一種E. coli—Free的酵母同源重組系統(tǒng)穩(wěn)定快速構建PLDMV侵染性克隆的新方法

庹德財 沈文濤 言普 黎小瑛 周鵬

摘 要 侵染性克隆是研究病毒的重要工具，而偏大的病毒基因組及其在大腸桿菌中的不穩(wěn)定給構建侵染性克隆造成很大困難。通常采用插入內(nèi)含子和酵母同源重組等方式可以獲得穩(wěn)定克隆，但本實驗最初利用酵母同源重組系統(tǒng)并未成功構建番木瓜畸形花葉病毒（PLDMV）的侵染性克隆。經(jīng)研究證實，該不穩(wěn)定現(xiàn)象確實存在于大腸桿菌中，而非酵母和農(nóng)桿菌細胞。通過改良酵母同源重組方法，成功構建了有/無內(nèi)含子intron 2的PLDMV侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2，農(nóng)桿菌注射接種番木瓜均發(fā)病，侵染效率達64.7%～69.7%。本研究通過酵母同源重組質(zhì)粒直接轉化農(nóng)桿菌，建立了一種10 d內(nèi)即可穩(wěn)定快速構建PLDMV侵染性克隆的E. coli-Free酵母同源重組新方法。該方法對其他在大腸桿菌中不穩(wěn)定的植物病毒侵染性克隆的構建具有重要意義。

關鍵詞 酵母同源重組；番木瓜畸形花葉病毒；侵染性克隆；不穩(wěn)定性

中圖分類號 Q78 文獻標識碼 A

A Novel E. coli-Free Method for the Rapid Construction of

Full-Length cDNA Infectious Clone of Papaya leaf distortion mosaic

virus（PLDMV）by Yeast Homologous Recombination System

TUO Decai， SHEN Wentao， YAN Pu， LI Xiaoying， ZHOU Peng*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Infectious full-length clone provides an important research tool for further study of the basic viral biology and pathogenic mechanisms. However， many large viral genomes have been proven difficult to assemble and propagate in Escherichia coli（E. coli）. Many studies have reported that the insertion of introns into viral genome or using yeast homologous recombination method can facilitate the amplification of infectious full-length clones in E. coli， but we did not construct successfully full-length cDNA infectious clones of Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）by yeast homologous recombination system in this initial work. In this study， the unstable phenomenon have been proven only occurred in E. coli， but not in yeast and agrobacterium. Then two types of PLDMV infectious clones were successfully constructed with/without intron 2 by improved yeast homologous recombination method， named p35S-FL and p35S-FL-In2， respectively. Both of the agro-inoculated papaya displayed systemic infections and higher infection efficiency（64.7%-69.7%）. In this work， in order to avoid instability in E. coli， a novel E. coli-free method for the rapid construction of full-length cDNA infectious clone of PLDMV was developed by yeast homologous recombination system in 10 days， and should have broad applications， in particular for the study of highly unstable plant viruses in bacterium.

Key words Yeast homologous recombination； Papaya leaf distortion mosaic virus（PLDMV）； infectious clone； instability

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.019

番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf distortion mosaic virus， PLDMV）屬于馬鈴薯Y病毒科馬鈴薯Y病毒屬病毒，是一種新的威脅番木瓜種植業(yè)的病毒病害，近年來發(fā)病率逐年遞增，且存在向全球蔓延的趨勢[1-2]。PLDMV是單分體正義（+）單鏈ssRNA線狀病毒，病毒顆粒平均長約750～825 nm[3]。PLDMV基因組由約10 153個核苷酸組成（不含3′端poly A），5′端和3′端各有1個非編碼區(qū)，包含1個大的開放閱讀框（ORF）和1個小的ORF（pipo），大的ORF編碼3 269個氨基酸的多聚蛋白，經(jīng)多聚蛋白自身的蛋白酶水解加工產(chǎn)生10個成熟蛋白（P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP）[1]。目前，有關PLDMV基因功能、致病機理、傳播媒介、寄主范圍等研究較少，從而使PLDMV的防治面臨巨大困難。

