冬青油促進蛇床子素和桅子苷透皮吸收的研究

高學(xué)成　仝燕

[摘要] 該文擬研究冬青油的體外經(jīng)皮促滲效果及其作用機制。選擇蛇床子素和桅子苷作為親脂性和親水性模型藥物，利用體外透皮試驗測定冬青油的經(jīng)皮促透效果；采用傅利葉變換紅外光譜技術(shù)研究冬青油對大鼠皮膚角質(zhì)層分子結(jié)構(gòu)的影響，并利用掃描電鏡直觀觀察冬青油對大鼠皮膚表皮的影響，探討其經(jīng)皮促透機制。結(jié)果表明，當冬青油達到一定應(yīng)用濃度后對蛇床子素和桅子苷均具良好經(jīng)皮促透效果，但對蛇床子素的促透效果更佳，接近于常用經(jīng)典促透劑月桂氮酮；紅外光譜和掃描電鏡研究顯示，冬青油主要作用于皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)，降低角質(zhì)層致密排列，從而降低皮膚屏障作用。由此可知，冬青油作為促透劑可有效增加親脂性和親水性藥物的透皮吸收，且對親脂性藥物促透效果更佳，這與其作用于皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)而改變皮膚表層致密結(jié)構(gòu)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 冬青油； 促透劑； 透皮吸收； 經(jīng)皮促透機制

Effect of wintergreen oil on in vitro transdermal permeation of

osthole and geniposide

GAO Xuecheng1， TONG Yan2*

（1.Guang′anmen Hospital， China Academy of China Medical Sciences， Beijing 100053， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] The aim of this study was to investigate the transdermal penetration enhancement effect of wintergreen oil and its action mechanisms. The in vitro transdermal tests were carried out to study the transdermal penetration enhancement effect of wintergreen oil by using osthole and geniposide as the lipophilic and hydriphilic model drugs. Fouriertransform infrared spectroscopy was used to investigate the effect of wintergreen oil on the molecular structure of rat stratum corneum， and the scanning electron microscope was employed to observe the change of rat skin surface after treatment by the oil. The wintergreen oil at proper concentrations could effectively promote the transdermal permeation of osthole and geniposide， and exhibited better penetrationenhancing activity for the lipophilic osthole， close to the commonly used classical penetration enhancer azone. The infrared spectroscopy study and scanning electron microscope showed that wintergreen oil mainly acted on the stratum corneum lipids， reduced dense stratum corneum， and reduced the skin barrier function. Thus， the wintergreen oil could effectively facilitate the transdermal absorption of the lipophilic and hydrophilic drugs， resulting from the lowed skin barrier function.

[Key words] wintergreen oil； penetration enhancer； transdermal absorption； transdermal penetration enhancing mechanisms

冬青油，又稱白珠木油，為冬青葉中提取的一種無色或淺黃色植物精油，其主要成分是水楊酸甲酯。冬青油在中藥外用制劑中應(yīng)用廣泛，《中國藥典》2015年版中所收載多種中藥外用制劑中均含冬青油，如麝香鎮(zhèn)痛膏、跌打鎮(zhèn)痛膏、活血止痛膏、傷癤膏等[1]，其在這些中藥外治處方多作為引藥。文獻研究顯示，植物精油成分除其自身藥理活性外，在中藥外用制劑中多發(fā)揮類似經(jīng)皮促透劑作用，具“引藥”功效[23]，從而促進外治處方中有效成分的透皮吸收。

但是，目前尚無研究證明冬青油是否具有類似經(jīng)皮促透劑的作用及其相關(guān)作用機制。雖然中藥成分組成復(fù)雜，但影響藥物透皮吸收的主要因素在于藥物的親脂性和相對分子質(zhì)量，其中，相對分子質(zhì)量通常要求不超過500，因此，本研究分別選擇蛇床子素和桅子苷2種具親脂性和親水性的中藥有效成分為模型藥物，采用體外透皮試驗測定冬青油作為促透劑的經(jīng)皮促透特征。同時，利用傅利葉變換紅外光譜技術(shù)和掃描電鏡研究冬青油對皮膚結(jié)構(gòu)的影響，探討其經(jīng)皮促透機制，從而揭示冬青油在中藥外用制劑處方中的“引藥”作用，并為從中藥中開發(fā)天然經(jīng)皮促透劑提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

