甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因克隆及其干旱脅迫下的表達(dá)特性分析

曹輝慶　蔣勝理　黃誠(chéng)梅　鄧智年　吳凱朝　徐林　羅海斌　陸珍　魏源文

摘要：[目的]克隆甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因，分析其基本生物學(xué)信息及在干旱脅迫下的表達(dá)特性，為ATP結(jié)合蛋白的功能研究提供理論依據(jù)。[方法]從乙烯誘導(dǎo)甘蔗差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄組和水分脅迫下甘蔗cDNA文庫(kù)中獲取ATP結(jié)合蛋白基因序列，設(shè)計(jì)其引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列分析及其蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)干旱脅迫處理下的甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因的表達(dá)情況。[結(jié)果]克隆獲得的甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因全長(zhǎng)2145 bp，編碼714個(gè)氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量為79.430 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為9.33，不穩(wěn)定系數(shù)為44.38；甘蔗ATP結(jié)合蛋白與玉米ATP結(jié)合蛋白的核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸系列同源性最高，均達(dá)93%。甘蔗ATP結(jié)合蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲（42.02%）、α螺旋（25.63%）和延伸鏈（22.27%）結(jié)構(gòu)組成，具有蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域、ATP結(jié)合位點(diǎn)、核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）、糖基化位點(diǎn)、激酶磷酸化結(jié)合位點(diǎn)及核定位信號(hào)等；甘蔗ATP結(jié)合蛋白可能主要定位在細(xì)胞核、葉綠體、線粒體和過氧化物酶體中，起中間代謝調(diào)控作用，或參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫應(yīng)答、脅迫應(yīng)答及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物反應(yīng)。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在干旱脅迫7 d后，甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因的表達(dá)量明顯下調(diào)，約為對(duì)照的30%，恢復(fù)正常供水（復(fù)水）后，表達(dá)量回升。[結(jié)論]甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)，可能參與甘蔗對(duì)干旱逆境脅迫響應(yīng)的代謝調(diào)控。

