靈香草總黃酮的提取及對羥自由基的清除效率

閆旭宇 李夢汝 李玲

摘 要 以靈香草為實驗材料，利用超聲波輔助乙醇提取靈香草黃酮。通過正交試驗設計優(yōu)化靈香草總黃酮的提取條件，并對黃酮提取物的抗氧化性進行研究。結果表明，靈香草黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度70%、料液比1 ∶ 20、提取時間50 min、提取溫度60 ℃。在此條件下，靈香草黃酮的平均提取率為3.27%。在相同質量濃度下，所提取的靈香草黃酮提取物對羥基自由基的清除率高于Vc，具有一定的抗氧化能力。

關鍵詞 靈香草；黃酮；提取優(yōu)化；抗氧化性

中圖分類號 Q949.95 文獻標識碼 A

Extraction of Total Flavonoids from Lysimachia foenum-graecum

Hance and Its Scavenging Capacity on

Hydroxyl Free Radicials

YAN Xuyu1，2， LI Mengru2， LI Ling1 *

1 College of Life Science， Yanan University， Yanan， Shanxi 716000， China

2 Department of Chemistry and Biological Engineering， Hunan University of Science and Engineering / Key Laboratory

of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South， Yongzhou， Hunan 425199， China

Abstract In this experiment， the total flavonoids were extracted from Lysimachia foenum-graecum Hance by ultrasound-assisted ethanol extraction. The extraction conditions of flavonoids were optimized by an orthogonal experimental design， and the antioxidant effects of the extracted flavonoids was also studied. The results showed that the optimum extraction technology was ethanol concentration 70%， solid-liquid ratio 1 ∶ 20， ultrasound-assisted ethanol extraction time 50 min， and the extraction temperature 60 ℃. Under the condition， the extraction rate of flavonoids reached 3.27%. The experiment indicated that the hydroxy radical scavenging rate of the flavonoids was better than Vc under the same quality concentrations.

Key words Lysimachia foenum-graecum Hance； flavonoids； extraction and optimization； antioxidants

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.015

靈香草（Lysimachia foenum-graecum Hance）為報春花科植物的帶根全草，又名香草、零陵香，其味甘、性平，具有解表、止痛、行氣、驅蛔等功效[1-2]，是特色傳統(tǒng)藥用植物。靈香草中含有黃酮類化合物、多糖、揮發(fā)油、香豆素等成分，其主要功用集中在藥用、食品、化妝品和香料[3-6]。黃酮類物質具有較強的生物活性，并具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌消炎、抗衰老等功效[7]。然而，迄今針對靈香草中總黃酮提取工藝的研究報道很少，僅有楊瑞云等[8]研究了乙醇熱浸提法的提取工藝，但該法提取物雜質含量較多、提取率較低。利用超聲輔助乙醇法來提取黃酮，能加快胞破碎的速度、降低能耗、節(jié)省時間，且提取產品的純度較高[9]。因此，本實驗選用超聲輔助乙醇提取靈香草總黃酮，通過正交實驗優(yōu)化靈香草總黃酮的提取條件，并對羥基自由基的清除作用進行研究，為靈香草有效成分的提取和新型抗氧化劑的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑 原料：靈香草（購自湖南永州，樣品烘干備用）。試劑：無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、抗壞血酸，蘆丁標準品，所用試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備 JJ-2型粉碎機，江蘇同君科技儀器有限公司；JA3003電子分析天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；KQ3200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHZ-DⅢ循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器責任有限公司；WG-71型電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗方法 提取工藝流程：靈香草→烘干→粉碎（100 目）→超聲輔助乙醇提取（300 W）→減壓抽濾→定容→提取液。

蘆丁標準曲線的繪制：以蘆丁為標準品，在已配置好的不同濃度的標準溶液中，加入Na（NO2）、Al（NO3）3、NaOH溶液，發(fā)生顯色反應。以不加蘆丁對照品溶液為參比，在510 nm處測吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程y=5.034x+0.003 5，R2=0.996 5。

靈香草黃酮含量的測定：采用Na（NO2）-Al（NO3）3-NaOH法測定總黃酮[10]。根據回歸方程計算出提取液中總黃酮的質量濃度，然后計算靈香草中總黃酮的提取率（%）：

黃酮提取率=C×V×N/M×100%

式中：C為提取液中總黃酮濃度（mg/mL），V為定容體積（mL），N為稀釋倍數，M為稱量的靈香草質量（g）。

1.2.2 單因素試驗設計 通過單因素實驗，研究乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度對靈香草總黃酮提取率的影響，確定超聲輔助提取黃酮的最佳工藝參數范圍。

乙醇濃度對靈香草總黃酮提取率的影響：準確稱取干燥的靈香草粉末1.0 g，分別加入20 mL 60%、65%、70%、75%、80%的乙醇溶液，在溫度50 ℃，超聲時間40 min下，研究乙醇濃度對靈香草總黃酮提取率的影響。

料液比對靈香草總黃酮提取率的影響：準確稱取干燥的靈香草粉末1.0 g，在溫度50 ℃，超聲時間40 min下，分別設定料液比（g/mL）為1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30，研究不同料液比對靈香草總黃酮提取率的影響。

時間對靈香草總黃酮提取率的影響：準確稱取干燥的靈香草粉末1.0 g，在溫度50 ℃，料液比1 ∶ 20下，分別設定超聲輔助提取時間為20、40、60、80、100 min，研究不同提取時間對靈香草總黃酮提取率的影響。

溫度對靈香草總黃酮提取率的影響：準確稱取干燥的靈香草粉末1.0 g，在超聲時間40 min，料液比1 ∶ 20下，分別設定提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，研究不同溫度對靈香草總黃酮提取率的影響。

