26份割手密種質(zhì)材料的抗旱性差異評(píng)價(jià)

王天菊 王先宏 楊清輝

摘 要 以26份割手密為試驗(yàn)材料，在正常供水和干旱脅迫處理下，測定伸長初期的13項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)及光合參數(shù)，利用相關(guān)分析、聚類分析和模糊隸屬函數(shù)分析法對(duì)其抗旱性差異進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：干旱脅迫后，不同材料之間的抗旱指標(biāo)存在明顯差異，其抗旱性不同。相關(guān)分析表明，不同基因型割手密的染色體數(shù)與抗旱性呈極顯著負(fù)相關(guān)，葉面積與抗旱性呈顯著負(fù)相關(guān)。模糊隸屬函數(shù)和聚類分析可將26份不同基因型割手密分為3類，其中高抗旱類型1份（2013-13），中抗旱類型14份，不抗旱類型11份，為割手密抗旱材料篩選及甘蔗抗旱基因發(fā)掘奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 甘蔗；割手密；抗旱鑒定；模糊隸屬函數(shù)法

中圖分類號(hào) S566.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Comprehensive Evaluation on Drought Resistance Difference

of Twenty-six Saccharum spontaneum L. Accessions

WANG Tianju， WANG Xianhong*， YANG Qinghui*

College of Agriculture and Biological Technology， Yunnan Agriculture University / Sugarcane

Research Institution， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201， China

Abstract Twenty-six S. spontaneum accessions were used as the materials under the normal water and drought stress treatment， 13 morphological indices， physiological indices and photosynthetic parameters were measured at early elongation stage. Comprehensive evaluation of drought resistance by the methods of correlation， clustering， fuzzy membership function analysis were undertaken. The results showed that the drought resistance index of different materials were obviously different. The drought resistance of S. spontaneum accessions were also different under the drought stress treatment. Correlation analysis showed the relative values of chromosome numbers and drought resistance were highly significantly negatively correlated. And the relative values of leaf area and drought resistance were highly significantly negatively correlated. Membership function and cluster analysis showed that the twenty-six accessions could be divided into three categories， including one accession as the high drought-resistant type（2013-13）， 14 accessions as the drought-resistant type and 11 accessions as the drought-sensitive type. The study would lay the foundation for exploring drought-resistant genes to improve new available sugarcane varieties.

Key words Sugarcane； Saccharum spontaneum L.； drought resistance identification； Fuzz membership function

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.011

中國目前大約90%蔗區(qū)在缺水無灌溉條件的丘陵旱坡地[1-2]，干旱已成為制約中國甘蔗生產(chǎn)的主要因素之一。生產(chǎn)實(shí)踐證明，培育甘蔗高產(chǎn)抗旱新品種是提高水分利用效率最重要、最有效的措施之一[3-4]。割手密（Saccharum spontaneum L.）具有旱生植物所具有的特征，又是甘蔗育種中最有價(jià)值的資源植物[5-6]，利用割手密的抗旱特性培育抗旱性強(qiáng)、水分利用率高的新品種，對(duì)中國甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義。

近年來國內(nèi)外學(xué)者從形態(tài)、生理生化的角度，對(duì)割手密的抗旱性鑒定指標(biāo)、評(píng)價(jià)方法和抗旱種質(zhì)（品種）篩選做了較多研究。在干旱脅迫下，割手密葉片的束縛水含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、質(zhì)膜透性、超氧化物歧化酶活性、過氧化物酶活性均升高，而株高長速、功能葉重、根系活力、根/冠比、葉片含水量、失水速率、葉綠素含量、過氧化氫酶活性和凈光合速率均下降[7-10]，這些變化使割手密能夠長期適應(yīng)熱帶和亞熱帶的生長環(huán)境。因此上述指標(biāo)均可作為鑒定割手密抗旱能力較可靠的依據(jù)。割手密抗旱性評(píng)價(jià)方法有模糊隸屬函數(shù)法[9-11]、田間自然鑒定法[12]、判別分析法[8]和聚類分析法[8，13]，其中模糊隸屬函數(shù)法能夠較準(zhǔn)確評(píng)價(jià)割手密的抗旱性，應(yīng)用較多。采用這些方法，國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)鑒定出川79-1-15等一批抗旱性較強(qiáng)的野生資源[10，12]，篩選出云割F3 95/128等一批抗旱性優(yōu)越的割手密后代及其血緣的種質(zhì)創(chuàng)新材料，拓寬了甘蔗抗旱育種的遺傳基礎(chǔ)[7-9，11，13]。