近年來，隨著高通量測序技術的發(fā)展，人類發(fā)現(xiàn)和鑒定新病毒病原的能力得到巨大提升。例如，2009～2015年，研究者們已相繼從植物上新發(fā)現(xiàn)4種類病毒，49種RNA病毒和DNA病毒[4]。為此，需迫切開展新病毒的基因功能、病毒與宿主、病毒與傳播媒介互作等相關研究工作，而病毒侵染性克隆作為上述病毒研究的必備工具，其構建逐漸發(fā)展為病毒研究實驗室的標準實驗技能，也成為限制病毒研究的關鍵因素[5]。雖然目前構建侵染性克隆的技術方法已取得較大進步，但其構建仍然耗時耗力，還沒有一種通用的能適合所有病毒的方法，尤其是對基因組較大的病毒的克隆，而且病毒克隆在大腸桿菌（Escherichia coli， E. coli）中普遍存在的不穩(wěn)定性問題[6-8]，導致侵染性克隆的構建面臨巨大挑戰(zhàn)和困難。為了提高病毒基因組序列克隆在E. coli中的穩(wěn)定性，有采用低拷貝載體[9-10]、降低培養(yǎng)溫度[11]、接種前進行體外連接[12]、插入內(nèi)含子[6-7， 13-15]及酵母同源重組[14， 16-18]等方法和策略。目前，后2種方法可能是應用較多且最有效的方式。本研究室在之前利用In-Fusion法構建體外轉錄的PLDMV全長cDNA侵染性克隆時發(fā)生缺失、突變、重組等不穩(wěn)定現(xiàn)象，通過插入內(nèi)含子的方式獲得其在E. coli中穩(wěn)定的克隆[19]。但插入內(nèi)含子的方法可能受病毒種類、插入位點、內(nèi)含子種類及數(shù)量等的影響，從而使其應用受到限制。而酵母同源重組可能是目前大片段DNA體內(nèi)拼接克隆最強大的分子克隆技術，Gibson等[20]報道了一步法可將25個重疊DNA大片段在酵母細胞中成功拼接獲得完整的支原體基因組。由此可見，酵母重組方法完全可以滿足病毒學研究的需要，但目前利用酵母同源重組系統(tǒng)構建病毒侵染性克隆的策略，都是將病毒全長基因組序列與酵母-大腸桿菌穿梭載體或者酵母-大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭載體經(jīng)酵母同源重組后，再轉化到大腸桿菌中進行復制、增殖，由于病毒序列可能對大腸桿菌細胞產(chǎn)生毒性作用，從而仍然會導致病毒克隆在E. coli中的極不穩(wěn)定現(xiàn)象。因此，本研究為了解決病毒序列克隆在E. coli中不穩(wěn)定性，通過對酵母同源重組系統(tǒng)方法進行改進和優(yōu)化，避開E. coli，建立了不轉化大腸桿菌（E. coli-Free）的酵母同源重組系統(tǒng)，并成功構建了適用于農(nóng)桿菌注射接種的PLDMV全長cDNA侵染性克隆。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 番木瓜畸形花葉病毒海南分離物（PLDMV-DF）由本實驗室分離保存，并完成其全長基因組序列測定（GenBank登錄號：JX974555）[1]；PLDMV-DF的體外轉錄侵染性克隆pT7-PLDMV-In2本實驗室已構建保存[19]。