關(guān)鍵詞：甘蔗；ATP結(jié)合蛋白；基因克隆；生物信息學(xué)；干旱脅迫；表達(dá)特性

0引言

[研究意義]甘蔗（Saccharum officinarum L.）屬于C4光合途徑作物，具有特殊的能量代謝系統(tǒng)，是主要的糖料作物（李楊瑞等，2011）。近年來(lái)，甘蔗分子育種研究迅速發(fā)展，主要圍繞功能基因發(fā)掘和利用、轉(zhuǎn)基因和分子標(biāo)記輔助育種及抗病、抗蟲分子作用機(jī)理等方面開展大量研究，并取得良好的成效。發(fā)掘和鑒定甘蔗功能基因，并系統(tǒng)研究其與甘蔗重要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性，對(duì)豐富甘蔗遺傳改良可利用的基因資源具有重要意義。ATP結(jié)合蛋白（ATP-bindingprotein）是一個(gè)多樣化的蛋白質(zhì)家族，可將ATP水解釋出的能量提供給各種分子進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)（Mbah，2014），在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用（Tameling et al.，2002；Macoveiet al.，2011）。因此，克隆甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因，分析其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能域，探究其在甘蔗應(yīng)答非生物脅迫中的作用機(jī)制，對(duì)甘蔗抗逆育種具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]近年來(lái)，針對(duì)ATP結(jié)合蛋白的研究主要集中在ATP結(jié)合蛋白識(shí)別、結(jié)合和水解ATP功能、脅迫響應(yīng)、序列特征、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能等方面。Gerhardt等（1998）研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中ATP消耗會(huì)導(dǎo)致Vps33p從胞質(zhì)蛋白到顆粒蛋白的快速改變，用葡萄糖恢復(fù)細(xì)胞能量會(huì)逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象，表明囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Vps33p是一種以能量依賴的方式定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的ATP結(jié)合蛋白。Tameling等（2002）研究表明，番茄抗病基因產(chǎn)物I-2和Mi-1是2個(gè)具有ATP酶活性的功能ATP結(jié)合蛋白，其核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）能結(jié)合和水解ATP，發(fā)揮ATP酶活性。Keiko等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟過氧化物酶膜蛋白（PMP70）與ATP結(jié)合蛋白Mdr（P糖蛋白）的序列特征很相似，參與各種生物過程，包括膜運(yùn)輸；PMP70的ATP結(jié)構(gòu)域受細(xì)胞溶質(zhì)影響，是一種可能形成通道的跨膜蛋白，表明PMP70是Mdr糖蛋白相關(guān)的ATP結(jié)合蛋白家族成員。Mohd等（2010）通過序列聚類分析及結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)研究完成了類鼻疽桿菌ATP結(jié)合蛋白序列相似聚類的整個(gè)基因組分類和功能分類，確定了ATP結(jié)合位點(diǎn)，并基于沙門氏菌組氨酸透性酶ATP結(jié)合亞基的晶體結(jié)構(gòu)，成功構(gòu)建了類鼻疽桿菌的ATP結(jié)合蛋白模型。Macovei等（2011）研究了水稻DEAD-box解旋酶家族ATP結(jié)合蛋白（OSABP）對(duì)氯化鈉、脫水、藍(lán)光和紅光等多種非生物脅迫的響應(yīng)，結(jié)果表明，OSABP可能在特定非生物脅迫的細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Joii等（2013）采用?；鵄TP（AcATP）探針法研究擬南芥ATP結(jié)合蛋白組，并對(duì)63個(gè)已知核苷酸結(jié)合袋的標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)表現(xiàn)出豐富的蛋白激酶（Protein kinase-related）遺傳多樣性，其中包括多種LRR受體激酶（LRR-RLKs）。Takenori等（2013）利用一個(gè)串聯(lián)的光激活單元，光解誘導(dǎo)靶蛋白的特定交聯(lián)，將香豆素成功轉(zhuǎn)移到ATP結(jié)合蛋白上，致使交聯(lián)位置產(chǎn)生香豆素?zé)晒鈭F(tuán)，無(wú)需在程序前或后添加一個(gè)檢測(cè)標(biāo)簽就可靈敏地檢測(cè)識(shí)別ATP結(jié)合蛋白，由此研發(fā)出一種ATP結(jié)合蛋白識(shí)別方法。Jun等（2014，2015）利用ATP競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)（ATP和?；?ATP探針之間競(jìng)爭(zhēng)）將非特定蛋白質(zhì)和特定ATP結(jié)合蛋白進(jìn)行區(qū)分，已成功區(qū)分539個(gè)蛋白質(zhì)，其中包括178個(gè)新的ATP結(jié)合蛋白。劉淑芬等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，套作分蘗洋蔥后番茄葉片中出現(xiàn)新蛋白，經(jīng)鑒定其為ATP結(jié)合蛋白，該蛋白在化感潛力強(qiáng)的番茄品種中表達(dá)量較高，且番茄體內(nèi)抗性相關(guān)的蛋白增多，以增強(qiáng)番茄對(duì)逆境的抗性，從而在蛋白質(zhì)水平上驗(yàn)證了套作能增強(qiáng)作物的抗逆能力。此外，Chaput和Szo～ak（2004）、Sheref等（2007）開展了體外進(jìn)化ATP結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)及進(jìn)化分析，并與生物ATP結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，以進(jìn)一步了解ATP結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。陳白雪等（2015）初步研究體外進(jìn)化ATP結(jié)合蛋白的功能，結(jié)果表明，體外進(jìn)化ATP結(jié)合蛋白具有ATP水解活性，其互作能力最強(qiáng)的蛋白是其自身，表明該蛋白易形成自身二聚體。[本研究切入點(diǎn)]目前，有關(guān)甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因結(jié)構(gòu)及分子生物學(xué)功能的研究鮮見報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]克隆甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因，分析其基本生物學(xué)信息及在干旱脅迫下的表達(dá)情況，為該基因的功能和應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試甘蔗品種為新臺(tái)糖22號(hào)（ROC22），由廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室提供。苗期采摘+1葉，-80℃保存?zhèn)溆?。pMD18-T載體和SYBR Premix EX Taq試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Power qPCR PreMix（GENEray，GK8020）試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；cDNA合成試劑盒（TransScript One-StepgONA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2干旱脅迫處理