割手密是一種基因型多樣的植物，其染色體數(shù)（2n）在40～128之間，染色體基數(shù)為8，其中以2n=64、80、96、112和128等5種染色體類型為主[14-117]，然而針對(duì)國內(nèi)外不同基因型割手密抗旱鑒定與篩選的研究尚未見報(bào)道。本研究在割手密資源調(diào)查、植物學(xué)性狀分析以及核型分析等研究基礎(chǔ)上[16-20]，對(duì)26份不同基因型割手密材料通過測定干旱脅迫條件下生長發(fā)育、形態(tài)性狀和生理生化的變化，以抗旱隸屬函數(shù)為依據(jù)，采用綜合抗旱性評(píng)價(jià)的方法進(jìn)行抗旱性篩選和評(píng)價(jià)，以期為甘蔗抗旱育種提供新的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

從云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院甘蔗研究所資源圃現(xiàn)有的種質(zhì)資源中，選擇不同基因型或基因型相同但采集地點(diǎn)不同的26份割手密材料（表1）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 盆栽試驗(yàn)在避雨、自然通風(fēng)的塑料大棚內(nèi)進(jìn)行，采用土培的方法，塑料盆底留孔，帶底盤，每盆裝土8 kg。將供試材料均勻分兜后種植于塑料盆中，每份材料種植6盆，共156盆。材料放置于塑料大棚中，脅迫處理前施肥澆水量一致，其它管理同一般的盆栽管理。

供試材料處于伸長初期時(shí)（2016年5月24日），首先把每份材料隨機(jī)分成2組，每組3盆，充分淋水直至土壤水分飽和，盆底有水流出，然后進(jìn)行水分處理，一組正常供水，作為對(duì)照（每3 d灌溉1次），另一組停止供水，進(jìn)行干旱脅迫處理。干旱脅迫期間每日9時(shí)觀察材料生長情況，并對(duì)盆內(nèi)土壤含水量用烘干法進(jìn)行跟蹤測定，根據(jù)測定結(jié)果決定干旱脅迫處理的時(shí)間。

當(dāng)干旱脅迫處理到土壤含水量達(dá)到重度缺水時(shí)（2016年5月31日），材料表現(xiàn)出嚴(yán)重干旱狀態(tài)。嚴(yán)重缺水按Hsiao的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行劃分，相對(duì)含水量降低大于20%屬嚴(yán)重缺水，此時(shí)植株從上到下葉片的葉尖枯萎，甚至整葉枯死[21]。

