一株海洋產(chǎn)電菌產(chǎn)堿性蛋白酶的初步研究

李鵬　苗增良　王建鑫

摘 要：從浙江省舟山海域潮間帶中得到一株產(chǎn)電細(xì)菌M2，經(jīng)過16S rRNA分子鑒定及生理生化試驗(yàn)，初步鑒定該菌為Shewanella屬細(xì)菌，并命名為Shewanella sp. M2。菌株M2在脫脂奶平板上能產(chǎn)生明顯且較大的水解透明圈，通過Folin-酚法進(jìn)行酶活測(cè)定，初始蛋白酶酶活為110 U/mL，對(duì)其進(jìn)行紫外誘變處理，最終得到酶活為205 U/mL的突變株，酶活提高了86.4%，傳代試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性能。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)電菌；蛋白酶；Folin-酚法；紫外誘變

堿性蛋白酶在環(huán)保、絲綢、飼料、洗滌劑、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，生產(chǎn)量可以達(dá)到酶制劑總產(chǎn)量的40%，經(jīng)濟(jì)價(jià)值顯著[1]。堿性蛋白酶仍然存在品種單一的問題，酶的活性不高，價(jià)格昂貴，優(yōu)質(zhì)產(chǎn)酶菌株的篩選和選育有著十分重要的應(yīng)用價(jià)值。Kunamneni Adinarayana[2]等發(fā)現(xiàn)一種蛋白酶，將其在60 ℃下保溫350 min，研究發(fā)現(xiàn)該酶仍保持了100%酶活力。Tsuyoshi Nonaka[3]等研究具有抗氧化性能的蛋白酶生產(chǎn)菌，并將其應(yīng)用于洗滌行業(yè)。Raja等[4]利用鹽析及層析方法得到的酶，分子量約為51 000 Da，酶活力提高124倍。如今，在極端環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的堿性蛋白酶已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)[5]。

堿性蛋白酶的高產(chǎn)菌株仍舊集中在枯草桿菌屬，來源較為單一，導(dǎo)致目前的蛋白酶結(jié)構(gòu)也較為單一。目前海洋來源的蛋白酶逐漸成為研究熱點(diǎn)，由于菌株所處環(huán)境的原因，可能生產(chǎn)出具有獨(dú)特酶學(xué)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的蛋白酶。

本實(shí)驗(yàn)室在研究微生物燃料電池過程中發(fā)現(xiàn)一株海洋產(chǎn)電菌Shewanella sp. M2[6]，初始輸出電壓為75 mV，該菌在脫脂奶平板上產(chǎn)生了非常明顯的透明圈，通過酶活檢測(cè)，初始酶活較高，具有很好的選育價(jià)值，而產(chǎn)電菌產(chǎn)蛋白酶的報(bào)道則很少見，菌株M2具有很好的潛在研究?jī)r(jià)值。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 培養(yǎng)基 脫脂奶培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉1.0 g，瓊脂20.0 g，pH 值72～7.4，加熱溶解于1 000 mL海水中，于121 ℃高壓滅菌30 min，備用。脫脂牛奶10.0 g，溶于1 000 mL海水中，于115 ℃滅菌30 min。使用前按照1∶1混勻得到培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基[7-8]：①酪蛋白10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO4 2.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5；②可溶性淀粉40 g，酵母膏5 g，牛肉膏10 g，蛋白胨15 g，NaCl 5 g，K2HPO4 3.5 g，NaH2PO4 0.3 g，Na2CO3 0.56 g，人工海水 1 000 mL，調(diào)pH 7.5；③蛋白胨5.0 g，酵母膏30 g，葡萄糖5.0 g，人工海水 1 000 mL，pH 75；④牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 1.0 g，脫脂奶10.0 g，人工海水1 000 mL，pH 7.5。

產(chǎn)電基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]：NaCl 20.0 g， KCl 0.745 g，NaH2PO4 0.35 g， Na2HPO4 0.44 g， MgSO4 0.188 g，Wolfe 微量元素溶液10 mL，陳海水1 L。

