蒙花苷與木犀草素聯(lián)用對離體血管的舒張作用及其機制研究

楊耀　陳波　梁凱倫　蘇潔　陳素紅　呂圭源

[摘要] 為研究蒙花苷與木犀草素聯(lián)用對SD大鼠離體血管環(huán)的舒張作用及其作用機制。采用離體血管環(huán)張力實驗觀察蒙花苷單用（7.5×10-6 g·mL-1）、木犀草素單用（7.5×10-6 g·mL-1）、蒙花苷與木犀草素聯(lián)用（1∶4）對去甲腎上腺素引起的SD大鼠完整、去內(nèi)皮、LNAME及吲哚美辛預處理胸主動脈收縮的影響；Western blot檢測胸主動脈pAkt，peNOS等蛋白水平。實驗結(jié)果顯示，蒙花苷與木犀草素聯(lián)用對完整、去內(nèi)皮及LNAME預處理的血管環(huán)舒張率高于兩者單用；且兩者聯(lián)用能顯著促進血管中pAkt，peNOS蛋白表達。實驗結(jié)果說明蒙花苷與木犀草素聯(lián)用能有效舒張血管，其機制可能是通過激活PI3K/Akt/NO信號通路，增強eNOS活性，從而增加NO的合成與釋放，達到舒張血管的作用。

[關(guān)鍵詞] 蒙花苷； 木犀草素； 聯(lián)用； 血管舒張； 機制； 高血壓

Relaxation effect of buddleoside combined with luteolin on isolated

vessels in vivo and its mechanism

YANG Yao1， CHEN Bo1， LIANG Kailun1， SU Jie1， CHEN Suhong2*， LV Guiyuan1*

（1.Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China；

2.Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310053， China）

[Abstract] To study the relaxation effect of buddleoside combined with luteolin on aortic rings in SD rats and its mechanism. The effect of buddleoside alone（7.5×10-6g·mL-1）， luteolin alone（7.5×10-6g·mL-1） and the combination of buddleoside and luteolin（1∶4） on norepinephrineinduced contractility of complete， endotheliumdenuded， and LNAME and indomethacinpretreated thoracic aorta in SD rats were observed in the in vitro ring tension test. Western blot was used to detect pAkt and peNOS protein expressions in the thoracic aorta. The experimental results showed that buddleoside combined with luteolin could significantly increase the relaxation rate of blood vessels and endothelium and LNAMEpretreated vascular rings compared with the two single administrations. And buddleoside combined with luteolin could also significantly increase pAkt and peNOS protein expressions.The results suggested that the combination of buddleoside and luteolin could effectively relax the blood vessel， and the mechanism may be to increase the synthesis and release of NO and reach the role of relaxing blood vessel by activating PI3K/Akt/NO signaling pathway and enhancing the activity of eNOS.

[Key words] buddleoside； luteolin； combination； vasorelaxation； mechanism； hypertension

高血壓病是以動脈血壓增高為主要臨床表現(xiàn)，是嚴重危害人類健康的常見??；絕大多數(shù)高血壓患者均有不同程度的血管內(nèi)皮功能障礙，而血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的改變又會促進高血壓的發(fā)展[1]。高血壓的發(fā)病機制與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)，是整體調(diào)節(jié)共同作用的結(jié)果；中醫(yī)藥具有多成分、多靶點優(yōu)勢，能有效改善血管內(nèi)皮功能，舒張血管達到降壓的作用[2]。

野菊花是菊科植物菊花Chrysanthemum indicum的干燥頭狀花序，是一種常用的治療高血壓中藥[3]；植物化學研究表明，菊花富含木犀草素和蒙花苷等多種黃酮類化合物，且木犀草素和蒙花苷被認為是其最重要的降壓活性成分[4]。木犀草素（luteolin，LUT）是一種常見的黃酮類化合物，存在于許多類型的植物中，且已被用于中國傳統(tǒng)醫(yī)學治療多種疾病，如高血壓、炎癥性疾病和癌癥等[58]。蒙花苷（buddleoside，BUD）是中藥野菊花中主要的活性化合物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、發(fā)汗、降血壓、抗應(yīng)激、焦慮、解熱等活性[9]。已有研究表明木犀草素血管舒張作用的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系[10]；而蒙花苷對于血管損傷的保護研究甚少。本課題組前期研究表明，蒙花苷與木犀草素聯(lián)用對于自發(fā)性高血壓模型大鼠（SHR）的高血壓治療有明顯的聯(lián)用增效作用，能顯著降低SHR大鼠的收縮壓與舒張壓，降低SHR大鼠血清中內(nèi)皮素（endothelin，ET）的釋放和增加血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）的水平[11]，提示其作用機制可能與舒張血管相關(guān)。因此，本文采用離體大鼠胸主動脈環(huán)模型，觀察研究木犀草素、蒙花苷及其聯(lián)用的舒張血管作用及其機制。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠24只，雄性，體重220～400 g，由浙江省實驗動物中心提供，許可證號SCXK（浙）20140001。

