八角蓮組織培養(yǎng)的器官發(fā)生途徑研究

陳瑤 刁瑕 宦云敏 杜陽春 李維 何兵

摘要： 為探究小檗科植物八角蓮組織培養(yǎng)的器官發(fā)生方式，該研究以八角蓮離體葉片、葉柄在MS培養(yǎng)基上誘導產生的愈傷組織、不定芽、不定根為對象，用連續(xù)石蠟切片技術分析八角蓮組織培養(yǎng)的器官發(fā)生途徑。結果表明：八角蓮愈傷組織形成的解剖學特征是靠近表皮的薄壁細胞經激素刺激恢復分裂能力，繼續(xù)培養(yǎng)形成擬分生組織。擬分生組織可形成許多分化中心。通過對八角蓮組織培養(yǎng)產生的不定芽細胞組織學觀察發(fā)現芽原基起源于愈傷組織外側的幾層薄壁細胞，芽原基背離愈傷組織中央生長形成不定芽，故八角蓮脫分化形成的芽起源方式為外起源。而八角蓮的根原基起源于組織深處髓部薄壁細胞和部分維管形成層細胞，進而形成類似球形或楔形并朝韌皮部突起的根原基輪廓，根原基繼續(xù)發(fā)育會突破表皮生成不定根，起源方式為內起源。八角蓮離體再生途徑為器官發(fā)生型，在組培苗生長過程中先誘導形成不定芽，再誘導形成不定根，在愈傷組織上形成維管組織將不定芽和不定根連接成完整植株。

關鍵詞： 八角蓮， 不定芽， 不定根， 組培苗， 石蠟切片

中圖分類號： Q943.1， Q945文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）09111111

Abstract： To study the organic regeneration pathway of tissue culture of Dysosma versipellis， we used callus， adventitious buds and roots induced from in vitro leaves and petioles of D. versipellis on MS medium to analyze it， based on the technique of serial paraffin slices. The results showed that the parenchyma cells which were near the epidermis recovered cell division ability through the hormone stimulation. Originally cells of the stationary state altered cell metabolism after they were stimulated， and cell division became active. The parenchyma cells were continued to culture and formed meristemoid with cells division potential of totipotency of plant cell， which could form a lot of differentiation centers. Histological observation of D. versipellis proved that the bud primodium derived from the subsurface layers of callus and grew away from the middle of callus， so the buds which produced by dedifferentiation originated in exogenous way， formed the adventitious buds. Furthermore， the root primodium originated from parenchyma cells in the pith and partial vascular cambium cells in the depth of tissue， which raised towards the phloem liked spherical or wedge. It would continue growing and break epidermis， then adventitious buds were formed. This way was endogenous. Organogenesis type was the conventional way for D. versipellis to regenerate in vitro. Adventitious buds were induced at first during the growth process of tissue culture seedling， which was followed by the formation of adventitious roots. Because of vascular bundle of adventitious roots being originated from callus must link vascular bundle of stem and branch， it played an important role in supporting small plant development. At last， the vascular bundle formed from callus would connect the two into a complete plant. The research result has important guiding significance for scale planting cultivation of D. versipellis while protecting of germplasm resources.

Key words： Dysosma versipellis， adventitious bud， adventitious root， tissue culture seedling， paraffin section

八角蓮（Dysosma versipellis）又名旱八角、金魁蓮是中國特有瀕危保護植物，屬于小檗科（Berberidaceae）鬼臼屬（Dysosma），主要分布在浙江、湖南、湖北、云南、四川等地（中國植物志，2001）。八角蓮藥用價值高，能抑制多種細菌（Zheng et al，2016），治療蛇毒咬傷、關節(jié)酸痛、半身不遂等疾病（中國植物志，2001）。八角蓮的有效成分黃酮類化合物、鬼臼毒素等具有抗病毒、抗腫瘤等作用（陳日道等，2016），尤其用于治療食道癌、子宮癌（Yuan et al，2011）、前列腺癌等（Jiang et al，2007）。近年來，適合八角蓮生存的陰暗潮濕生境被強烈破壞，導致八角蓮棲息地面積逐漸減小，野生八角蓮分布地區(qū)和數量銳減，再加上人們長期對野生八角蓮無規(guī)律采挖，最終導致野生八角蓮資源瀕于滅絕。因此必須盡快建立八角蓮人工高效繁殖體系。

