培養(yǎng)箱（青島龍杰儀器公司）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、高壓滅菌鍋（購于上海三申）、溫箱（購于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、冰箱（購于揚(yáng)子集團(tuán)）、超凈工作臺（購于蘇州爭化設(shè)備公司）、電子天平（購于北京賽多利斯天平有限公司）、THZ-92C氣浴恒溫振蕩器 數(shù)碼鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9070 MBE上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、分光光度計(jì)、平皿若干、1.5mL EP管、10 μL槍頭若干、200 μL槍頭、1 mL槍頭、1.5 mL EP管架、細(xì)菌培養(yǎng)瓶若干、大小瓶塞若干、酒精燈、電磁爐、剪刀、鑷子、接種環(huán)、錐形瓶若干、量筒、250 mL試劑瓶若干、100mL試劑瓶若干、一次性手套，醫(yī)用膠帶、脫脂棉、封口薄膜等。

3.2 主要試劑的配制

（1） LB液體培養(yǎng)基：NaCl 1.0 g、蛋白胨 1.0 g和酵母提取物0.5 g充分溶解于蒸餾水100 mL，120°C高壓滅菌30 min，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（2）10 mg/mL光甘草定溶液：0.03 g光甘草定充分溶解于3 mL PBS中。

（3）結(jié)晶紫溶液：稱取0.04 g結(jié)晶紫溶解10 mL蒸餾水。

（4）0.5M EDTA：稱取186.1g EDTA-Na2·2H2O，置于燒杯中，加入800 mL蒸餾水，用NaOH調(diào)pH至8.0，然后用蒸餾水定容到1L，滅菌后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3實(shí)驗(yàn)方法

3.3.1 細(xì)菌復(fù)蘇

把超凈工作臺的紫外燈打開，將試管、LB液體培養(yǎng)基放入工作臺，消毒滅菌20～30 min，然后點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁完成實(shí)驗(yàn)，消毒灼燒空試管口，消毒培養(yǎng)液瓶口、到入1/3左右。從-80°C冰箱取出單增李斯特菌，接種環(huán)灼燒放涼后沾菌，加入試管。用過的接菌環(huán)、試管蓋上紙蓋子封口，用報(bào)紙包好，放入THZ-92C氣浴恒溫震蕩器過夜（37°C 12 h），整理超凈工作臺。

3.3.2 菌液轉(zhuǎn)接與生物被膜培養(yǎng)

將復(fù)蘇好的細(xì)菌從恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱內(nèi)取出，觀察小試管內(nèi)的細(xì)菌的情況，細(xì)菌的形態(tài)，色澤，透明度等，在凈化操作臺中，取錐形瓶加入3 mL菌液。再加入27 mL新鮮LB液體培養(yǎng)液，用200 μL移液器加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，用保鮮膜纏繞，確保96孔板上下兩個(gè)半殼之間的空隙被密封，在底部放置濕潤的毛巾，置于特定的容器內(nèi)，放在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h。

3.3.3 甘草成分對單增李斯特菌生物被膜eDNA的影響

按上述方法培養(yǎng)生物被膜，用PBS將光甘草定配制成濃度為10 mg/mL。往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入光甘草定使終濃度為10 μg/ml、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，同時(shí)做空白對照孔，每孔重復(fù)3次，作用6 h后按Rice等介紹的方法提取并檢測eDNA。

（1）加入0.5M EDTA預(yù)冷1 h；

（2）用700 μL 50 mM TEN緩沖液重懸生物被膜，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管中，4°C，18000 rpm離心5 min；

（3）將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，加入300 μL TE緩沖液，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25： 24： 1）；

（4）4°C，12000 rpm離心10 min，取上清，用氯仿：異戊醇（24：1）再次萃取；

（5）取水相，加入3倍體積的冷乙醇和1/10體積的醋酸鈉，混勻后-20°C過夜；

（6）4°C，18000 rpm離心20 min，去上清，用70%冷乙醇洗滌，空氣中風(fēng)干后，加入20 μL TE緩沖液溶解；用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測A260/A280的吸光度比。

3.3.4 甘草各成分對單增李斯特菌生物被膜形成的影響

按上述方法培養(yǎng)單增李斯特菌生物被膜。用PBS將光甘草定配制成濃度為10 mg/mL。往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板加入光甘草定使終濃度為10 μg/ml、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL和200 μg/mL，同時(shí)做空白對照孔，每孔重復(fù)3次，分別作用2 h、4 h、6 h和8 h后用PBS洗去浮游菌，洗3次，加入0.04%結(jié)晶紫染色30 min，用自來水洗去浮色，待膜干后，每孔用200 μL乙醇溶解，于570 nm波長下檢測，記錄結(jié)果。

4 結(jié)果及分析

4.1 對單增李斯特菌生物被膜eDNA的影響

eDNA的相對表達(dá)量就是對單增李斯特菌生物被膜形成多少的直接反映。圖1可以看出，光甘草定對單增李斯特菌生物被膜存在抑制作用，且隨著光甘草定濃度的增加，對單增李斯特菌生物被膜的抑制作用逐漸增強(qiáng)（圖1）。

4.2 對單增李斯特菌生物被膜形成的影響

從圖2可以看出，光甘草定對單增李斯特菌的生物被膜形成具有抑制作用。隨著光甘草定濃度增大，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)明顯在減小，說明光甘草定濃度增大對單增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用明顯增強(qiáng)。同時(shí)在某一濃度時(shí)，隨著時(shí)間的延長，光甘草定對單增李斯特菌生物被膜形成的抑制作用也有所增強(qiáng)。

5 討論

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，任何實(shí)驗(yàn)濃度的光甘草定均表現(xiàn)出的是對單增李斯特菌生物被膜的抑制作用。通過數(shù)據(jù)的平穩(wěn)降低和曲線的持續(xù)下降，表明光甘草定對生物被膜有持續(xù)的影響作用，并且還隨著濃度的增加，抑制作用還越來越強(qiáng)。進(jìn)過近年的實(shí)驗(yàn)研究成果觀察，抑制的機(jī)理可能是影響可細(xì)菌的生長。有實(shí)驗(yàn)證明，光甘草定對酪氨酸酶的活性有一定的影響作用。因此有可能是在細(xì)菌的新陳代謝階段，某一種或者某幾種酶活性受到干擾，導(dǎo)致細(xì)菌生長受阻，因此生物被膜的形成被影響。也有可能是的結(jié)構(gòu)到破壞。導(dǎo)致細(xì)菌無法完成特定的生理過程，因此無法完成正常的生物被膜的構(gòu)建。也有很多實(shí)驗(yàn)證明光甘草定具有一定程度的抗菌和抗癌作用。因此光甘草定可能還有其他的影響生物被膜形成的機(jī)理。

6 結(jié)論

10～200 μg/mL光甘草定隨著濃度的增加對單增李斯特菌生物被膜的抑制作用增強(qiáng)，且隨著作用時(shí)間延長，抑制作用增強(qiáng)。

參考文獻(xiàn)

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