EMS誘變苦蕎突變體與其親本的比較分析

張以忠 鄧琳瓊

摘 要 利用凱氏定氮法、三氯化鋁法、蒽酮比色法、愈創(chuàng)木酚法、KMnO4滴定法、氮藍(lán)四唑NBT光還原法和分光光度法對蕎麥矮桿突變體（M1）、小粒突變體（M2）、早熟突變體（M3）、晚熟突變體（M4）、大葉突變體（M5）和對照（CK）籽粒的蛋白質(zhì)、黃酮、可溶性糖、總?cè)~綠素含量以及葉片的過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、超氧化物岐化酶（SOD）活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：M1黃酮含量和CAT活性顯著高于CK，POD活性顯著低于CK，而蛋白質(zhì)、可溶性糖、總?cè)~綠素含量以及SOD活性與對照間的差異均不顯著。M2黃酮、可溶性糖、總?cè)~綠素含量和CAT活性顯著高于CK，蛋白質(zhì)含量和POD活性與CK間差異不顯著，而SOD活性顯著低于CK。M3的CAT和SOD活性均顯著低于CK，而蛋白質(zhì)、黃酮、可溶性糖、總?cè)~綠素含量以及POD活性與CK均無顯著差異。M4蛋白質(zhì)含量顯著高于CK，CAT活性與CK無顯著差異，M5的CAT 活性顯著高于CK，蛋白質(zhì)含量與CK差異不顯著，而兩者的黃酮、可溶性糖、總?cè)~綠素含量以及POD和SOD活性均顯著高于CK。

關(guān)鍵詞 蕎麥突變體；蛋白質(zhì)；黃酮；可溶性糖；POD；SOD；CAT；葉綠素

中圖分類號 S517 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Comparative Analysis of Fagopyrum tataricum Mutants

and Its Parents in EMS Mutagenesis

ZHANG Yizhong1， 2 *， DENG Linqiong2

1 School of Life Science， Southwestern University， Chongqing 400715， China

2 Ecological Engineering School， Guizhou University of Engineering Science， Bijie， Guizhou 551700， China

Abstract The protein， flavonoid， soluble sugar， total chlorophyll contents and the activity of peroxidase（POD）， catalase（CAT）， superoxide dismutase（SOD）of the mutants of Fagopyrum tataricum including Dwarf mutants（M1）， small-grain mutants（M2）， early-maturity mutant（M3）， late-maturity mutants（M4）， big-leaf mutants（M5）of were studied by means of Kjeldahl， AlCl3， anthrone colorimetry， spectrophotometry， guaiacol， KMnO4 titration， nitro blue tetrazolium（NBT）and photo-reduction methods. The results showed that the flavonoid contents and the CAT activity of M1 were significantly higher than that of CK， POD activity significantly was lower than that of CK. However， the differences of protein， soluble sugar， total chlorophyll and SOD activity were not significant with that of CK. The flavonoid， soluble sugar， total chlorophyll contents and the CAT activity of M2 were significantly higher than that of CK， and the protein contents and the POD activity of M2 were not significantly with that of CK. While the activity of M2 was significantly lower thanthat of CK. The CAT and SOD activity of M3 were significantly lower than that of CK， while the protein， flavonoid， soluble sugar， total chlorophyll contents and the POD activity were no significant difference from that of CK. The protein contents of M4 were significantly higher than that of CK， and the CAT activity was no significant different. The protein contents of M5 were no significant difference from that of CK. But its CAT activity were significantly higher than that of CK. Whereas the contents of flavonoid， soluble sugar， total chlorophyll， POD and SOD were higher than that of CK.