1.2.2 測定項(xiàng)目與方法 干旱脅迫處理結(jié)束后，對(duì)所有供試材料同時(shí)取樣，每份材料取足量+1葉（最高可見肥厚帶所在的葉片）混合后，置于封口袋中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，放-20 ℃保存待用。參考前人研究方法，測定能反映割手密抗旱能力的13項(xiàng)形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)和光合參數(shù)[7-11]。株高采用帶刻度的直尺測量。綠葉數(shù)、黃葉數(shù)采用目測法測定，綠葉率/%=綠葉數(shù)/（綠葉數(shù)+黃葉數(shù)+枯葉數(shù)）×100%。葉片相對(duì)含水量（RWC）采用飽和稱量法[22]測定，RWC/%=（葉片鮮重-干重）/（水飽和重-干重）×100%。光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導(dǎo)度（Sc）等光合參數(shù)采用LI-6400XT光合速率測定儀在資源圃實(shí)地測定[23]。水勢（WP）采用WP4T型水勢測定儀測量。丙二醛含量（MDA）測定采用Health等的方法[24]；葉綠素含量（ChL）測定采用80%丙酮浸提法[25]；超氧化物歧化酶活性（SOD）測定參照Giannoplitis等的方法[26]；過氧化物酶活性（POD）測定采用李楊瑞[27]的方法；脯氨酸含量（Pro）采用茚三酮法測定[28]；質(zhì)膜透性（PMP）根據(jù)譚常的方法測定[29]。伸長期葉面積參照蔡澤霖[30]的方法測定。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)整理后用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類分析。綠葉率/%=綠葉數(shù)/（綠葉數(shù)+黃葉數(shù)+枯葉數(shù)）×100%；株高長速/cm=脅迫后株高-脅迫前株高，抗旱性綜合評(píng)價(jià)采用模糊隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)法[31]，計(jì)算公式如下：

式中，∧Xij為第i個(gè)材料第j個(gè)性狀的隸屬函數(shù)值，Xij為第i個(gè)材料第j個(gè)性狀值，Xjmin為各材料j性狀的最小值，Xjmax為各材料j性狀的最大值。Xi為i基因型的模糊隸屬函數(shù)均值，n為指標(biāo)數(shù)，模糊隸屬函數(shù)值的區(qū)間為[0，1]。若指標(biāo)與抗旱性呈正相關(guān)，用公式（1）計(jì)算模糊隸屬函數(shù)值，若指標(biāo)與抗旱性呈負(fù)相關(guān)，選用公式（2）計(jì)算模糊隸屬函數(shù)值，最后用公式（3）計(jì)算模糊隸屬函數(shù)均值，Xi值越大，表明該材料抗旱性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下割手密材料各指標(biāo)的變化

26份不同基因型割手密13項(xiàng)指標(biāo)的測定結(jié)果表明（表2），在干旱脅迫下，割手密的綠葉率為37.04%～92.37%，平均為74.68%，較對(duì)照下降17.19%；株高增長為2.04～22.34 cm，平均為11.22 cm，較對(duì)照下降了6.20 cm，其它指標(biāo)也發(fā)生了不同程度的變化，其中葉片相對(duì)含水量均值較對(duì)照減少25.53%、水勢均值較對(duì)照減少2.93 Mpa、葉綠素均值較對(duì)照減少0.69 mg/g，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率分別減少41.62 μmol/（m2·s）、0.32 mmol/（m2·s）、8.76 mmol/（m2·s）?？梢?，不同基因型割手密受干旱脅迫影響的形態(tài)指標(biāo)、生理指標(biāo)和光合指標(biāo)不同，且影響程度存在差異，表明抗旱性不同。

此外，干旱脅迫處理與對(duì)照相比，除了株高增長、質(zhì)膜透性、脯氨酸、超氧化物酶、過氧化物酶的變異系數(shù)有稍微的下降外，其它指標(biāo)的變異系數(shù)有不同程度的增長，其中增長最大的是凈光合速率，其變異系數(shù)比對(duì)照增加了0.85，其次是水勢，其變異系數(shù)比對(duì)照增加了0.62?？梢?，凈光合速率和水勢對(duì)干旱脅迫最敏感。綜上所述，不同基因型割手密抗旱性與多種指標(biāo)有關(guān)，運(yùn)用任何單一指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)均存在一定的片面性，需對(duì)其進(jìn)行綜合分析和評(píng)價(jià)。