干旱脅迫試驗(yàn)在避雨大棚中進(jìn)行，甘蔗苗種植于塑料桶中，每桶3株。試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組（CK）和處理組，每組重復(fù)3次。對(duì)照組實(shí)行常規(guī)栽培管理，正常供水；試驗(yàn)組在常規(guī)栽培30 d（苗期）后一次性澆透水后停止供水進(jìn)行干旱脅迫，連續(xù)跟蹤測(cè)定土壤含水量以確定脅迫程度，分別在干旱脅迫7 d（輕度脅迫）、10 d（中度脅迫）、13 d（重度脅迫）及恢復(fù)正常供水后第4 d和第8 d時(shí)取甘蔗+1葉。將樣品迅速進(jìn)行液氮冷凍后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3總RNA提取及cDNA合成

利用RNA提取試劑盒提取甘蔗葉片總RNA；用紫外分光光度計(jì)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度、純度及完整性。利用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.4引物設(shè)計(jì)

根據(jù)乙烯誘導(dǎo)甘蔗差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（羅海斌等，2012）和水分脅迫下甘蔗cDNA文庫(kù)中的ATP結(jié)合蛋白基因序列，設(shè)計(jì)其特異性引物（ATP-F：5-ATGCCAGAGCTGCGAAGCAATACTCGT-3'；ATP-R：5-TCAGCACACGGTTCGTCCGTAGCAGAT-3）。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.5基因克隆

PCR反應(yīng)體系（25.0 uL）：lOxBuffer（Mg2+Plus）2.5uL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.0 uL，ATP-F（10 umol/L）0.5 uL，ATP-R（10 pmol/L）0.5 uL，SYBR Premix EX Taq DNA聚合酶（5 U/uL）0.2 uL，cDNA模板2.0 uL，以ddH20補(bǔ)足至25.0 uL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶。將目的條帶連接至pMDl8-T載體后，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過夜，篩選陽(yáng)性克隆送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

1.6生物信息學(xué)分析

1.6.1核苷酸序列及氨基酸序列分析 將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI在線軟件BLAST進(jìn)行核苷酸序列同源性比對(duì)分析，ORF Finder檢測(cè)cDNA序列的開放閱讀框；采用ClustalX和DNAMAN對(duì)目的基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)。

1.6.2理化性質(zhì)及親/疏水性分析 應(yīng)用Expasy網(wǎng)站的ProtParam對(duì)甘蔗ATP結(jié)合蛋白進(jìn)行氨基酸含量、理論分子量及等電點(diǎn)分析；利用ProtScale對(duì)ATP結(jié)合蛋白進(jìn)行親/疏水性分析。

1.6.3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用SOP-MA預(yù)測(cè)甘蔗ATP結(jié)合蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，利用同源模型服務(wù)軟件SWISS-MODEL進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.6.4蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)預(yù)測(cè) 應(yīng)用SMART、PROSITE和NCBI在線軟件Conserveddomain預(yù)測(cè)甘蔗ATP結(jié)合蛋白的家族、結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。

1.6.5蛋白激酶磷酸化修飾位點(diǎn)及序列特征分析采用KinasePhos預(yù)測(cè)蛋白激酶磷酸化修飾位點(diǎn)，采用MotifScan進(jìn)行蛋白序列特征分析。