1.1.2 試劑 普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒、E. coli HST08 Premium化學感受態(tài)細胞購自TaKaRa公司；2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）、EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix、Trans5α化學感受態(tài)細胞、Trans10化學感受態(tài)細胞和Trans1-T1化學感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司；Trizol、Stbl3化學感受態(tài)細胞購自Invitrogen公司；酵母質(zhì)粒提取試劑盒Yeast Plasmid Mini Kit購自OMEGA公司；Phusion超保真DNA聚合酶購自NEB公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 載體及菌株 用于酵母同源重組系統(tǒng)的酵母-大腸桿菌穿梭載體Yeast-pBS70T、雙元載體pBIN61、酵母菌株YPH501和農(nóng)桿菌C58C1菌株均由法國Thierry Candresse實驗室惠贈[18]。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據(jù)PLDMV-DF的全長基因組序列，參考Youssef等[18]文獻中報道的酵母同源重組的方法，利用Vector NTI Advance 11軟件設計本實驗所需引物（表1）。引物合成和測序均由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2.2 酵母同源重組構建體內(nèi)轉錄的PLDMV-DF侵染性克隆 為了驗證在酵母同源重組系統(tǒng)中，PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆分別在酵母、大腸桿菌和農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性，本實驗采取在第3 709 nt位點插入內(nèi)含子intron 2和不插入內(nèi)含子兩種方式構建適用農(nóng)桿菌接種的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2（圖1）。

（1）無內(nèi)含子的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL的構建。以本實驗室構建PLDMV-DF體外轉錄侵染性克隆時獲得的第4 998 nt位腺苷酸發(fā)生缺失突變的質(zhì)粒pT7-PLDMV4[19]為模板，分別用引物對PLDPCR1F/PLD5020R和PLD4991F/FLPLD3進行PCR擴增病毒基因片段1F和1R；用引物對PLDPCR2F/PCR2R和PCR3F/PCR3R分別從質(zhì)粒pBin61上PCR擴增載體片段2和3；用引物對PCR4F/PLDPCR4R從質(zhì)粒Yeast-pBS70T上PCR擴增載體片段4，本研究中用于載體構建的PCR反應均使用Phusion超保真DNA聚合酶。PCR產(chǎn)物用0.8%普通瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并回收其目的片段。將5個具有25～32 bp重疊區(qū)的DNA片段1F、1R、2、3和4用醋酸鋰法化學轉化自制的酵母YPH501感受態(tài)細胞，在色氨酸缺陷型的SD平板上篩選。后續(xù)的克隆鑒定時，采取以下2種方法：

方法一（圖2-A），主要是參照Youssef等[18]文獻中報道的方法，基本操作流程是通過收集SD缺陷型平板上生長的所有酵母菌落，并提取混合菌落的酵母質(zhì)粒，然后轉化Trans5α、Trans10、Trans1-T1、Stbl3和E. coli HST08 Premium化學感受態(tài)細胞，比較其生長情況及在不同大腸桿菌中的穩(wěn)定性，轉化E. coli后進行PCR和測序鑒定，測序結果正確的克隆電擊轉化農(nóng)桿菌C58C1感受態(tài)細胞并直接進行侵染性分析。

方法二（圖2-B），是對Youssef等[18]文獻中方法的改進和優(yōu)化，總體流程是經(jīng)酵母同源重組后，為了驗證PLDMV-DF全長克隆在酵母中的穩(wěn)定性，先菌液PCR、質(zhì)粒PCR和測序鑒定出酵母的陽性單克隆，再用酵母質(zhì)粒直接轉化農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，然后鑒定出陽性農(nóng)桿菌克隆用于后續(xù)侵染性分析，關鍵是不轉化E. coli這一步驟。首先，從轉化的酵母平板上挑取單菌落培養(yǎng)后，用病毒5′端引物對pldmv550F/pldmv1700R進行菌液PCR檢測，然后對檢測出的陽性克隆提取酵母質(zhì)粒，再用擴增病毒全長基因組的引物對pldmv1F/pldmv3R進行質(zhì)粒PCR鑒定，并對酵母質(zhì)粒進行測序分析。由于酵母質(zhì)粒拷貝數(shù)低，需用約50～100 mL的酵母菌液抽提質(zhì)粒，然后將質(zhì)粒用乙醇沉淀濃縮后送公司測序（測通）。測序正確的克隆，直接用濃縮后的酵母質(zhì)粒電擊轉化農(nóng)桿菌C58C1感受態(tài)細胞，轉化后在含利福平、卡那霉素和慶大霉素的LB平板上進行篩選。從轉化農(nóng)桿菌的平板上挑取單菌落進行PCR和測序鑒定，農(nóng)桿菌菌液PCR和質(zhì)粒PCR鑒定方法同前面酵母克隆的鑒定，農(nóng)桿菌質(zhì)粒的提取使用大腸桿菌質(zhì)粒提取試劑盒。為了驗證病毒序列在農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性，對質(zhì)粒PCR鑒定正確的克隆進行測序分析。由于農(nóng)桿菌中質(zhì)粒的拷貝數(shù)很低，需大量抽提農(nóng)桿菌質(zhì)粒后用乙醇濃縮沉淀，然后進行測序分析。測序正確的克隆即可進行下一步接種侵染性分析實驗。