TK24BL型體外透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；BS110型電子分析天平（德國Sartourius科學(xué)儀器有限公司）；Quata250型電子掃描電鏡儀（捷克FEI公司）；Nexus型全反射傅利葉變換紅外光譜儀（美國Thermo公司）。

冬青油（吉安盛大香料油有限公司，批號20160702）；蛇床子素（上海源葉生物科技有限公司，批號20151003，純度≥98%）；桅子苷（上海源葉生物科技有限公司，批號20160301，純度≥98%）；月桂氮酮（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號F20110831）；泊洛沙姆188（德國巴斯夫公司，批號WPW1603B）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司，批號112B1220）；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

健康雄性SD大鼠，體重（250±10）g，由北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）20110004。

2 方法

2.1 蛇床子素HPLC含量測定方法 色譜條件 Diamonsil ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相為85%甲醇，流速1 mL·min-1；檢測波長323 nm；進樣量10 μL。蛇床子素的相對保留時間約為9.4 min，透皮接收液中其他成分對其含量測定無干擾，見圖1。

精密稱取蛇床子素適量，用體外透皮試驗的接收液配成質(zhì)量濃度為0.1，0.5，1.0，5.0，10，20，50 mg·L-1的系列對照品樣品，采用上述方法測定，進樣量為10 μL。所測得峰面積（Y）與蛇床子素質(zhì)量濃度（X）具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=23 892.82X-704.19 （r=0.999 9）。低、中、高3個濃度（0.1，5.0，50 mg·L-1）的日內(nèi)日間精密度RSD均小于2.0%，方法回收率在99.00%～101.0%，表明該方法準確、可靠，可用于蛇床子素在體外透皮試驗的含量測定。

2.2 桅子苷HPLC含量測定方法 色譜條件 Diamonsil ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相為20%乙腈，等度洗脫；流速1 mL·min-1；檢測波長240 nm；進樣量10 μL。桅子苷的相對保留時間約為6.3 min，透皮接收液中其他成分對其含量測定無干擾，見圖2。

精密稱取桅子苷適量，用體外透皮試驗的接收液配成質(zhì)量濃度為0.01，0.1，1.0，5.0，10，20 mg·L-1的系列對照品樣品，采用上述方法測定，進樣量為10 μL。所測得峰面積（Y）與桅子苷質(zhì)量濃度（X）具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=5 067.19X-359.49 （r=0.997 5）。低、中、高3個質(zhì)量濃度（0.1，5.0，20 mg·L-1）的日內(nèi)日間精密度RSD均小于3.0%，方法回收率在98.00%～102.0%，表明該方法準確、可靠，可用于桅子苷在體外透皮試驗的含量測定。

2.3 體外透皮試驗 透皮試驗前，取SD大鼠斷頸處死，遞凈腹部體毛后小心剝離，用剪刀和棉球去除

皮下脂肪層后用生理鹽水中洗凈。將制備好的皮膚固定在Fran Z擴散池間（接收液體積為7 mL，有效透過面積為1.77 cm2），角質(zhì)層面朝上，選擇0.01 mol·L-1磷酸緩沖鹽溶液作為桅子苷的接收介質(zhì)；為保證蛇床子素在體外透皮過程中的漏槽狀態(tài)，用含3%泊洛沙姆188的磷酸緩沖鹽作為接收介質(zhì)[4]，水浴溫度設(shè)置為32 ℃，攪拌子轉(zhuǎn)速200 r·min-1，加入藥物溶液前平衡30 min，并排出透皮池內(nèi)氣泡；選擇丙二醇水（80∶20）作為介質(zhì)溶解不同濃度冬青油和藥物后加入到供給池中，在1，2，4，6，8，10，12，22，24 h分別從接收池內(nèi)取樣1 mL，然后補加相同體積等溫新鮮接收介質(zhì)，所取樣品用0.45 μm濾膜過濾后進行含量測定，同時，按如下公式計算藥物的單位面積累積透過量Q（μg·cm-2）。