1.1.2 試劑 1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液：將酪氨酸放于100～105 ℃的干燥箱中烘干3 h，冷卻后，稱取0.1 g溶于10 mL 5 mol/L的鹽酸中，再用0.1 mol/L的鹽酸稀釋100 mL，放置于冰箱中保存。

1.1.3 菌種 菌株Shewanella sp. M2，本實(shí)驗(yàn)室篩選鑒定后提供，GenBank登錄號(hào)為KU865683。

1.1.4 產(chǎn)電裝置 利用試劑瓶型的微生物燃料電池測(cè)試產(chǎn)電量。首先，將目標(biāo)菌種在產(chǎn)電液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，冷凍離心，加入陽極室并加入一定量的產(chǎn)電培養(yǎng)基，陰極加入等量產(chǎn)電基礎(chǔ)培養(yǎng)基，測(cè)量電壓。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 平板篩選 將純化后的菌株M2點(diǎn)種于脫脂奶平板上，25 ℃培養(yǎng)，3 d后取出并觀察透明圈的產(chǎn)生。

1.2.2 酶活測(cè)定 將斜面保種的菌株分別接種于4種發(fā)酵培養(yǎng)基，裝量為50 mL/250 mL，控制轉(zhuǎn)速80 r/min，2～3 d后測(cè)酶活。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)酪氨酸在紫外波長(zhǎng)275 nm下具有特征光吸收的原理，利用紫外分光光度法測(cè)定酶促反應(yīng)后在275 nm下的吸光值，得到反應(yīng)生成的酪氨酸的量，從而計(jì)算酶活。按照表1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 酶活測(cè)定

酶活力定義：以酪蛋白為底物，每分鐘水解產(chǎn)生1 μg酪氨酸的酶量為1個(gè)酶活力單位。

發(fā)酵液5 000 r/ min進(jìn)行離心，取上清，進(jìn)行適度稀釋后測(cè)酶活，實(shí)驗(yàn)過程參照表2，試管號(hào)1為空白對(duì)照。

U=（A×K×4）/（10×N）

其中U表示酶活，A表示吸光值，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的系數(shù)，4表示反應(yīng)總體積，10表示反應(yīng)時(shí)間，N為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 紫外誘變 挑取純化后的斜面培養(yǎng)物一環(huán)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃，80 r/min培養(yǎng)3 d，5 000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次，制成一定濃度的菌懸液（OD600=0.5±0.15）進(jìn)行紫外誘變。

紫外燈開啟，照射30 min后，取一定量的菌懸液放入6 cm培養(yǎng)皿中，30 cm垂直照射，先蓋蓋子1 min，后開蓋子，同時(shí)進(jìn)行攪拌（可以滅菌后的大頭針代替轉(zhuǎn)子），照射時(shí)間控制為30、60、90、120、150及180 s。取在各個(gè)時(shí)間處理的菌液0.1 mL，并用無菌水稀釋至10-3濃度，分別在脫脂奶培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)重復(fù)，做空白對(duì)照，涂布后于暗處培養(yǎng)2～3 d后觀察，選取HC比值較大的測(cè)酶活。希望獲得酶活明顯增加的突變菌株。

1.2.4 傳代試驗(yàn)及產(chǎn)電試驗(yàn) 將誘變得到的高產(chǎn)菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定試驗(yàn)，轉(zhuǎn)接12代，分別測(cè)酶活及產(chǎn)電量。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板試驗(yàn)結(jié)果

菌株M2點(diǎn)種于脫脂奶培養(yǎng)基上，3 d后觀察結(jié)果如圖1所示，HC比值為4.3～4.7。

2.2 酶活的測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用100 μg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，以“0”號(hào)管為空白對(duì)照，不同含量的酪氨酸的吸光度值結(jié)果見表3。

吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制結(jié)果見圖2，得到的回歸曲線方程為y=0.009 2 x-0.009 1，R2=0.996 8，R2的值大于0.99，顯然該方程具有較好的線性相關(guān)性。

2.2.2 不同發(fā)酵液的酶活測(cè)定 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，在1-4號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基中測(cè)到的酶活如下表4所示，結(jié)果顯示可溶性淀粉培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基可以獲得較高的酶活，酶活達(dá)到110 U/mL。

2.3 紫外誘變結(jié)果

紫外線誘變結(jié)果顯示，在紫外照射時(shí)間為90～150 s時(shí)候具有較好的觀察結(jié)果，30 s照射時(shí)間導(dǎo)致菌落數(shù)太多無法很好觀察，照射時(shí)間達(dá)到180 s時(shí)則基本沒有菌落生長(zhǎng)，最終在照射時(shí)間為120 s的平板上，測(cè)到HC值為5.8的菌落，進(jìn)行酶活測(cè)定，最終酶活為175 U/mL，相比初始酶活，酶活提高了59.1%，提高顯著。對(duì)M2突變株進(jìn)行產(chǎn)電試驗(yàn)，獲得的輸出電壓為105 mV，比初始輸出電壓75 mV提高了40%。

2.4 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將紫外誘變后的菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果如表4所示，在連續(xù)傳代10代，酶活為160 U/mL，酶活減少8.6%，遺傳性較為穩(wěn)定，12代時(shí)酶活降低到130 U/mL，酶活降低25.7%，此時(shí)產(chǎn)酶穩(wěn)定性顯著降低。輸出電壓也在12代時(shí)降低到70 mV，減少33.3%，輸出電壓的能力也明顯降低。

3 討論

在舟山潮間帶海域中篩選得到一株產(chǎn)電菌Shewanella sp. M2，脫脂奶平板試驗(yàn)顯示其具有產(chǎn)蛋白酶能力，在可溶性淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基得到最大產(chǎn)酶活性，酶活達(dá)到110 U/mL，利用紫外線對(duì)菌株進(jìn)行誘變處理，得到誘變株的酶活為175 U/mL，酶活提高為59.1%，輸出電壓為105 mV，比初始輸出電壓提高了40%，遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，在傳代到10代以后酶活及輸出電壓才有降低，連續(xù)傳代10代的遺傳穩(wěn)定性較高。

為了獲得更加穩(wěn)定而高產(chǎn)的突變菌株，目前誘變育種已經(jīng)與基因工程進(jìn)行很好的結(jié)合。Wang 等[10]從海洋微生物菌株P(guān)seudomonas sp.中發(fā)現(xiàn)OFR編碼一組無信號(hào)肽的氨基酸，在Escherichia coli 成功進(jìn)行表達(dá)。 Jas min等[11]克隆到海洋來源的堿性蛋白酶基因，嘗試構(gòu)建其三維結(jié)構(gòu)。

產(chǎn)電菌多為厭氧菌和兼性厭氧菌，產(chǎn)電菌產(chǎn)蛋白酶的報(bào)道很少，這次研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于深入研究產(chǎn)電菌具有很好的價(jià)值。

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Production of Alkaline Protease by A Marine Electric Bacteria Strain

LI Peng，MIAO Zengliang，WANG Jianxin

（Marine Science & Technology College，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，China）

Abstract：An electricity-producing strain was obtained from Zhoushan intertidal zone in Zhejiang.16 s rRNA molecule identification，physiological and biochemical experiments showed that the strain belongs to Shewanella and was named Shewanella sp. M2. Strain M2 can produce clear and large hydrolysis transparent circle on the skimmed milk tablet. Its initial protease enzyme activity was 110 U/mL determinated by Folin-phenol method. Ultimately the enzyme activity of mutant strains was 205 U/mL after ultraviolet mutation， Enzyme activity increased by 86.4%. Genetic testing showed that the strain has good genetic stability.

Key words：Alkaline Protease；Folin-phenol method；ultraviolet mutation

（收稿日期：2016-12-14）