Key words Buckwheat mutants； protein； flavonoid； soluble sugar； POD； CAT； SOD； chlorophyll

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.004

突變體是某個性狀發(fā)生可遺傳變異或某個基因發(fā)生突變的材料，是作物遺傳育種的重要資源，也是開展功能基因研究的重要材料，尤其是具有少數(shù)優(yōu)良性狀的突變體，更是研究功能基因難得的材料[1-3]。突變品種的成功應(yīng)用，在世界范圍內(nèi)促進(jìn)了農(nóng)業(yè)增產(chǎn)，創(chuàng)造了顯著的經(jīng)濟(jì)效益[4-5]。

苦蕎（Fagopyrum tataricum）是蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum Mill）的2個栽培種之一[6]。富含黃酮、蛋白質(zhì)、淀粉、粗纖維、維生素、礦物元素等，能有效地控制糖尿病、預(yù)防心血管硬化、高血壓，增加身體對疾病的免疫力等[7-9]。雖然苦蕎具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，其產(chǎn)品越來越受到人們的喜愛和重視，但蕎麥的低產(chǎn)性嚴(yán)重阻礙了蕎麥產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，高品質(zhì)蕎麥品種的獲得仍然存在一定的挑戰(zhàn)。近年來，由于誘發(fā)突變技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物品種改良，在水稻、小麥、玉米、油菜等多種作物上獲得了一批常規(guī)種質(zhì)資源庫中少見的突變材料，大大提高了傳統(tǒng)作物雜交育種的進(jìn)程，也為功能作物育種和產(chǎn)品開發(fā)提供了重要技術(shù)手段和種質(zhì)資源[10-13]。蕎麥相關(guān)研究雖然滯后于水稻、小麥、玉米等大作物，但由于其自身具有這些大作物中沒有但對人體健康非常重要的特殊成分，越來越受到人們的重視。目前已利用物理誘變方法在蕎麥上獲得了一些突變體，并對其做了一些農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀的研究工作[14-18]。而在蕎麥化學(xué)誘變方面，筆者首次利用化學(xué)誘變劑甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulphonate，EMS）創(chuàng)建了苦蕎突變體，通過篩選，獲得了穩(wěn)定的矮桿突變體（M1）、小粒突變體（M2）、早熟突變體（M3）、晚熟突變體（M4）、大葉突變體（M5）。由于突變體蛋白質(zhì)含量、總黃酮含量、可溶性糖含量、總?cè)~綠素含量、POD活性、CAT活性、SOD活性的變化是評價突變體材料優(yōu)劣的重要指標(biāo)。鑒于此，對這些突變體與原親本進(jìn)行比較分析，摸清它們的品質(zhì)特征及其抗逆性，為其進(jìn)一步利用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的苦蕎親本材料（CK）為貴州畢節(jié)長期栽培的苦蕎品種，矮桿突變體（M1）、小粒突變體（M2）、早熟突變體（M3）、晚熟突變體（M4）、大葉突變體（M5）是利用EMS誘變親本（CK），篩選所獲得的穩(wěn)定株系。

1.2 方法

蛋白質(zhì)和葉綠素含量測定參照文獻(xiàn)[19]、總黃酮含量測定參照文獻(xiàn)[20]、可溶性糖含量測定參照文獻(xiàn)[21]、POD和CAT活性測定參照文獻(xiàn)[19，22]、SOD活性參照文獻(xiàn)[22-23]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，利用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)含量

由不同蕎麥蛋白質(zhì)含量圖可知（圖1），突變體（M1、M2、M3、M4、M5）蛋白質(zhì)含量差異較小，變化范圍為12.57%～14.58%。M4含量最高，為14.58%，是對照（CK）的1.16倍，且差異達(dá)到極顯著水平。M1和M3含量較高，差異較小，分別為13.35%和13.42%。M2和M5含量較低，分別為12.57%和12.86%。M1、M2、M3、M5均高于CK，但差異未達(dá)到顯著水平。

2.2 黃酮含量

由不同蕎麥黃酮含量圖可知（圖2），突變體（M1、M2、M3、M4、M5）黃酮含量在6.47%～9.33%之間。含量最高的是M4，為9.33%，是對照（CK）的1.44倍，且與CK及M1、M2、M3、M5間差異達(dá)到極顯著水平；M5含量次之，為8.05%，極顯著高于CK及M1、M2、M3；M1和M2含量分別為6.98%和7.53%，均極顯著高于CK和M3。M3含量最低，僅為6.47%，與CK無顯著差異。