1.6.6蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè) 利用TMPRED預(yù)測(cè)甘蔗ATP結(jié)合蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，利用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)甘蔗ATP結(jié)合蛋白的信號(hào)肽，并以在線軟件TargetP和Psort對(duì)甘蔗ATP結(jié)合蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，采用ProtFun 2.2 Server對(duì)甘蔗ATP結(jié)合蛋白進(jìn)行功能分類。

1.7基因相對(duì)表達(dá)量分析

以25S為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)ATP結(jié)合蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)qPCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，ATP結(jié)合蛋白基因引物為qF：5'-CACAAGGACTGGATAATGGAACA-3和qR：5一ATGATTGCTGAGTGTAAGGAGTT-3。內(nèi)參基因引物為qF：5'-ATAACCGCATCAGGTCTCCAAG-3'和qR：5'-CCTCAGAGCCAATCCTTTTCC-3。反應(yīng)體系（20.0 uL）：2XPower qPCR PreMix（with SYBR Green I）10.0 uL，正、反向引物（2 Ixmol/L）各2.0 uL，50XRox Reference Dye 0.4 uL，cDNA模板2.0 uL，ddH2O 3.6 uL。利用Applied Biosystems 7500型熒光定量PCR儀進(jìn)行qPCR。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃10 s，60℃34 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后利用熔解曲線檢測(cè)產(chǎn)物特異性：從60℃緩慢升溫至95℃，每上升1℃采集5次熒光信號(hào)。設(shè)置3次重復(fù)，采用2計(jì)算ATP結(jié)合蛋白的基因相對(duì)表達(dá)量。

2結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

以新臺(tái)糖22號(hào)的葉片總RNA為模板，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得一條清晰條帶，長(zhǎng)度為2000-3000 bp（圖1）。序列分析結(jié)果表明，克隆獲得甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因完整編碼區(qū)的cDNA序列，并將該基因序列提交至GenBank（登錄號(hào)KX908138）。利用ORFFinder分析ATP結(jié)合蛋白基因的開放閱讀框，結(jié)果表明該基因序列全長(zhǎng)2145 bp，包含一個(gè)編碼714個(gè)氨基酸殘基的完整開放閱讀框（圖2）。

2.2同源基因序列比對(duì)結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果提交至NCBI在線軟件BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果（表1）顯示，該序列與玉米（Zea mays）ATP結(jié)合蛋白基因的同源性最高，為93%，與玉米（z mays）蛋白激酶基因的同源性為90%，與小麥（Aegilops tauschii）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、菠蘿（Ananas comosus）、芝麻（Sesamum indicum）和棉花（Gossypium arboreum）的同源基因同源性分別為81%、79%、78%、77%和76%。因此，確定克隆獲得的基因序列即為甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因。

2.3同源蛋白序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建結(jié)果

同源蛋白的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示，甘蔗ATP結(jié)合蛋白與同源蛋白的氨基酸序列均具有低復(fù)雜度區(qū)域（Low complexity region）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（S TKC domain）和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（Pfam domain），說明ATP結(jié)合蛋白基因具有高度保守性；甘蔗ATP結(jié)合蛋白與玉米ATP結(jié)合蛋白的氨基酸序列同源性達(dá)93%。

甘蔗ATP結(jié)合蛋白與其他植物同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹如圖4所示，甘蔗ATP結(jié)合蛋白與玉米ATP結(jié)合蛋白的氨基酸序列同源性最高（95%），表明甘蔗和玉米親緣關(guān)系最近，與同源性比對(duì)分析結(jié)果基本一致