2.2 割手密材料的抗旱性綜合評(píng)定

2.2.1 模糊隸屬函數(shù) 利用模糊隸屬函數(shù)法計(jì)算隸屬函數(shù)加權(quán)平均值，對(duì)26份不同基因型割手密的抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)（表3）。結(jié)果顯示，干旱脅迫下26份不同基因型割手密材料的抗旱性由強(qiáng)到弱排序依次為：2013-13>2013-10>2013-14>1990-2>2015-57>2015-15>I991-61>2015-47>印度2號(hào)>1983-174>2015-61>2012-45>2012-26>1988-301>2015-56>I991-7>1988-283>2012-34>2015-4>1990-15>2015-26>印度1號(hào)>2015-35>2015-28>1982-33>1984-261?？梢钥闯霾牧?013-13葉片的丙二醛含量、葉綠素含量，葉片相對(duì)含水量和質(zhì)膜透性等指標(biāo)的模糊隸屬函數(shù)值都達(dá)到了最大值1，表明在干旱脅迫下2013-13通過合成大量的保護(hù)性物質(zhì)或改變生理特性來提高自身的抗旱性，因此其表現(xiàn)較強(qiáng)的抗旱能力。相反，材料1984-261葉片的丙二醛含量、脯氨酸含量，水勢和質(zhì)膜透性等指標(biāo)的模糊隸屬函數(shù)值相對(duì)比較小，抗旱性表現(xiàn)最弱。

2.2.2 聚類分析 采用系統(tǒng)聚類法對(duì)材料的模糊隸屬函數(shù)值進(jìn)行聚類分析（圖1），結(jié)果表明26份不同基因型割手密材料劃分為3類，2013-13自成一類，可列為高度抗旱類型，占供試材料的3.8%； 2015-56、2012-26、1988-301、2012-45、2013-10、2015-61、1983-174、2015-47、印度2號(hào)、2015-57、1990-2、2013-14、2015-15和I991-61共14個(gè)材料聚為一類，列為中度抗旱類型，占供試材料的53.85%；1984-261、1982-33、2015-26、1990-15、2015-4、2012-34、1988-283、I991-7、2015-35、2015-28和印度1號(hào)共11個(gè)材料聚為一類，列為不抗旱類型，占供試材料的42.31%。

2.3 26份割手密材料抗旱性與葉面積、基因型的相關(guān)性

正常供水條件下，26份割手密材料伸長期的葉片形態(tài)特征差異明顯，葉面積大小不同（表4）。葉面積最小的是2013-13，最大的是2015-57，將模糊隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)出的抗旱性不同的割手密與植株的染色體數(shù)和伸長期的葉面積進(jìn)行相關(guān)性分析表明，染色體數(shù)與葉面積呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.558；染色體數(shù)與抗旱隸屬函數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.653；葉片面積與抗旱隸屬函數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)是0.398（表5）。可見，葉面積大小和染色體數(shù)多少對(duì)不同基因型割手密的抗旱強(qiáng)弱有顯著影響，可作為割手密抗旱種質(zhì)材料篩選的參考依據(jù)。

3 討論

抗旱性為多基因控制的數(shù)量性狀，涉及的基因和代謝眾多[32]，另外，群體、個(gè)體及環(huán)境的作用與割手密的抗旱性密切相關(guān)，例如植株的高矮，莖稈的粗細(xì)，葉片的氣孔大小和角質(zhì)化程度，根系的粗細(xì)和長短，生長環(huán)境等因素，因此準(zhǔn)確評(píng)價(jià)割手密的抗旱性是相當(dāng)困難的[8]。

作物在干旱條件下主要通過質(zhì)膜透性、滲透調(diào)節(jié)、抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)清除自由基的能力等方式產(chǎn)生保護(hù)性物質(zhì)降低對(duì)干旱的敏感性，或產(chǎn)生一系列生理生化變化使干旱解除后各種生理功能夠迅速恢復(fù)正常，從而減輕干旱的傷害表現(xiàn)出抗逆性[33]。本研究結(jié)果表明，干旱脅迫后不同基因型割手密在形態(tài)結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)綠葉率、株高增長、葉片相對(duì)含水量、水勢、葉綠素、凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度均呈下降趨勢；在生理生化上表現(xiàn)質(zhì)膜透性、丙二醛、脯氨酸、超氧化物歧化酶、過氧化物酶均呈上升趨勢，這與前人[7-10，34-37]的研究結(jié)果一致。