（2）插入內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL-In2的構建。以已構建含內(nèi)含子intron 2的體外轉錄PLDMV-DF侵染性克隆pT7-PLDMV-In2[19]為模板，用引物對PLDPCR1F/FLPLD3擴增含intron 2的PLDMV-DF全長基因組片段1。將片段1和前面構建克隆p35S-FL時獲得的3個載體片段（2、3和4）共同轉化酵母YPH501感受態(tài)細胞進行酵母重組（方法同前）。后續(xù)的克隆鑒定時，也采用2種方法：為了驗證插入內(nèi)含子是否在E. coli中穩(wěn)定，第1種方法采用與前面方法一相同（圖2-A），但僅轉化E. coli HST08 Premium感受態(tài)細胞；第2種方法是對前面方法二的優(yōu)化（圖2-C），根據(jù)前面實驗結果，PLDMV-DF全長cDNA克隆在酵母、農(nóng)桿菌中較穩(wěn)定，為了省去繁瑣的酵母、農(nóng)桿菌克隆鑒定過程，利用酵母混合質(zhì)粒直接轉化農(nóng)桿菌，農(nóng)桿菌克隆經(jīng)菌液PCR、質(zhì)粒PCR或測序鑒定正確后即可用于后續(xù)接種實驗。使用內(nèi)含子intron 2插入位點兩端的引物pldmv3600F/pldmv4444R進行菌液PCR檢測；質(zhì)粒PCR鑒定同上；對農(nóng)桿菌質(zhì)粒用引物對PLDPCR1F/PLD5020R和PLD4991F/FLPLD3將病毒全長基因組分成2個大片段PCR擴增，然后進行PCR產(chǎn)物測序，測序正確的克隆用于接種番木瓜。

1.2.3 PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL和p35S-FL-In2的侵染性分析 農(nóng)桿菌注射接種的方法主要參考Youssef等[18]文獻中報道的方法，接種生長至20～30 cm番木瓜的第3、4片葉（葉片長約1 cm為第1片葉）的下表皮。接種后的番木瓜苗置于25 ℃黑暗8 h和28 ℃光照16 h的溫室條件下生長，每周觀察其病癥發(fā)生情況，在接種第20、40、60天，用數(shù)碼相機拍照。用PLDMV-DF感染的番木瓜病葉摩擦接種健康番木瓜植株作為陽性對照組，陰性對照組為注射接種含空載體pBIN61的農(nóng)桿菌，每個處理組至少接種10～12株番木瓜植株，進行3次重復實驗。

注射接種實驗的第60天，取新長出的第2片或第3片葉約50 mg，用TRizol法提取植物總RNA，用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈，進行RT-PCR檢測。每株苗用引物對pldmv550F/pldmv1700R、pldmv3600F/pldmv4444R分別對PLDMV基因組的5′端P1基因和部分P3及部分CI基因序列進行RT-PCR檢測，引物對pldmv3600F/pldmv4444R用于檢測PLDMV基因組的第3 709 nt位點是否還含有插入的內(nèi)含子intron 2序列，并對部分樣品的RT-PCR擴增產(chǎn)物送公司進行序列測定分析。