1.2.3 正交實驗 在單因素實驗的基礎上，以乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度為試驗因素，選擇最佳3個水平，以總黃酮提取率為指標，采用L9（34）正交表進行正交試驗，確定超聲輔助乙醇提取靈香草總黃酮的最佳工藝條件。

1.2.4 羥基自由基清除實驗 靈香草總黃酮及Vc對羥基自由基的清除率，采用水楊酸法[11]進行測定。對羥基自由基的清除率按下式計算：

E=[A0-（Am-An）]/A0×100%

式中，A0為空白對照液的吸光值，Am為加入黃酮后的吸光值，An為不加H2O2時黃酮的吸光值。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響 由圖1可知，隨著乙醇濃度的增加，靈香草黃酮提取率逐漸增加。當乙醇濃度為70%時，靈香草黃酮提取率達到最高，之后逐漸下降。這可能是由于乙醇對細胞膜的破壞作用比水強，更易使黃酮類化合物溶出[9]。但是，由于總黃酮中的糖基易溶于水[12-13]，乙醇濃度過高會引起黃酮的溶解度下降，并引起脂溶性物質的溶出量增加，從而導致黃酮類化合物的得率下降。因此，一定比例的乙醇有助于獲得較高的提取率。當乙醇濃度為70%時，提取效果較好。

2.1.2 料液比對提取率的影響 由圖2可知，隨著料液比的增加，靈香草黃酮提取率逐漸提高，當料液比為1 ∶ 20時，靈香草精黃酮提取率最高，之后呈緩慢下降趨勢。這可能是由于一定比例的料液比已經可以將黃酮類化合物基本溶出，增大料液比，乙醇水溶液中溶解的黃酮類化合物越多，但是當料液比超過一定值，提取率的增幅將逐漸降低。另外，料液比過大不但會增加溶劑的用量，還會增大去除溶劑所需的負荷。因此，料液比為1 ∶ 20左右為宜。

2.1.3 時間對提取率的影響 如圖3所示，隨著提取時間增加，黃酮提取率不斷增加，在提取時間為60 min時，靈香草黃酮提取率最高，之后逐漸下降。這可能是由于提取時間過短，黃酮類化合物還沒有充分溶出，時間過長又導致一些溶劑揮發(fā)，或黃酮類化合物可能發(fā)生化學反應，使提取物中的有效成分被破壞。同時，隨著提取時間延長，溶液中雜質也逐漸增多，也會影響黃酮的浸出。因此，提取時間選擇60 min左右為宜。

2.1.4 溫度對提取率的影響 如圖4所示，隨著提取溫度升高，黃酮提取率不斷增加，在60 ℃時，靈香草黃酮提取率最高，之后提取率緩慢下降。這可能是由于溫度升高，分子運動速度加快，黃酮類化合物更容易浸出，但是溫度過高，容易導致黃酮類化合物的結構被破壞，造成黃酮含量降低。因此，提取溫度應控制在選擇60 ℃左右為宜。

2.2 正交實驗結果

根據單因素試驗結果，以乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度為考察因素，以提取率為考察指標，進行L9（34）正交試驗，因素水平表見1。

由表2的極差值大小可知，影響靈香草黃酮提取率的主次因素依次為乙醇濃度（A）>提取時間（C）>提取溫度（D）>料液比（B），乙醇濃度對提取率的影響相對較大。超聲輔助乙醇提取靈香草黃酮的最佳組合為A2B2C2D2，即乙醇濃度70%，料液比為1 ∶ 20，提取時間為50 min，提取溫度60 ℃。在此條件下進行驗證實驗，最終得到靈香草精油的提取率為3.27%。

2.3 靈香草黃酮對羥基自由基的清除作用

由圖5可知，在一定范圍內，靈香草總黃酮提取物和Vc對羥基自由基清除率均逐漸增強，說明黃酮提取物和Vc對羥基自由基的清除能力存在著一定的量效關系。在相同質量濃度下，靈香草黃酮提取物對羥基自由基具有較好的清除作用，效果明顯高于Vc。

3 討論

目前，由于食品常用抗氧化劑具有毒性，許多國家已經停止或嚴格限制其使用，尋找開發(fā)無毒的天然抗氧化劑已經引起廣泛重視。黃酮類化合物廣泛存在于植物體內，具有重要的生理活性。本實驗在超聲輔助乙醇提取的最優(yōu)條件下，即乙醇濃度70%，料液比為1 ∶ 20，提取時間為50 min，提取溫度60 ℃時，靈香草黃酮的提取率為3.27%，遠高于楊瑞云等[8]利用乙醇熱浸提法提取靈香草總黃酮的提取率（0.98%）。超聲輔助乙醇法適宜于在低耗能、省時間的情況下提取靈香草黃酮類物質。

羥基自由基能殺死機體紅細胞，降解蛋白質、細胞膜和多糖化合物，造成遺傳分子的損傷，導致機體衰老，誘發(fā)心腦血管疾病、糖尿病、癡呆癥，甚至誘發(fā)腫瘤等多種疾病及其并發(fā)癥[14]。研制經濟有效的天然黃酮類抗氧化劑是防治上述疾病的重要途徑[15-17]。研究表明，金銀花、堿蓬等[18-19]的黃酮均具有較強的抗氧化能力。本實驗中，在相同質量濃度下，靈香草黃酮提取物的羥基自由基清除率高于Vc，具有較好的抗氧化活性，可以作為一種羥基自由基的清除劑進行應用。因此，本研究對靈香草資源的開發(fā)利用提供有力依據，為尋找天然抗氧化劑具有重要意義。

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