目前，八角蓮的研究主要集中在其種質資源、化學成分、藥用價值、離體快繁等方面。八角蓮離體快繁是解決野生八角蓮資源短缺的重要途徑之一，很多學者就此進行了深入研究，并且取得了一定的成果，Jiang et al（2012）成功建立了八角蓮再生體系。但已有研究都是從外植體選擇、培養(yǎng)基種類、激素種類及其配比等方面入手，目前未發(fā)現有研究者對八角蓮離體器官的形態(tài)發(fā)生途徑進行研究。因此，本研究以八角蓮葉柄、葉片為外植體進行組織培養(yǎng)，以獲得組培苗。運用形態(tài)學觀察和解剖學方法對八角蓮組培苗器官發(fā)生途徑進行研究，目的在于揭示八角蓮離體培養(yǎng)器官發(fā)生途徑和植株再生規(guī)律；探索八角蓮植株高效再生的培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件；用于指導八角蓮種苗生產；同時也為研究鬼臼屬植物離體再生規(guī)律提供理論參考依據。

1材料與方法

1.1 實驗時間、地點

實驗于2015年10月至2016年6月在四川師范大學生命科學學院實驗室進行。

1.1.1 材料本研究使用的外植體為八角蓮離體葉片和葉柄，引種自四川省峨眉山，移栽在四川師范大學生命科學學院實驗基地生物園中。

1.1.2 方法

1.1.2.1 八角蓮組織培養(yǎng)八角蓮組織培養(yǎng)分為三個步驟。第一，在培養(yǎng)基（A）中誘導外植體（葉柄、葉片）脫分化形成愈傷組織；第二，在培養(yǎng)基（B）中誘導愈傷組織再分化形成芽；第三，在生根培養(yǎng)基（C）中誘導芽生根（具體配方見表1）。培養(yǎng)條件：溫度為（22±1）℃，光照時間為14 h·d1，濕度為75%，光照強度為1 000 lx。

1.1.2.2 形態(tài)學和解剖學觀察從外植體接入培養(yǎng)基開始，每隔一周觀察外植體形態(tài)變化。當愈傷組織產生時，取樣做石蠟切片，直到形成完整植株。石蠟切片用番紅-固綠染色，在Leica DM 3000顯微鏡下進行解剖學觀察并拍照。

2結果與分析

2.1 誘導形成愈傷組織

2.1.1 八角蓮愈傷組織形成的形態(tài)學觀察外植體在培養(yǎng)基A中培養(yǎng)30～35 d，葉片明顯增大并且邊緣向上卷曲（圖1：A），葉柄彎曲（圖2：A）。延長培養(yǎng)到40～45 d，葉脈開始膨大、葉片增厚（圖1：B）；葉柄切口處膨大（圖2：B），表明此時細胞已開始增殖。培養(yǎng)到第55～65天可在葉片、葉柄切口處脫分化形成顆粒狀、淡黃綠色的愈傷組織（圖1：C；圖2：C），但愈傷組織生長緩慢。繼續(xù)培養(yǎng)，可產生一團淡綠色或淡黃色、有光澤的愈傷組織（圖1：D；圖2：D）。

2.1.2 八角蓮愈傷組織形成的解剖學特征觀察八角蓮愈傷組織石蠟切片發(fā)現靠近表皮的薄壁細胞在激素刺激下逐漸脫分化恢復分裂能力，分裂產生的細胞體積小，細胞核染色較深，細胞無規(guī)則，細胞間隙大且缺少有組織的結構（圖3：A）。繼續(xù)培養(yǎng)，恢復分裂能力的細胞快速進行有絲分裂（圖3：B），形成分生細胞團，分生細胞團內部細胞之間無間隙，細胞體積稍小，分生細胞團之間存在空泡狀細胞（圖3：C）。有的愈傷組織在激素刺激下產生擬分生組織（圖3：D，E，F）。這些分生細胞團和擬分生組織對八角蓮后期的器官形成和輸導組織分化有重大作用。

分生細胞團中的部分細胞開始分化，細胞縱向生長，細胞側壁不同程度加厚，原生質體分解，相鄰細胞之間的細胞橫壁溶解，最終分化形成導管（圖4：A，B）；有些擬分生組織還會分化形成篩管，伴胞清晰可見（圖4：C）。導管和篩管等輸導組織對愈傷組織的水分和營養(yǎng)物質運輸起重要作用。擬分生組織可形成許多分化中心，并且可在愈傷組織近表層形成芽原基。