2 結果與分析

2.1 無內(nèi)含子的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL的構建

PCR擴增獲得用于酵母同源重組的2個病毒基因組片段1F、1R和3個載體片段2、3、4（圖3-B），以上5個DNA片段經(jīng)酵母同源重組后（圖3-A）。當采取方法一時（圖2-A），混合酵母質(zhì)粒分別轉化Trans5α、Trans10、Trans1-T1、Stbl3和E. coli HST08 Premium化學感受態(tài)細胞，各平板的生長情況與筆者之前構建其體外轉錄侵染性克隆類似。各轉化平板菌落生長較慢，30 °C條件下需要培養(yǎng)24～48 h才可見菌落長出，菌落數(shù)達40～100個。經(jīng)菌液PCR發(fā)現(xiàn)，插入到載體上的PLDMV-DF全長基因組序列均發(fā)生不同程度的DNA片段缺失、重組、突變等不穩(wěn)定現(xiàn)象（結果未提供）。結果從轉化Trans5α、Trans10、Trans1-T1、Stbl3這4種感受態(tài)細胞的平板上未鑒定出含有PLDMV-DF全長cDNA插入片段的克隆，而從轉化E. coli HST08 Premium感受態(tài)細胞的平板挑取40個克隆，菌液PCR鑒定出10個克隆含有PLDMV-DF全長基因組插入片段，但隨機挑選其中5個克隆進行測序分析，發(fā)現(xiàn)病毒PLDMV-DF全長基因組序列均發(fā)生點突變或堿基缺失突變（結果未提供）。結果表明，參照Youssef等[18]文獻中報道的方法，酵母重組后轉化E. coli很難獲得正確的PLDMV-DF全長cDNA克隆。同時也表明，E. coli HST08 Premium感受態(tài)細胞可能比其他4種感受態(tài)更適合較長的病毒基因序列的克隆。由于獲得的克隆均有突變，故沒有進一步將這些質(zhì)粒轉化農(nóng)桿菌用于后續(xù)侵染性分析實驗。

以上實驗結果和以前構建PLDMV-DF體外轉錄侵染性克隆pT7-PLDMV[19]的結果均表明，這種不穩(wěn)定現(xiàn)象可能發(fā)生在E. coli中，因此，筆者嘗試避免轉化E. coli，酵母同源重組后直接轉化農(nóng)桿菌。同時為了探究PLDMV-DF全長基因組序列在酵母和農(nóng)桿菌中的穩(wěn)定性，從而分別對酵母重組和農(nóng)桿菌轉化后的質(zhì)粒進行序列測定。本實驗通過對酵母同源重組系統(tǒng)進行改進和優(yōu)化，當采用改進后的方法二時（圖2-B），對轉化的酵母平板進行單克隆鑒定，54個單克隆經(jīng)菌液PCR初步鑒定出3個克隆可能為陽性克?。ńY果未提供），經(jīng)質(zhì)粒PCR和質(zhì)粒測序鑒定，這3個克隆的測序結果完全正確（結果未提供）。結果表明PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆在酵母細胞中相對穩(wěn)定，不穩(wěn)定現(xiàn)象主要發(fā)生在E. coli細胞中。挑選其中1個測序正確克隆的酵母質(zhì)粒直接轉化農(nóng)桿菌C58C1，獲得42個克隆，經(jīng)初步菌液PCR鑒定出3個克隆可能為陽性克隆（結果未提供），其中1個克隆搖菌失敗，另外2個克隆提取質(zhì)粒后PCR鑒定和測序均正確（結果未提供），即利用改良的酵母同源重組系統(tǒng)成功構建了無內(nèi)含子的PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆p35S-FL，并將這2個克隆用于后續(xù)侵染性分析且分別命名為：p35S-FL39-12和p35S-FL39-34。

2.2 插入內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL-In2的構建

從pT7-FL-In2質(zhì)粒上經(jīng)PCR擴增獲得在第3 709 nt位點插入內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF全長基因組片段1（圖4-B），片段1與前面已獲得的片段2、3、4轉化酵母YPH501進行酵母同源重組（圖4-A），獲得較多的酵母菌落（超過100個克隆），收集所有菌落提取酵母混合質(zhì)粒。