2.4理化性質(zhì)及親/疏水性分析

甘蔗ATP蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，該蛋白含有714個(gè)氨基酸，分子式為C357H5536N1000O1025S30，相對(duì)分子量79.430 kD，理論等電點(diǎn)（pI）9.33，不穩(wěn)定系數(shù)44.38，推測(cè)該蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白；含正電荷氨基酸殘基（精氨酸+賴氨酸）99個(gè)，負(fù)電荷氨基酸殘基（天冬氨酸+谷氨酸）75個(gè)；含丙氨酸8.80%、甘氨酸8.40%、賴氨酸7.60%、亮氨酸7.10%、色氨酸7.00%和脯氨酸6.80%，不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸；親水性平均系數(shù)（GRAVY）為-0.505，說明該蛋白為親水性蛋白。

甘蔗ATP結(jié)合蛋白的親/疏水性分析結(jié)果如圖5所示，該蛋白中親水性氨基酸比例超過50.00%，親水區(qū)域均勻地分布于整個(gè)呔鏈，分值較高；疏水區(qū)域較少，分值較低；在255-275和515-535位各含有一個(gè)疏水性區(qū)域，表明該蛋白可能為具有2個(gè)跨膜區(qū)的親水性蛋白。

2.5蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

甘蔗ATP結(jié)合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖6所示，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，無(wú)規(guī)則卷曲占42.02%，α螺旋占25.63%，延伸鏈占22.27%，B轉(zhuǎn)角占10.08%。表明該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲、α螺旋結(jié)構(gòu)和延伸鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)成。

基于同源建模原理，通過SWISS-MODEL構(gòu)建甘蔗ATP結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型（圖7），其分析結(jié)果顯示，甘蔗ATP結(jié)合蛋白與同源蛋白的序列相似性為41.54%，說明所構(gòu)建的三維模型準(zhǔn)確性較高；該蛋白主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)構(gòu)成，與SOPAM的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。

2.6蛋白質(zhì)家族、結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

甘蔗ATP結(jié)合蛋白的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果（圖8-a）顯示，該蛋白的A處為未知結(jié)構(gòu)位點(diǎn)（1-25 aa），B處為低復(fù)雜度區(qū)域（26-68 aa），C處為未知結(jié)構(gòu)位點(diǎn)（69-154 aa），D處為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（155-410 aa），屬于磷酸轉(zhuǎn)移酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶亞族，E處為未知結(jié)構(gòu)位點(diǎn)（411-714aa）。甘蔗ATP結(jié)合蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果（圖8-b）顯示，甘蔗ATP結(jié)合蛋白包含ATP結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、多肽底物結(jié)合位點(diǎn)和活化環(huán)4個(gè)功能位點(diǎn)，具有6個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別為STKc CKl（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域）、SPS1（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制）、PHA02882（假定的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）、Pkinase（蛋白激酶結(jié)構(gòu)域）、S TKc（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域、磷酸轉(zhuǎn)移酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶亞族）和arch bud32（相關(guān)激酶肽鏈內(nèi)切酶bud32）。2個(gè)軟件的分析結(jié)果均顯示，甘蔗ATP結(jié)合蛋白含有S TKc（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域），屬于蛋白激酶家族成員。

甘蔗ATP結(jié)合蛋白的蛋白家族和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果（圖8-c）顯示，該蛋白的氨基酸序列有1條序列譜（PS50011），與2條模式（PS00107和PS00108）匹配；具有蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（155-432 aa）、蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)（161-192 aa）、ATP核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（161-169 aa）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)（280-292 aa）。

2.7蛋白激酶磷酸化修飾位點(diǎn)及序列特征分析結(jié)果

甘蔗ATP結(jié)合蛋白激酶磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，有50個(gè)絲氨酸激酶、27個(gè)蘇氨酸激酶和30個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，無(wú)組氨酸磷酸化位點(diǎn)；當(dāng)限定值設(shè)為90%時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)22個(gè)絲氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)甘蔗ATP結(jié)合蛋白具有多個(gè)絲氨酸激酶磷酸化修飾位點(diǎn)。