2.2 誘導分化不定芽

2.2.1 八角蓮不定芽形成的形態(tài)學觀察將八角蓮愈傷組織轉接至培養(yǎng)基B中，培養(yǎng)25～30 d發(fā)現在呈塊狀、結構緊致，表面粗糙、顏色偏暗的愈傷組織塊上很難誘導出不定芽，在呈淡黃綠色的顆粒狀愈傷組織上才能誘導分化出不定芽（圖5：A），延長培養(yǎng)，不定芽分化出葉片（圖5：B），繼續(xù)培養(yǎng)20 d左右可形成叢生芽（圖5：C，D）。

2.2.2八角蓮不定芽形成的解剖學特征愈傷組織轉入誘導分化培養(yǎng)基（B）30 d后，每隔5 d取一次樣做石蠟切片，連續(xù)做7次。在此過程中發(fā)現八角蓮組織培養(yǎng)產生的芽原基起源于愈傷組織外側的幾層薄壁細胞，這些能夠分化形成芽原基部位的愈傷組織最外層有一層表皮細胞。這層表皮細胞呈長方形，細胞排列緊密，無間隙。這層表皮細胞以內的幾層細胞薄壁細胞進行垂周分裂，產生的細胞不規(guī)則，細胞體積小，但是細胞核明顯，細胞排列緊密，無間隙。垂周分裂產生的細胞形成新的生長點，即原始芽原基（圖6：A），原始芽原基的生長點背離愈傷組織中央，隨著細胞加速分裂可形成明顯的芽原基（圖6：B，C）。這些芽原基在培養(yǎng)基（B）中培養(yǎng)會分化出不定芽。

不定芽在生長過程中會形成不同的形態(tài)。有的芽原基直接分裂分化形成融合的不定芽（圖7：A）；有的不定芽的頂端分生組織直接向外生長（圖7：B）；部分不定芽由兩片葉原基保護著向外生長 （圖7：C）；有的不定芽由封閉的葉原基包裹 （圖7：D-a）；有的芽原基會形成酒杯狀的不定芽（圖7：D-b）；也有由葉原基保護的圓屋頂狀的頂點分生的不定芽（圖7：E）；有的芽原基形成具有多層幼葉的結構（圖7：F）。由此可知八角蓮愈傷組織分化形成的芽是不定芽，其起源方式為外起源，發(fā)生方式屬于器官發(fā)生型。

雖然誘導分化的不定芽有不同的形態(tài)，但不定芽頂端分生區(qū)的細胞有相同的解剖學特點。其表皮層細胞近方形，細胞體積小，細胞壁薄，細胞核大，細胞質稠密，無液泡，細胞排列緊密，細胞之間的間隙小甚至無間隙。表皮層內的細胞近圓形，細胞核較大，細胞質稠密，細胞間略有間隙。但是隨著細胞不斷遠離不定芽頂端分生組織，細胞核逐漸變小，細胞質減少，細胞間隙加大，細胞體積變大，達到一定程度后細胞不再變化（圖8：A，B，C）。

在八角蓮芽原基發(fā)育為不定芽的過程中，不定芽內的細胞逐漸分化形成螺紋狀的篩管（圖9：A，B，C，D），維管束（圖9：E，F）。這些維管組織在不定芽生長過程中為其運輸必需的水分和營養(yǎng)物質。

2.3 誘導八角蓮不定芽生根

2.3.1八角蓮不定芽生根的形態(tài)學觀察叢生芽在培養(yǎng)基（C）中培養(yǎng)10 d左右，不定芽基部的愈傷組織上出現白色瘤狀凸起（圖10：A），繼續(xù)培養(yǎng)8 d左右白色瘤狀凸起發(fā)育形成不定根（圖10：B，C），待根系繼續(xù)生長5 d左右既可以進行移栽， 移栽后組培苗根系可正常生長。（圖10：D）。