Q=VCn+n-1i=1Ci/A

其中，V為接收池體積（即7 mL）；Cn和Ci分別為第n次和第i次取樣時接收液中藥物濃度，A為透皮池有效擴散面積。然后用累積透過量對時間回歸作圖，其中直線部分斜率即為藥物透皮穩(wěn)態(tài)流速，直線部分反向延長線與X軸的交點即為滯后時間。同時，將只含溶解介質(zhì)作為對照組，并以其穩(wěn)態(tài)流速作為參比計算各處理組的促透比率。

2.4 傅利葉變換紅外光譜（FTIR）研究 按照2.3項下方法制備離體大鼠皮膚，將大鼠腹皮置于1.0%胰蛋白酶溶液中，37 ℃條件下處理約7 h[5]，然后小心分離皮膚表層角質(zhì)層，并用蒸餾水清洗干凈后置真空干燥箱內(nèi)脫水干燥。取適宜大小角質(zhì)層置于不同濃度冬青油溶液中，其中，選擇透皮試驗中丙二醇水（80∶20）作為冬青油溶解介質(zhì)，并以其作為對照組，在32 ℃條件下浸泡24 h后，用蒸餾水清洗干燥后，進行傅利葉變換紅外光譜測定，其中紅外測定參數(shù)為掃描范圍700～3 500 cm-1，分辯率2 cm-1。各處理組分別重復(fù)測定5次。

2.5 掃描電鏡觀察 按照2.3項下方法制備大鼠離體腹皮樣品，將其放置在不同濃度冬青油溶液中處理24 h，然后將各處理組皮膚洗凈后進行固定漂洗后固定脫水干燥鍍膜處理，采用掃描電鏡觀察各處理組中皮膚角質(zhì)層表面的變化情況。

3 結(jié)果

3.1 冬青油的體外透皮促透效果 為考察冬青油的經(jīng)皮促透特征，并結(jié)合冬青油在中藥外用制劑中的常用濃度范圍，分別配制3個濃度梯度，即0.1%，1.0%，3.0%，研究不同應(yīng)用濃度條件下的冬青油經(jīng)皮促透特征的變化。同時，月桂氮酮作為外用制劑中常用經(jīng)典促透劑，且0.1 mol·L-1（約3%）月桂氮酮是應(yīng)用中最為常用的濃度[6]，因此，選擇3%月桂氮酮在此研究中作為陽性對照組，進一步對比分析冬青油的經(jīng)皮促透特征。

不同濃度冬青油對親脂性藥物蛇床子素和親水性藥物桅子苷的體外經(jīng)皮滲透曲線和相關(guān)經(jīng)皮滲透參數(shù)分別見圖3和表1。隨著應(yīng)用濃度的增加，冬青油對蛇床子素和桅子苷的經(jīng)皮促透比率均逐漸增加，表明冬青油的經(jīng)皮促透作用具濃度依賴性關(guān)系。0.5%，1%，3%冬青油對脂溶性藥物蛇床子素的促透比率分別為1.84，4.87，11.52，而對具親水性藥物桅子苷的促透比率分別為1.79，3.36，5.93，表明冬青油對親脂性藥物的經(jīng)皮促透作用更為顯著，而對親水性藥物的促透效果相對較差。同時，與同濃度的月桂氮酮相比，冬青油對桅子苷的經(jīng)皮促透效果表現(xiàn)相對較差，但是，對蛇床子素的促透效果與月桂氮酮較為接近，提示一定應(yīng)用濃度條件下的冬青油對親脂性藥物的經(jīng)皮促透效果可與月桂氮酮較為接近。

3.2 傅利葉變換紅外光譜學(xué)研究 典型的大鼠皮膚角質(zhì)層脂質(zhì)的對稱和不對稱碳氫振動吸收峰可在紅外吸收光譜中2 850，2 920 cm-1處顯現(xiàn)[7]，角蛋白的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ吸收峰在1 700～1 600 cm-1和1 600～1 500 cm-1