1.2 試劑 蒙花苷（76.01%，實驗室自制）；木犀草素（98%，南京澤朗）；重酒石酸去甲腎上腺素注射液（NE，批號130803，上海禾豐制藥有限公司）；氯化乙酰膽堿（Ach，≥98.0%，上海信帆生物科技有限公司）；戊巴比妥鈉（Sigma分裝，批號WS20130112，上海西唐科技有限公司）；吲哚美辛（indomethacin）、左旋硝基精氨酸甲酯（Lnitro arginine methyl ester，LNAME）均購自美國Sigma公司。RIPA蛋白裂解液、ECL化學發(fā)光液、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶抗體（pAkt，CST公司），磷酸化一氧化氮合酶抗體（peNOS，CST公司），GAPDH抗體（Santa Cruz公司）；氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl2）、氯化鉀（KCl）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4）、硫酸鎂（MgSO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）以及葡萄糖（Glucose）均為國產(chǎn)分析純化學試劑。

1.3 儀器 離體血管灌流實驗系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；張力換能器（上海奧爾科特生物科技有限公司）；ALCMPA2000m生物信號采集處理系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；電熱恒溫水槽（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Powerwave340酶標儀（美國BIOTEK）；MICROCL17微量離心機（美國Thermo）；化學發(fā)光成像儀（MiniChemiⅡ，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

2 方法

2.1 KrebsHenseleit solution液（KH液）配制 A液：MgSO41.2 mmol·L-1；B液：CaCl21.8 mmol·L-1，NaCl 118.1 mmol·L-1；C液：KCl 4.7 mmol·L-1，NaHCO325 mmol·L-1，KH2PO41.63 mmol·L-1；glucose 10.0 mmol·L-1。取A，B母液各50 mL，C母液100 mL，葡萄糖2 g，加去離子水定容到1 000 mL，用pH計和HCl調(diào)至pH 7.4，現(xiàn)配現(xiàn)用（新鮮配制，每只大鼠約需500 mL）。

2.2 離體主動脈環(huán)的制備 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉，剪開胸腔，迅速游離胸主動脈，置于KH液中漂洗。小心剪除血管周圍的脂肪和結(jié)締組織，將主動脈剪成3～5 mm的血管環(huán)。根據(jù)實驗需要，采用機械法，用棉簽?zāi)Σ裂墉h(huán)內(nèi)表面去除內(nèi)皮細胞，將部分血管環(huán)制備成去內(nèi)皮的模型。

2.3 離體主動脈環(huán)固定 將血管環(huán)懸掛于經(jīng)37 ℃預熱，容量為10 mL的浴槽內(nèi)，一端固定，一端通過張力換能器連接生物信號采集系統(tǒng)，在持續(xù)通和95% O25%CO2混合氣體的狀態(tài)下，逐漸調(diào)節(jié)其基礎(chǔ)張力至2 g，并在37 ℃下穩(wěn)定60 min，其間每15 min換液1次。用1 μmol·L-1NE收縮血管環(huán)達峰值，加入濃度為10 μmol·L-1Ach，通過血管舒張的程度檢驗血管內(nèi)皮完整性。以1 μmol·L-1NE誘發(fā)最大收縮幅度為100%，以加入舒張藥物后的血管張力變化幅度與NE誘發(fā)最大收縮幅度之間的比率反映血管張力的變化。

2.4 BUD，LUT和兩者聯(lián)用對血管環(huán)的舒張作用 取內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的血管環(huán)，分為對照組、BUD單用組（7.5×10-6 g·mL-1）、LUT單用組（7.5×10-6 g·mL-1），BUD+LUT聯(lián)用組（1∶4）；各組藥物預先孵育15 min后，加入1 μmol·L-1NE收縮血管環(huán)，觀察不同受試藥對血管的舒張作用；對照組以等量KH液代替受試藥加入。實驗結(jié)束后，將各組血管環(huán)迅速取下，保存于液氮中。