2.3.2不定芽生根過程的細胞組織學觀察將2～3 cm高的不定芽接入生根培養(yǎng)基C中，每隔3 d取樣做石蠟切片，共取5次樣。觀察大量石蠟切片發(fā)現愈傷組織深處的髓部薄壁細胞首先再分化產生新的薄壁細胞，新薄壁細胞構成維管形成層。維管形成細胞的細胞質濃、細胞核染色較深（圖11：A）。薄壁細胞經過多次有絲分裂，形成層加寬，有些地方出現染色比其他區(qū)域稍深的細胞團。這些細胞團排列緊密，細胞體積小，細胞質濃，細胞核相對較大。這些細胞團具有強烈的分裂能力，可分裂分化形成類似球形或楔形并朝韌皮部突起的根原基輪廓，同時表皮細胞溶解。在后期的切片中可觀察到原始根原基（圖11：B），此生長點可形成根原基。根原基形成的頂端分生組織明顯，細胞分裂能力旺盛，不斷向外生長。中后部細胞染色變淺，分生能力減弱，逐漸變成薄壁細胞（圖11：C），直到形成完整的不定根（圖11：D）。根原基起始于愈傷組織深處的薄壁細胞，可見八角蓮離體組織培養(yǎng)的根起源方式為內起源，生成的根為不定根。

不定根頂端分生組織的部分薄壁細胞可分化形成導管（圖12：A-b，C），愈傷組織中的一些薄壁細胞也分化形成導管（圖12：A-a，B），并且與不定根中的導管相連。這些導管可以將愈傷組織中的水分運輸到不定根中，為不定根的生長提供充足的水分和礦物質。在形成不定根的愈傷組織上還發(fā)現了更完整、更龐大的維管組織（圖12：D，E，F，G，H，I），這些維管組織不僅與不定芽中的維管組織相連，還和不定根中的維管組織相連。這樣不定芽與不定根就通過維管組織連接形成完整植株。這些維管組織不僅可以將愈傷組織中的營養(yǎng)物質運輸到不定芽和不定根中去。還可將不定根從土壤里吸收的水分、無機鹽等物質運輸到植株的各個部位，從而提高八角蓮組培苗移栽成活率。

3討論與結論

植株離體再生途徑包括體細胞胚發(fā)生途徑和器官發(fā)生途徑（薛銀芳等，2012）。觀察八角蓮組培苗器官的形態(tài)學發(fā)育過程和各發(fā)育階段解剖學特征可知：八角蓮離體再生途徑屬于器官發(fā)生途徑中的器官發(fā)生型，在激素的刺激下先以外起源的方式形成不定芽，再以內起源的方式形成不定根。在八角蓮組織培養(yǎng)三個階段中誘導外植體脫分化形成愈傷組織需要70 d左右，愈傷組織形成后增殖緩慢。愈傷組織再分化形成不定芽需30 d左右，繼續(xù)培養(yǎng)20 d左右可形成大量叢生芽，并在其內部產生大量維管組織，為后期組培苗運輸水分和營養(yǎng)物質奠定基礎。不定芽生根過程僅需要15 d左右。在八角蓮規(guī)?；纳a中建議先在分化培養(yǎng)基（B）中大量誘導形成叢生芽，再誘導叢生芽生根，此方法可節(jié)約種苗生產時間。不定根形成后應在生根培養(yǎng)基（C）中繼續(xù)培養(yǎng)5 d左右，以便不定根中的輸導組織和不定芽中的輸導組織連接成一個整體，從而提高組培苗移栽成活率。在實驗中還發(fā)現板結致密的愈傷組織不易誘導形成不定芽，在后期實驗中應調節(jié)生長素、細胞分裂素的種類及使用比例，以誘導形成淡黃綠色的顆粒狀胚性愈傷組織，以便更好更快地誘導形成不定芽。

3.1 不定芽發(fā)生途徑

根據解剖學研究分析可得出八角蓮愈傷組織再分化途徑為器官發(fā)生途徑：即在愈傷組織不同部位分別形成不定芽、不定根，然后不定芽和不定根通過維管組織連接形成完整組織。這與亞洲百合的花絲離體再生途徑相似（姚紹嫦等，2009）。關于體細胞脫分化形成的擬分生組織先發(fā)育形成芽原基，隨后再形成葉原基；還是先形成葉原基后再形成芽原基；或者芽原基和葉原基同時形成等問題存在爭議（蔡潤等，2002；Bowman & Eshd，2000；Barton & Poething，1993）。由圖6：A，B，C可知八角蓮離體植株再生是先形成芽原基，芽原基發(fā)育為不定芽時會有葉原基形成（圖7：C，Da，E，F），但并非所有不定芽都伴有葉原基（圖7：A，B，Db）。