當采用第1種方法時，酵母混合質(zhì)粒轉化E.coli HST08 Premium長出多達100～200個克隆，隨機挑取22個克隆經(jīng)菌液PCR鑒定均可能為陽性克隆（表2），對其中1個克隆測序，結果正確（結果未提供）。測序正確的克隆轉化農(nóng)桿菌后隨機挑取28個克隆經(jīng)菌液PCR鑒定出27個克隆可能為陽性克?。ū?），對其中1個克隆提取質(zhì)粒后進行質(zhì)粒PCR和測序鑒定均正確（表2）。

當采用第2種方法時，利用酵母混合質(zhì)粒直接轉化農(nóng)桿菌隨機挑取24個克隆經(jīng)菌液PCR鑒定出22個克隆可能為陽性克?。ū?），對其中1個克隆提取質(zhì)粒后進行質(zhì)粒PCR和測序鑒定，結果均正確（表2）。即利用原酵母同源重組系統(tǒng)和改良后的系統(tǒng)都成功構建了適用于農(nóng)桿菌接種的含有內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆p35S-FL-In2，并將以上2種方法構建獲得的測序正確的2個克隆用于后續(xù)侵染性分析且分別命名為：p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3。

2.3 體內(nèi)轉錄的PLDMV-DF侵染性克隆注射接種番木瓜的病癥表現(xiàn)

體內(nèi)轉錄的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL（農(nóng)桿菌克隆p35S-FL39-12和p35S-FL39-34）和含內(nèi)含子intron 2的PLDMV-DF侵染性克隆p35S-FL-In2（農(nóng)桿菌克隆p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3）農(nóng)桿菌注射接種番木瓜的結果表明：克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34、p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3接種番木瓜植株的癥狀表現(xiàn)與用PLDMV-DF感染的番木瓜病葉接種的陽性對照組一致，在接種20 d后，葉片出現(xiàn)輕微的花葉，葉脈開始褪綠及黃化，以及葉片產(chǎn)生黃綠相間的嵌紋斑（圖5-A）。在接種40 d后，葉片逐漸出現(xiàn)皺縮畸形，葉片上有綠島（green-island）形成（圖5-B）。在接種60 d后，隨著癥狀的嚴重，會出現(xiàn)完全畸形葉、雞爪形，有時會出現(xiàn)葉片完全退化，僅剩下主葉脈的絲狀葉（圖5-C）。而接種轉化空載體pBIN61的農(nóng)桿菌陰性對照組在接種60 d后仍未表現(xiàn)出任何病癥（圖5-A、C）。

2.4 體內(nèi)轉錄的PLDMV-DF侵染性克隆注射接種番木瓜后的RT-PCR檢測及侵染效率分析

接種60 d后，對接種過的番木瓜植株分別用PLDMV-DF基因組2個基因片段引物進行RT-PCR檢測，4個侵染性克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34、p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3與用番木瓜病葉接種的陽性對照組都能檢測出1 151 bp和845 bp的DNA條帶（圖6，泳道1～18），而轉化空載體pBIN61的農(nóng)桿菌注射接種的陰性對照組未檢測到（圖6，泳道19～20），表明注射接種含空載體的農(nóng)桿菌不能侵染番木瓜植株。而同時RT-PCR產(chǎn)物測序結果顯示，均為PLDMV-DF病毒基因組序列，而且在第3 709 nt位點無內(nèi)含子intron 2插入，表明克隆p35S-FL-In22-1和p35S-FL-In22-3在侵染后，利用番木瓜宿主系統(tǒng)可以識別并剪接插入在PLDMV-DF基因組第3 709 nt位點的內(nèi)含子intron 2，使子代病毒不再含有內(nèi)含子序列。經(jīng)病癥觀察、發(fā)病情況統(tǒng)計及RT-PCR檢測，結果表明，本實驗中利用改良的酵母重組系統(tǒng)構建的4個適用農(nóng)桿菌注射接種的體內(nèi)轉錄侵染性克隆p35S-FL39-12、p35S-FL39-34、p35S-FL-In22-1、p35S-FL-In22-3都具有侵染性，能成功侵染番木瓜，侵染效率達64.7%～69.7%，且病癥觀察的發(fā)病率與RT-PCR檢測結果一致（表3）。