和峰面積體現(xiàn)出來，其中峰位移則提示其相應(yīng)成分結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定改變，而峰面積的改變則表明其對應(yīng)成分含量的變化。因此，可利用紅外光譜研究冬青油對角質(zhì)層中脂質(zhì)和角蛋白成分中次級結(jié)構(gòu)的變化情況。

冬青油作用下大鼠角質(zhì)層中脂質(zhì)和角蛋白相應(yīng)成分對應(yīng)峰位置和峰面積的變化情況見圖4，表2。與對照組相比，0.5%，1.0%，3.0%冬青油作用下，對角質(zhì)層脂質(zhì)中不對稱碳氫振動峰（νasCH2）和對稱碳氫振動峰（νsCH2）的峰位移分別為0.53，2.76，4.63和0.39，1.12，2.39，而對2個角蛋白酰胺吸收峰沒有明顯影響。同時，在冬青油作用下，角質(zhì)層質(zhì)脂不對稱和對稱碳氫振動吸收峰有降低趨勢，且對對稱碳氫振動峰影響更為明顯；而對角蛋白酰胺吸收峰面積影響不顯著，該結(jié)果表明冬青油主要作用于角質(zhì)層脂質(zhì)，在一定程度上改變其分子結(jié)構(gòu)和降低脂質(zhì)成分，降低了角質(zhì)層脂質(zhì)所形成的致密排列結(jié)構(gòu)，從而有利于藥物的透皮吸收。

3.3 掃描電鏡觀察 不同濃度冬青油對大鼠皮膚表面的微觀變化見圖5。正常皮膚表面呈褶皺狀排列，褶皺突起表面相對平滑，當冬青油作用于皮膚后，皮膚表面相對平滑的褶皺突起部分開始出現(xiàn)鱗片狀，且隨冬青油濃度增加而加劇，其中，當冬青油濃度達3%后，皮膚表面褶皺突紋理已表現(xiàn)相對平坦，鱗片狀現(xiàn)象表現(xiàn)更為明顯。該結(jié)果更直觀地展示了冬青油對皮膚表面角質(zhì)層的微觀變化，進一步證實冬青油對皮膚表面角質(zhì)層致密結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致皮膚屏障作用的降低。

4 討論

本研究選擇丙二醇水（80∶20）作為藥物和冬青油的溶解介質(zhì)，一方面是考察到親脂性、親水性模型藥物以及冬青油的溶解性差別，需選擇具較寬溶解范圍的介質(zhì)，而丙二醇水（80∶20）既能溶解親脂性的冬青油和蛇床子素，又能溶解親水性的桅子苷[9]；另一方面，文獻報道該溶劑對皮膚結(jié)構(gòu)影響小，不會改變皮膚的正常分子結(jié)構(gòu)[10]。

體外透皮試驗結(jié)果顯示，當冬青油達到一定濃度后，對親脂性和親水性藥物均具促透作用，但對親脂性藥物的經(jīng)皮促透效果明顯更好。與外用制劑中常用的經(jīng)典促透劑月桂氮酮相比，雖然冬青油對親水性藥物促透效果表現(xiàn)較差，但對親脂性藥的促透效果則已接近于同濃度的月桂氮酮，提示在含親脂性有效成分的中藥外用制劑中可選擇冬青油作為促透劑，以增加有效成分的透皮吸收。

皮膚角質(zhì)層作為藥物經(jīng)皮吸收的主要屏障，主要由角質(zhì)細胞和細胞間脂質(zhì)組成，形成類似“磚泥”的致密結(jié)構(gòu)[11]。其中，相對于富含角蛋白的角質(zhì)細胞，細胞間脂質(zhì)形成脂質(zhì)雙分子層在藥物經(jīng)皮吸收中起著主要作用[12]。冬青油經(jīng)皮促透作用機制的研究表明，冬青油利用其自身的脂溶性特征，不僅可抽提部分角質(zhì)層脂質(zhì)，還在一定程度上破壞了角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，改變表層角質(zhì)層的致密排列，降低皮膚屏障作用，從而有利于藥物的經(jīng)皮轉(zhuǎn)運。

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[責任編輯 孔晶晶]