3.2 不定根發(fā)生途徑

根原基產生部位常有形成層、皮層薄壁細胞、韌皮部、髓射線細胞、愈傷組織（Fahn，1997），并分為潛伏根原基和誘生根原基（Davis，1994）。通過對八角蓮不定根發(fā)生過程的解剖學研究發(fā)現，八角蓮愈傷組織中無潛伏根原基存在，形成不定根的誘生根原基是在生長素IBA誘導下才形成。生長素IBA在誘導不定根形成中起著重要作用，如鐵棒錘（陳紅剛等，2016）、金鐵鎖（李斌等，2016）不定根的形成都與IBA密切相關。八角蓮組培苗不定根的根原基起源于愈傷組織深處的髓部薄壁細胞。這些細胞分裂分化形成類似球形或楔形并朝韌皮部突起的根原基輪廓、根原基、最終形成不定根。李志軍和于軍（2002）發(fā)現田旋花不定根起源于維管形成細胞。于宏等（2008）研究表明珍稀藥用植物杏香兔耳風組培苗的根原基源于髓射線分生細胞，也屬于誘導根原基。其根系發(fā)育過程可分為髓射線分生細胞分化、形成根原基、形成不定根三個階段。紫花含笑組培苗在誘導生根前不含根原始體，根原基起始于髓射線與形成層交接處的薄壁細胞（宋曉琛等，2014）。本研究結果表明八角蓮組培苗生根過程還與油茶（吳幼媚等，2013）、鐵線蓮（張啟香等，2010）等組培苗形成不定根的過程相似。

Salaj et al（2005）發(fā)現亞麻愈傷組織中的分生結節(jié)在合適的培養(yǎng)條件下可直接形成器官，也可以誘導形成體細胞胚。吳澤等（2014）發(fā)現百合的胚性愈傷組織上的分生結節(jié)就可發(fā)育為體細胞胚。在八角蓮離體器官發(fā)生過程中發(fā)現愈傷組織中存在分生結節(jié)，在后期的研究中可進行相關研究。

參考文獻：

BARTON MK， POETHING RS， 1993. Formation of the shoot apical meristem in Arabidopsis thaliana：an analysis of development in the wild type and in the shoot meristemless mutant [J]. Development， 119：823-831.

BOWMAN JL， ESHD Y， 2000. Formation and maintenance of the shoot apical meristem [J]. Trend Plant Sci， 5（3）：110-115.

CAI R， HUANG WH， PAN JS， et al， 2002. Developmental morphology and anatomy of direct shoot organogenesis from Melon cotyledon [J]. J Wuhan Bot Res， 20（5）：338-342. [蔡潤， 黃偉華， 潘俊松， 等， 2002. 甜瓜子葉離體培養(yǎng)直接再生不定芽的形態(tài)學和解剖學觀察 [J]. 武漢植物學研究， 20（5）：338-342.]

CHEN HG， ZHANG X， YANG XX， et al， 2016. Induction and proliferation culture of adventitious roots of Aconitum pendulum Busch [J]. Chin Pharm J， 51（17）：1455-1458. [陳紅剛， 張鑫， 楊曉霞， 等， 2016. 鐵棒錘不定根的誘導與增殖培養(yǎng) [J]. 中國藥學雜志， 51（17）：1455-1458.]

CHEN RD， DUAN RG， ZHOU JH， et al， 2016. Flavonoid glycosides from callus cultures of Dysosma versipellis [J]. Chin J Chin Mat Med， 41（1）：87-91. [陳日道， 段瑞剛， 鄒建華， 等， 2016. 八角蓮愈傷組織中黃酮苷類化學成分研究 [J]. 中國中藥雜志， 41（1）：87-91.]

DAVIS TD， 1994. Biology of adventitious root formation [M]. New York： New York Plenum Press： 123-126.

FAHN A， 1997. Secretory tissues in plants [M]. London：Academic Press： 223-243.

Flora of China Editorial Board of Chinese Academy of Sciences， 2001. Flora of China [M]. Beijing：Science Press， 29：256. [中國科學院中國植物志編輯委員會， 2001. 中國植物志[M]. 北京： 科學出版社， 29： 256.]

JIANG RW， ZHOU JR， HON PM， et al， 2007. Lignans from Dysosma versipellis with inhibitory effects on prostate cancer cell lines [J]. J Nat ProdLloydia， 70（2）：283-286.