甘蔗ATP結(jié)合蛋白序列Motif（模序）特征預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白具有2個(gè)AMIDATION SITE（酰胺化位點(diǎn)）、2個(gè)ASN GLYCOSYLATION（糖基化位點(diǎn)）、1個(gè)℃AMP PHOSPHO SITE（環(huán)腺苷酸蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)）、7個(gè)CK2 PHOSPHO SITE（酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)）、11個(gè)MYR/STYL SITE（十四烷?；稽c(diǎn)）、6個(gè)PKC PHOSPHO SITE（蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)）、5個(gè)TYR PHOSPHO SITE（酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)）、1個(gè)PROTEIN KINASE ATP（蛋白激酶ATP結(jié)合區(qū)）、2個(gè)PROTEIN KINASE DOM（蛋白激酶結(jié)構(gòu)域）、1個(gè)NLS BP（核定位信號(hào)）、1個(gè)APH（磷酸化轉(zhuǎn)移酶家族）、2個(gè)Pkinase Tyr（蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域）和1個(gè)Octapeptide repeat（八肽重復(fù)），表明甘蔗ATP結(jié)合蛋白可能與抗病及抗逆性相關(guān)。

2.8蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)結(jié)果

2.8.1跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果 甘蔗ATP結(jié)合蛋白跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果（圖9）顯示，該蛋白可能具有3個(gè)跨膜螺旋區(qū)，分別在251-272、514-540和56 1-578 aa，與其親/疏水性分析結(jié)果基本一致，由此推測(cè)該蛋白發(fā)揮膜受體作用，是位于細(xì)胞膜上的錨定蛋白或離子通道蛋白等。

甘蔗ATP結(jié)合蛋白分泌型信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖10）顯示，該蛋白無(wú)信號(hào)肽，說明其定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或細(xì)胞器基質(zhì)中，不屬于分泌蛋白。

2.8.2亞細(xì)胞定位及功能分類結(jié)果 甘蔗ATP結(jié)合蛋白及其同源蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果（表2）顯示，該蛋白基因序列具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體靶向肽、其他細(xì)胞器靶向肽等序列特征，推測(cè)甘蔗ATP結(jié)合蛋白主要位于細(xì)胞的葉綠體、線粒體或其他亞細(xì)胞器。甘蔗ATP結(jié)合蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果（表3）顯示，ATP結(jié)合蛋白主要位于細(xì)胞核，其次是線粒體基質(zhì)和過氧化物酶體。綜上所述，甘蔗ATP結(jié)合蛋白可能主要在細(xì)胞核、葉綠體、線粒體和過氧化物酶體中發(fā)揮作用。甘蔗ATP結(jié)合蛋白的功能分類結(jié)果（表4）顯示，該蛋白為代謝調(diào)控蛋白，但基因本體分類預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，可能參與轉(zhuǎn)錄、免疫應(yīng)答及脅迫應(yīng)答等生物反應(yīng)。

2.9 ATP結(jié)合蛋白基因在干旱脅迫下的表達(dá)情況

qPCR檢測(cè)結(jié)果如圖11所示，在干旱脅迫7 d后，甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因的表達(dá)量明顯下調(diào)，約為對(duì)照的30%，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸穩(wěn)定，但明顯低于對(duì)照，恢復(fù)正常供水（復(fù)水）后，表達(dá)量回升，且隨著復(fù)水時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量與對(duì)照趨于一致。由此推測(cè)ATP結(jié)合蛋白基因在甘蔗抗旱的分子機(jī)制中發(fā)揮調(diào)控作用。