2.5 BUD，LUT和兩者聯(lián)用對不同拮抗劑預處理的血管環(huán)的舒張功能的影響 取內(nèi)皮完整血管環(huán)，血管環(huán)穩(wěn)定后，分為對照組、BUD單用組（7.5×10-6 g·mL-1）、LUT單用組（7.5×10-6 g·mL-1），BUD+LUT聯(lián)用組（1∶4）；分別以 0.1 mmol·L-1LNAME預處理血管環(huán)15 min或10 μmol·L-1吲哚美辛預處理血管環(huán)20 min；再加入相應(yīng)的藥物與血管環(huán)共孵育15 min，最后加入1 μmol·L-1NE收縮血管環(huán)，觀察不同受試藥對血管的舒張作用；對照組以等量KH液代替受試藥加入。實驗結(jié)束后，將各組血管環(huán)迅速取下，保存于液氮中。

2.6 BUD，LUT和兩者聯(lián)用保護離體大鼠血管環(huán)pAkt，peNOS蛋白表達 取上述各實驗保存的離體大鼠血管環(huán)組織，經(jīng)液氮研磨后，加入RIPA蛋白裂解液，提取組織蛋白，然后用BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白經(jīng)8%～10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離后，轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，然后用5%的脫脂奶粉溶液，在搖床上室溫封閉2 h，加入不同一抗：pAkt（1∶1 000），peNOS（1∶1 000），GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次，加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育1 h，PBST洗滌3次。反應(yīng)信號經(jīng)ECL化學發(fā)光液檢測，結(jié)果MiniChemi Ⅱ凝膠成像儀采集圖像，分析結(jié)果。

2.7 統(tǒng)計處理 實驗數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計學方法為單因素方差分析（Oneway ANOVA）并做多重比較（LSD法），P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 BUD，LUT和兩者聯(lián)用對內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張作用 在內(nèi)皮完整血管環(huán)上，BUD和LUT單用及兩者聯(lián)用均可顯著舒張NE引起的血管收縮，且聯(lián)用舒張率更大（P<0.05或P<0.01）；在去內(nèi)皮血管環(huán)上，除BUD單用外，LUT單用及兩者聯(lián)用同樣地均可顯著舒張NE引起的血管收縮，且聯(lián)用舒張率更大（P<0.01）；與內(nèi)皮完整血管環(huán)相比，在去內(nèi)皮血管環(huán)上，BUD，LUT單用及兩者聯(lián)用的舒張率均減小，但僅BUD單用引起的舒張率具有統(tǒng)計學差異（P<0.01），見圖1。

3.2 BUD，LUT和兩者聯(lián)用對LNAME預處理血管環(huán)舒張作用的影響 LNAME預處理血管環(huán)后，LUT單用和兩者聯(lián)用能顯著舒張NE引起的血管收縮，且聯(lián)用舒張率更大（P<0.01）；與未經(jīng)LNAME預處理的血管環(huán)相比，BUD，LUT和兩者聯(lián)用對LNAME預處理的血管環(huán)的舒張率均顯著降低（P<0.01），見圖2。

3.3 BUD，LUT和兩者聯(lián)用對吲哚美辛預處理血管環(huán)舒張作用的影響 吲哚美辛預處理血管環(huán)后，LUT單用和兩者聯(lián)用能顯著舒張NE引起的血管收縮，且聯(lián)用舒張率更大（P<0.01）；與未經(jīng)吲哚美辛預處理的血管環(huán)相比，BUD，LUT單用和兩者聯(lián)用對吲哚美辛預處理的血管環(huán)的舒張率無統(tǒng)計學差異，見圖3。

3.4 BUD，LUT和兩者聯(lián)用對離體大鼠血管環(huán)pAkt，peNOS蛋白表達的影響 BUD，LUT單用及兩者聯(lián)用能顯著增加完整血管環(huán)和去內(nèi)皮血管環(huán)組織中的pAkt，peNOS蛋白水平，且聯(lián)用效果更好；LNAME預處理的血管環(huán)后，血管環(huán)組織中pAkt，peNOS蛋白水平顯著降低，BUD，LUT單用及兩者聯(lián)用能不同程度增加LNAME預處理血管環(huán)組織中pAkt，peNOS蛋白水平的表達，且聯(lián)用效果更好。而BUD，LUT單用及兩者聯(lián)用對經(jīng)吲哚美辛預處理的血管環(huán)組織中pAkt，peNOS蛋白水平的表達無明顯影響，見圖4。

4 討論

近年來，通過動物實驗及體外細胞研究表明，多種中藥及有效成分可通過降血脂、抗氧化損傷、調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞活性物質(zhì)分泌、抗細胞凋亡等達到保護血管內(nèi)皮功能的目的[12]。中藥治療血管內(nèi)皮功能障礙相關(guān)性疾病具有獲得方便、價格低廉、容易被人們接受的獨特優(yōu)勢。雖然中藥抗血管內(nèi)皮損傷的部分作用機制研究已有報道，但中藥復方、提取物的多靶點作用途徑仍需重視，大量研究僅涉及內(nèi)皮細胞的各種分泌因子在中藥藥理作用下的變化，卻未能闡明其調(diào)節(jié)的環(huán)節(jié)和方式。因此，研究具有血管內(nèi)皮細胞保護作用的中藥及中藥復方藥物對心血管疾病的防治研究具有重要意義。