2.3 可溶性糖含量

由不同蕎麥可溶性糖含量圖可知（圖3），突變體（M1、M2、M3、M4、M5）可溶性糖含量在9.09%～12.88%之間。含量最高的是M5，為12.88%，是對照（CK）的1.32倍，與M4差異不顯著，但極顯著高于CK和M1、M2、M3。M4含量次之，為12.56%，是CK的1.29倍，極顯著高于CK和M1、M2、M3。M2含量為10.94%，顯著高于CK，極顯著高于M1和M3。而M1、M3和CK間均無顯著差異。

2.4 POD活性

由不同蕎麥POD活性圖可知（圖4），突變體（M1、M2、M3、M4、M5）POD活性差異較大，變化范圍為20.00～71.50 △OD470 /（min·g FW）?；钚宰罡呤荕5，為71.50 △OD470 /（min·g FW），是對照（CK）的1.81倍、M1的3.58倍、M2的1.91倍、M3的1.89倍、M4的1.27倍，與M4的差異不顯著，而與CK及M1、M2、M3的差異均達(dá)到極顯著水平。M4活性次之，為56.50 △OD470 /（min·g FW），是CK的1.43倍，且與CK及M1、M2、M3的差異達(dá)到顯著水平。M2和M3活性分別為37.50 和37.83 △OD470 /（min·g FW），兩者與CK均無顯著差異。M1活性最低，僅為20.00 △OD470 /（min·g FW），顯著低于CK及其他突變體。

2.5 CAT活性

由不同蕎麥CAT活性圖可知（圖5），突變體（M1、M2、M3、M4、M5）CAT活性變化較大，范圍為5.50～24.41 mg/（min·g FW）。其中，活性最高是M1，為24.41 mg/（min·g FW），分別是CK、M2、M3、M4、M5的1.41、1.25、4.44、1.44、1.28倍，且與CK及M2、M3、M4、M5的差異均達(dá)極顯著水平。M2、M5的活性分別為19.59、19.04 mg/（min·g FW），差異不顯著，但均顯著高于CK，極顯著高于M3和M4。M4活性為16.94 mg/（min·g FW），低于CK，但差異不顯著。M3活性最低，為5.50 mg/（min·g FW），極顯著低于CK及其他突變體材料。

2.6 SOD活性

由不同蕎麥SOD活性圖可知（圖6），突變體（M1、M2、M3、M4、M5）的SOD變化范圍為236.36 ～301.01 unit/g FW。其中，M5活性最高，為301.01 unit/g FW，M4活性較高，為276.77 unit/g FW，兩者無顯著差異，但均極顯著高于CK及M1、M2、M3。M1活性為 276.77 unit/g FW，與CK差異不顯著，但均極顯著高于M2和M3。M2、M3活性較低，均極顯著低于CK。

2.7 總?cè)~綠素含量

由不同蕎麥總?cè)~綠素含量圖可知（圖7），突變體（M1、M2、M3、M4、M5）的總?cè)~綠素含量變化范圍為1.42～3.05 mg/g。其中，含量最高的是M5，為3.05 mg/g，是CK的1.96倍，且與CK、M1、M2、M3、M4間的差異均達(dá)到極顯著水平。M4和M2含量分別為2.35和1.81 mg/g，均顯著高于CK。M1含量最低，僅為1.42 mg/g，但與CK和M3間的差異均不顯著。

3 討論

蕎麥在抗衰老、抑制脂肪累積、預(yù)防心腦血管病、治療高血壓、降血糖及增強機體免疫力等方面有重要的作用[24-27]，其黃酮和蛋白質(zhì)含量的多少是衡量蕎麥品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[28]。突變體（M1、M2、M3、M4、M5）的黃酮含量在6.47%～9.33%間，遠(yuǎn)高于劉三才等[29]、黃凱豐等[30]、彭鐮心等[31]的研究；蛋白質(zhì)含量在12.57%～14.58%之間，與劉三才等[29]對貴州、四川、云南苦蕎籽粒蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果一致。另外，晚熟突變體（M4）的黃酮和蛋白質(zhì)含量均最高，且極顯著高于對照（CK），值得在高品質(zhì)苦蕎資源的開發(fā)利用中進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