3 討論

病毒侵染性克隆是研究病毒基因功能和病毒與宿主互作的重要工具，無論是研究植物病毒還是動物病毒，無論是DNA病毒還是RNA病毒，其侵染性克隆的構建已發(fā)展為病毒研究實驗室的標準實驗技能，也成為開展病毒深入研究工作的限制因素[5]，而病毒全長基因組克隆在E. coli中存在的不穩(wěn)定性問題是病毒侵染性克隆構建面臨的最大困難和挑戰(zhàn)[6-8]。為了克服病毒基因序列在E. coli中的不穩(wěn)定性，在侵染性克隆構建時通常采用低拷貝載體[9-10]、降低培養(yǎng)溫度[11]、接種前進行體外連接[12]、插入內(nèi)含子[6-7， 13-15]及酵母同源重組[14， 16-18]等方式，但還沒有一種能適合所有病毒的通用方法。筆者也通過在P3基因插入內(nèi)含子，利用In-Fusion法成功構建了體外轉錄的PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆[19]，但插入內(nèi)含子的方法可能受病毒種類、插入位點、內(nèi)含子種類及數(shù)量等的影響，從而使其應用受到限制[19]。而且體外轉錄的侵染性克隆需要昂貴的體外轉錄試劑，不便于后續(xù)研究應用。于是，本研究嘗試利用酵母同源重組系統(tǒng)快速構建適用于農(nóng)桿菌注射接種的體內(nèi)轉錄的PLDMV-DF侵染性克隆。但研究發(fā)現(xiàn)，采用原酵母同源重組系統(tǒng)在酵母細胞中完成重組拼接后，再轉化E. coli細胞仍然存在不穩(wěn)定現(xiàn)象，并不能獲得正確的克隆。而在PLDMV-DF的P3基因插入內(nèi)含子時，經(jīng)酵母重組后轉化E. coli能獲得測序正確的克隆，而且酵母重組后的克隆和轉化農(nóng)桿菌后的克隆測序結果表明，不穩(wěn)定現(xiàn)象僅發(fā)生在E. coli中，而非酵母細胞和農(nóng)桿菌細胞。但Youssef等[18]利用原酵母同源重組系統(tǒng)也成功獲得適用農(nóng)桿菌接種的蘋果褪綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus， ACLSV）的體內(nèi)轉錄侵染性克隆，可能不同的病毒在E. coli中的穩(wěn)定性存在著差異，不過從36個經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切正確的E. coli克隆中僅鑒定出1個有侵染性的克隆，表明ACLSV克隆在E. coli細胞同樣存在著不穩(wěn)定性。因此，本研究為了克服病毒基因組序列克隆在E. coli中的不穩(wěn)定性，通過對原酵母同源重組系統(tǒng)進行改良，采用避免轉化E. coli細胞的策略，將酵母同源重組獲得的混合酵母質(zhì)粒直接轉化農(nóng)桿菌（圖2-C），10 d內(nèi)即可快速、便捷的構建穩(wěn)定的適用于農(nóng)桿菌注射接種的PLDMV-DF全長cDNA侵染性克隆。同時，該構建策略為其他在E. coli細胞中不穩(wěn)定的植物病毒侵染性克隆的構建提供了一種有效的新方法。

參考文獻

[1] Tuo D， Shen W， Yan P， et al. Complete genome sequence of an isolate of papaya leaf distortion mosaic virus from commercialized PRSV-resistant transgenic papaya in China[J]. Acta Virologica， 2013， 57（4）： 452-455.