JIANG W， CHEN L， PAN Q， et al， 2012. An efficient regeneration system via direct and indirect organogenesis for the medicinal plant Dysosma versipellis （Hance） M. Cheng and its potential as a podophyllotoxin source [J]. Acta Physiol Plat， 34（2）：631-639.

LI B， HAN GW， TANG JR， et al， 2016. Study on the adventitious root culture of Psammosilene tunicoides [J]. J Chin Med Mat， 39（3）：482-486. [李斌， 韓國偉， 唐軍榮， 等， 2016. 金鐵鎖不定根培養(yǎng)研究 [J]. 中藥材， 39（3）：482-486.]

LI ZJ， YU J， 2002. The anatomical study on vegetative organs and adventitious buds of Convolvulus arvensis [J]. J Wuhan Bot Res， 20（3）：185-187. [李志軍， 于軍， 2002. 田旋花營養(yǎng)器官及不定芽發(fā)生的解剖學研究 [J]. 武漢植物學研究， 20（3）：185-187.]

SALAJ J， PETROVSKA B， OBERT B， et al， 2005. Histological study of embryolike structures initiated from hypocotyl segments of flax （Linum usitatissimum L. ） [J]. Plant Cell Rep， 24（10）：590-595.

SONG XC， CHENG QQ， DAI XY， et al， 2014. Rooting mechanism research of tissue culture based on micro anatomy in Michelia crassipes [J]. Jiangxi For Sci Technol， （3）：1-4. [宋曉琛， 程強強， 戴小英， 等， 2014. 紫花含笑組培苗生根解剖機理研究 [J]. 江西林業(yè)科技， （3）：1-4.]

WU YM， WANG PL， YAO SC， et al， 2013. Morphology and anatomy of organogenesis from tissue culture plantlets of Camellia eleifera [J]. Guihaia， （6）：745-750. [吳幼媚， 王鵬良， 姚紹嫦， 等， 2013. 油茶組培苗器官發(fā)生的形態(tài)學與解剖學研究 [J]. 廣西植物， （6）：745-750.]

WU Z， ZHONG XH， CAO X， et al， 2014. Morphohistological study of somatic embryolike structures and somatic embryos in lily [J]. Acta Hortic Sin， 41（8）：1712-1722. [吳澤， 鐘雄輝， 曹興， 等， 2014. 百合類體細胞胚和體細胞胚的形態(tài)學與組織學研究 [J]. 園藝學報， 41（8）：1712-1722.]

XUE YF， ZHAO DQ， ZHOU CH， et al， 2012. Research advances of Herbaceous Peony tissue culture [J]. Northern Hortic， （4）：167-170. [薛銀芳， 趙大球， 周春華， 等， 2012. 芍藥組織培養(yǎng)的研究進展 [J]. 北方園藝， （4）：167-170.]

YAO SC， AI SY， YANG MC， et al， 2009. Cytomorphology of organogenesis in filament culture of Lilium Asiatic hybrids [J]. Guihaia， 29（6）：812-816. [姚紹嫦， 艾素云， 楊美純， 等， 2009. 亞洲百合花絲離體培養(yǎng)器官形成的細胞形態(tài)學研究 [J]. 廣西植物， 29（6）：812-816.]

YU H， DAI XY， JIANG XM， 2008. Anatomy on roots development for tissue cultural plantlets of Ainsliaea fragrans [J]. Jiangxi For Sci Technol， （6）：25-27. [于宏， 戴小英， 江香梅， 2008. 杏香兔耳風組培苗根系發(fā)育解剖學研究 [J]. 江西林業(yè)科技， （6）：25-27.]

YUAN Y， WANG YZ， HUANG MD， et al， 2011. Development and characterization of molecularly imprinted polymers for the selective enrichment of podophyllotoxin from traditional Chinese medicines [J]. Anal Chim Acta， 695：63-72.

ZHENG Y， XIE YG， ZHANG Y， et al， 2016. New norlignans and flavonoids of Dysosma versipellis [J]. Phytochemistry Lett， 16：75-81.

ZHANG QX， HU HK， FANG YM， 2010. Induction culture and anatomical observation of organogenesis of adventitious root of Clematis ‘MultiBlue [J]. J Plant Res Environ， 19（1）：80-85. [張啟香， 胡恒康， 方炎明， 2010. 鐵線蓮品種‘MultiBlue不定根的誘導培養(yǎng)及其發(fā)生過程的解剖學觀察 [J]. 植物資源與環(huán)境學報， 19（1）：80-85.]