3討論

ATP結(jié)合蛋白能參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫應(yīng)答、脅迫應(yīng)答等生物反應(yīng)，在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用（Tameling et al.，2002；Macovei et al.，2011；Mbah，2014）。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)多以動(dòng)物、微生物和人體組織作為研究對(duì)象，圍繞ATP結(jié)合蛋白在免疫應(yīng)答和抑制病原細(xì)胞發(fā)展等方面的功能研究最廣泛、系統(tǒng)和深入。但關(guān)于ATP結(jié)合蛋白在植物中的作用及其作用機(jī)理的報(bào)道較少，缺乏系統(tǒng)研究。本研究克隆獲得甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因完整編碼區(qū)的cDNA序列，其推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物同源蛋白的氨基酸序列有保守的特異性序列和較高的序列相似性，其中與玉米ATP結(jié)合蛋白的氨基酸序列同源性最高，達(dá)93%，具有潛在的生物學(xué)意義。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是體現(xiàn)生物功能的基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗ATP結(jié)合蛋白主要由α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)成，高度親水性，是一種能形成2-3個(gè)通道的跨膜蛋白。蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化過程是生物體內(nèi)普遍存在的信息傳導(dǎo)調(diào)節(jié)方式，幾乎涉及所有的生理和病理過程，對(duì)蛋白質(zhì)的功能調(diào)節(jié)發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)許多重要的細(xì)胞表面蛋白、識(shí)別蛋白和分泌蛋白均帶有一個(gè)或數(shù)個(gè)糖基，其具有重要的生理功能。本研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗ATP結(jié)合蛋白不僅含有多個(gè)有蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)，還具有蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點(diǎn)、蛋白激酶ATP結(jié)合位點(diǎn)、多肽底物結(jié)合位點(diǎn)、蛋白激酶活性位點(diǎn)、NBS及核定位信號(hào)（NLS BP），由此推斷該蛋白既屬于蛋白激酶家族成員，又屬于ATP結(jié)合蛋白家族成員。許多蛋白家族，包括RAS（Ratsarcoma）族蛋白、ATPase延伸因子、R基因（Resistance gene）編碼蛋白及ATP和GTP的結(jié)合蛋白均含有NBS（Tameling et al.，2002；闕友雄等，2009；張立榮等，2011）。NBs包含激酶-1a或P環(huán)、激酶-2和激酶-3a 3個(gè)ATP/GTP結(jié)合基序，是植物抗病基因中最重要的保守結(jié)構(gòu)域之一（Tameling et al，2002）。本研究克隆獲得甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因，該基因序列包含典型的NBS基序，與抗病抗逆特性具有較大的相關(guān)性（Anser et al.，1996）。ATP結(jié)合蛋白有跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，說明其不屬于分泌蛋白，是由游離的核糖體合成的蛋白質(zhì)，其釋放到胞質(zhì)溶膠中再分別轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體、細(xì)胞核、過氧化物酶體等細(xì)胞器中發(fā)揮作用。本研究亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，該蛋白主要位于細(xì)胞核、線粒體、葉綠體和過氧化物酶體，進(jìn)一步證實(shí)了前人的研究結(jié)論，即Kamijo等（1990）研究發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟過氧化物酶膜蛋白（PMP70）是參與跨過氧化物酶膜主動(dòng)運(yùn)輸?shù)腁TP結(jié)合蛋白，Keiko等（2003）研究發(fā)現(xiàn)菠菜葉綠體膜蛋白是ATP結(jié)合蛋白。由此推測(cè)，甘蔗ATP結(jié)合蛋白是主要位于細(xì)胞核、線粒體、葉綠體和過氧化物酶的膜蛋白。

此外，本研究采用qPCR檢測(cè)甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因的表達(dá)特性，結(jié)果顯示，經(jīng)脅迫處理后，該基因的表達(dá)量呈明顯下調(diào)趨勢(shì)，恢復(fù)正常供水后，其表達(dá)量開始回升，表明該基因與抗旱性相關(guān)，推測(cè)該基因參與甘蔗對(duì)干旱逆境脅迫響應(yīng)的代謝調(diào)控，在甘蔗抗旱分子機(jī)制中發(fā)揮調(diào)控作用。

4結(jié)論

甘蔗ATP結(jié)合蛋白基因表達(dá)受干旱脅迫誘導(dǎo)，可能參與甘蔗對(duì)干旱逆境脅迫響應(yīng)的代謝調(diào)控。