[2] Tuo D， Shen W， Yang Y， et al. Development and validation of a multiplex reverse transcription PCR assay for simultaneous detection of three papaya viruses[J]. Viruses， 2014， 6（10）： 3 893-3 906.

[3] Kawano S and Yonaha T. The occurrence of papaya leaf-distortion mosaic virus in Okinawa[J]. Technical Bulletin of FFTC， 1992， 132： 13-23.

[4] Wu Q， Ding S W， Zhang Y， et al. Identification of viruses and viroids by next-generation sequencing and homology-dependent and homology-independent algorithms[J]. Annual Review of Phytopathology， 2015， 53： 425-444.

[5] Nagyová A， Subr Z. Infectious full-length clones of plant viruses and their use for construction of viral vectors[J]. Acta virologica， 2007， 51（4）： 223-237.

[6] Gao R， Tian Y P， Wang J， et al. Construction of an infectious cDNA clone and gene expression vector of Tobacco vein banding mosaic virus（genus Potyvirus）[J]. Virus Research， 2012， 169（1）： 276-281.

[7] Lopez-Moya J J， Garcia J A. Construction of a stable and highly infectious intron-containing cDNA clone of plum pox potyvirus and its use to infect plants by particle bombardment[J]. Virus Research， 2000， 68（2）： 99-107.

[8] Yamshchikov V， Mishin V， Cominelli F. A new strategy in design of（+）RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli[J]. Virology， 2001， 281（2）： 272-280.

[9] Flasinski S， Gunasinghe U， Gonzales R A， et al. The cDNA sequence and infectious transcripts of peanut stripe virus[J]. Gene， 1996， 171（2）： 299-300.

[10] Hurrelbrink R J， Nestorowicz A， McMinn P C. Characterization of infectious Murray Valley encephalitis virus derived from a stably cloned genome-length cDNA[J]. Journal of General Virology， 1999， 80： 3 115-3 125.

[11] Joshi A， Jeang K T. Reduction in growth temperature minimizes instability of large plasmids containing HIV-1 proviral genomes[J]. Biotechniques， 1993， 14（6）： 884-886， 880.

[12] Fakhfakh H， Vilaine F， Makni M， et al. Cell-free cloning and biolistic inoculation of an infectious cDNA of potato virus Y[J]. Journal of General Virology， 1996， 77： 519-523.

[13] Yang S J， Revers F， Souche S， et al. Construction of full-length cDNA clones of lettuce mosaic virus（LMV） and the effects of intron-insertion on their viability in Escherichia coli and on their infectivity to plants[J]. Arch Virologica， 1998， 143（12）： 2 443-2 451.

[14] Desbiez C， Chandeysson C， Lecoq H， et al. A simple， rapid and efficient way to obtain infectious clones of potyviruses[J]. J Virol Methods， 2012， 183（1）： 94-97.

[15] Johansen I E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1996， 93（22）： 12 400-12 405.

[16] Fernandez-Delmond I， Pierrugues O， de Wispelaere M， et al. A novel strategy for creating recombinant infectious RNA virus genomes[J]. Journal of Virological Methods， 2004， 121（2）： 247-257.

[17] Polo S， Ketner G， Levis R， et al. Infectious RNA transcripts from full-length dengue virus type 2 cDNA clones made in yeast[J]. Journal of virology， 1997， 71（7）： 5 366-5 374.

[18] Youssef F， Marais A， Faure C， et al. Strategies to facilitate the development of uncloned or cloned infectious full-length viral cDNAs： Apple chlorotic leaf spot virus as a case study[J]. Virology Journal， 2011， 8： 488.

[19] Tuo D， Shen W， Yan P， et al. Rapid construction of stable infectious full-length cDNA clone of Papaya leaf distortion mosaic virus using In-Fusion cloning[J]. Viruses， 2015， 7（12）： 6 241-6 250.

[20] Gibson D G， Benders G A， Axelrod K C， et al. One-step assembly in yeast of 25 overlapping DNA fragments to form a complete synthetic Mycoplasma genitalium genome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2008， 105（51）： 20 404-20 409.