可溶性糖是植物光合作用的主要產(chǎn)物，是植物體能量的供應(yīng)基礎(chǔ)，與植物的生長發(fā)育及抗逆性關(guān)系密切[32-33]，含量的高低可作為作物品種抗逆性及產(chǎn)量的篩選指標(biāo)[34-35]。葉綠素是植物吸收光能進(jìn)行光合作用的色素，是衡量植物光合能力的一個重要指標(biāo)[36-37]。大葉突變體（M5）、晚熟突變體（M4）和小粒突變體（M2）可溶性糖和總?cè)~綠素含量均顯著高于對照（CK），且大葉突變體（M5）和晚熟突變體（M4）與CK間的差異達(dá)到極顯著水平。而早熟突變體（M3）和矮桿突變體（M1）與對照（CK）間的可溶性糖和總?cè)~綠素含量均無顯著差異。實踐中我們發(fā)現(xiàn)，大葉突變體（M5）的抗逆性及株高、主莖分支數(shù)、株粒數(shù)、株粒重、千粒重等均優(yōu)于對照（CK），農(nóng)藝性狀綜合表現(xiàn)極顯著高于對照（CK），而晚熟突變體（M4）、早熟突變體（M3）和小粒突變體（M2）除株高和主莖分支數(shù)優(yōu)于對照（CK）外，株粒數(shù)、株粒重、千粒重等低于對照（CK）， 矮桿突變體（M2）株高等農(nóng)藝性狀指標(biāo)均低于對照（CK）[38]。這說明雖然可溶性糖與植物的生長發(fā)育存在一定的關(guān)系，葉綠素的含量影響植物的光合能力，但僅僅就可溶性糖和葉綠素含量的高低還不能將其作為蕎麥生長發(fā)育及蕎麥產(chǎn)量的篩選指標(biāo)。

過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD） 過氧化氫酶（CAT）是植物體內(nèi)防御活性氧傷害的保護(hù)酶，能有效對植物體內(nèi)的活性氧進(jìn)行清除，在保護(hù)植物免受傷害等方面起著重要的作用，能反映作物抗逆性的強弱和作為品種抗逆性篩選的評價指標(biāo)[39-40]。目前有關(guān)對蕎麥POD活性、SOD活性、CAT活性的研究報道極少，僅發(fā)現(xiàn)龔寧等[22]研究了幾種蕎麥的抗氧化酶活性，發(fā)現(xiàn)苦蕎的POD活性為16.2 △OD470 /（min·g FW）、CAT活性為45.9 mg/（min·g FW）、SOD活性為199 unit/g FW。而突變體（M1、M2、M3、M4、M5）POD活性為20.00～71.50△OD470 /（min·g FW）、CAT活性為5.50～24.41 mg/（min·g FW）、SOD活性為236.36～301.01 unit/g FW。因此，突變體（M1、M2、M3、M4、M5）的POD和SOD活性高于龔寧等的研究，而CAT活性較低于龔寧等的報道。可能是由所考察的蕎麥材料的遺傳差異、栽培的氣候環(huán)境的差異、蕎麥發(fā)育時期的差異等不同所造成。

本研究還發(fā)現(xiàn)，晚熟突變體（M4）和大葉突變體（M5）的蛋白質(zhì)、黃酮、可溶性糖及總?cè)~綠素含量；POD和SOD活性均優(yōu)于對照（CK），因此晚熟突變體（M4）和大葉突變體（M5）在蕎麥?zhǔn)称贰⒈＝∑?、醫(yī)藥品的開發(fā)及蕎麥遺傳育種中都具有很大的潛力，值得進(jìn)一步研究和開發(fā)利用。而矮桿突變體（M1）、小粒突變體（M2）和早熟突變體（M3）無論是對于對照（CK）來說，還是對于晚熟突變體（M4）和大葉突變體（M5）而言，在某些方面都有其不具備的優(yōu)勢特征，這些優(yōu)勢對于蕎麥的進(jìn)一步開發(fā)及利用同樣具有重要的意義。

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