高血壓、動脈粥樣硬化、冠心病、心絞痛等多種心血管疾病狀態(tài)下的血管內(nèi)皮功能障礙的主要原因有eNOS合成/活性的降低，NO生成的減少；血管活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生，O2-與NO反應(yīng)生成ONOO-，導致NO的生物利用度降低；以及脂質(zhì)過氧化和抗氧化能力的降低[13]。ET和NO平衡失調(diào)是內(nèi)皮功能障礙的主要原因之一。NO是一種高度活躍的自由基，并具有舒張血管的功能，它以左旋精氨酸（LArg）為底物，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的催化生成[14]。血管內(nèi)皮上的NO/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）系統(tǒng)在調(diào)節(jié)血管舒縮功能中發(fā)揮著重要作用[15]。PI3K/Akt信號通路的活化能促進內(nèi)皮細胞的存活和血管生成[16]。蛋白激酶Akt是一種調(diào)節(jié)細胞存活、生長和糖代謝的多功能調(diào)節(jié)器；就其心血管功能，Akt激活下游血管生長因子血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和促血管新生蛋白因子使內(nèi)皮細胞存活和確保血管生成[1718]。除此之外，Akt還具有磷酸化eNOS絲氨酸1179或1177位點的能力，誘導內(nèi)皮細胞NO的生成，從而控制血管舒縮功能[19]。

木犀草素具有廣泛的生物活性和藥理作用[2023]。已有研究表明木犀草素保護大鼠心臟組織缺血再灌注損傷通過抑制誘導型一氧化氮合酶表達，降低NO的產(chǎn)生，然后阻止NO與超氧陰離子自由基的作用，從而防止氧化損傷[24]。另有研究發(fā)現(xiàn)木犀草素保護缺血再灌注誘導的心肌細胞損傷是通過改善心肌收縮功能，抑制氧化應(yīng)激，以及激活PI3K/Akt信號通路[25]。且本實驗室前期研究表明，蒙花苷與木犀草素聯(lián)用對于自發(fā)性高血壓模型大鼠的高血壓治療有明顯的聯(lián)用增效作用，能降低SHR大鼠血漿中ET的釋放和增加NO水平[11]。

本實驗采用離體血管環(huán)模型，研究發(fā)現(xiàn)BUD與LUT聯(lián)用能舒張NE引起的血管收縮，對完整及去內(nèi)皮的離體血管環(huán)的舒張率均高于BUD和LUT單用組，且去內(nèi)皮血管環(huán)的舒張率低于完整血管環(huán)；經(jīng)LNAME預處理，抑制血管環(huán)內(nèi)皮eNOS的活性后，血管環(huán)的舒張率均顯著低于完整血管環(huán)，BUD與LUT聯(lián)用能顯著升高LNAME預處理后的血管環(huán)的舒張率，且顯著高于BUD和LUT的單用；而經(jīng)吲哚美辛預處理，抑制血管環(huán)內(nèi)皮環(huán)氧合酶2的活性后，血管環(huán)的舒張率與完整血管環(huán)的舒張率相比，無明顯差異；且BUD，LUT單用及聯(lián)用引起的血管環(huán)舒張率與完整血管環(huán)的舒張率相比，無明顯差異。Western blot結(jié)果顯示經(jīng)去內(nèi)皮、LNAME預處理后，peNOS的表達明顯低于完整血管環(huán)；經(jīng)吲哚美辛預處理后，peNOS的表達與完整血管環(huán)相比無明顯差異。BUD與LUT聯(lián)用均能促進各組血管環(huán)中pAkt，peNOS蛋白水平的表達，并明顯優(yōu)于BUD及LUT單用。上述結(jié)果提示BUD與LUT聯(lián)用舒張血管的方式是內(nèi)皮依賴性舒張作用，且可能是通過增強血管內(nèi)皮eNOS的活性，從而舒張NE引起的血管收縮。

綜上所述，BUD與LUT聯(lián)用舒張血管的作用機制可能是通過PI3K/Akt/NO信號通路，促進eNOS磷酸化而激活eNOS的活性，從而增加內(nèi)皮NO的合成與釋放，達到舒張血管的作用。此外，該研究對于解釋中藥配方的強大優(yōu)勢，相對于單味藥的應(yīng)用，多味藥聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生的更可靠和更強大的效果具有重要的意義。

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[責任編輯 張寧寧]