割手密對(duì)干旱的適應(yīng)性和抗御能力不同，表現(xiàn)在生理生化反應(yīng)上存在相應(yīng)的差異[3，38]，利用抗旱性綜合評(píng)價(jià)能消除單一指標(biāo)直接判斷帶來的誤差，再結(jié)合各材料在形態(tài)指標(biāo)上的表現(xiàn)，使試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，更可靠[39]。本試驗(yàn)利用模糊隸屬函數(shù)法對(duì)抗旱性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，供試材料抗旱性可聚為3種類型，即1份高度抗旱材料，14份中度抗旱材料，11份不抗旱材料，最終篩選出不同抗旱級(jí)別的不同基因型割手密種質(zhì)，為今后甘蔗抗旱生理機(jī)制研究和抗旱育種奠定了基礎(chǔ)。

在植物的進(jìn)化過程中，葉片對(duì)環(huán)境的變化反應(yīng)較敏感且可塑性較大，因而植物對(duì)環(huán)境的反應(yīng)也較多的表現(xiàn)在葉的形態(tài)和構(gòu)造上[40]，葉片發(fā)育狀況和葉面積大小對(duì)植物抗逆性形成有很大影響[41]。本研究結(jié)果表明，不同基因型割手密的抗旱性與葉面積呈顯著負(fù)相關(guān)（r=0.398，p<0.05），這與許文花等[10]研究結(jié)果一致。從割手密葉片形態(tài)觀察來看，抗旱性強(qiáng)的基因型葉片細(xì)小，葉片的葉脈相對(duì)較粗，葉脈占葉面積的比值相對(duì)較大，葉片的角質(zhì)化程度也比較高，這樣的葉片結(jié)構(gòu)能夠降低植株的蒸騰作用，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗旱能力，因此葉片面積可作為割手密抗旱材料篩選的參考依據(jù)。

本研究結(jié)果表明總體上割手密的染色體數(shù)少，葉面積小，其抗旱性表現(xiàn)較強(qiáng)的趨勢，例如2013-14、2013-13、2013-10的染色體數(shù)最少，均為40條，同時(shí)葉面積也最小，2013-13和2013-10的采集地點(diǎn)和海拔又完全一樣，因此這類割手密的葉面積與抗旱性呈顯著負(fù)相關(guān)。但并不是所有參試材料都符合這個(gè)規(guī)律，即割手密材料的抗旱能力和染色體數(shù)、葉片面積不是嚴(yán)格意義上的一一對(duì)應(yīng)，例如材料I991-7和2015-56的染色體數(shù)最多，均為96條，然而I991-7的葉面積卻較小，2015-56的葉片面積也不是最大的，經(jīng)鑒定I991-7屬于不抗旱類型，2015-56屬于中度抗旱類型，具體原因有待進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)材料2012-34等具有匍匐莖[20]的種質(zhì)，評(píng)價(jià)結(jié)果也可能會(huì)有所偏差。

本研究鑒定出的割手密抗旱種質(zhì)，下一步可與熱帶種、地方種進(jìn)行種屬間遠(yuǎn)緣雜交獲得創(chuàng)新種質(zhì)材料，用于擴(kuò)寬栽培品種的遺傳基礎(chǔ)，進(jìn)而選育甘蔗抗旱優(yōu)良親本或抗旱新品種。另一方面，隨著生物技術(shù)和基因工程的廣泛應(yīng)用，從割手密中克隆抗旱基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種創(chuàng)造甘蔗抗旱新品種，是當(dāng)今甘蔗抗旱育種的努力研究方向。

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