藥根堿與DNA G-四鏈體的相互作用研究

李俊芬，樊鴿，董川

(1.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程研究中心,山西 太原 030006)

藥根堿與DNA G-四鏈體的相互作用研究

李俊芬1，樊鴿1，董川2

(1.山西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程研究中心,山西 太原 030006)

DNA單鏈(PS2.M)在K+存在下可被誘導(dǎo)形成G-四鏈體。文章利用圓二色譜(CD)以及核磁共振光譜(NMR)表征了G-四鏈體的形成,并通過(guò)熒光滴定光譜、紫外滴定光譜以及核磁共振光譜研究了鹽酸藥根堿與G-四鏈體的相互作用。加入G-四鏈體后,藥根堿在530 nm處的熒光明顯增強(qiáng);紫外吸收光譜表現(xiàn)出減色和紅移現(xiàn)象,說(shuō)明藥根堿可能堆積到G-四鏈體的尾部或者插入到G-四鏈體尾部的兩個(gè)G-四分體之間形成夾心結(jié)構(gòu)。由等摩爾連續(xù)變化法算出藥根堿和DNA的結(jié)合比為1∶1,利用Scatchard方程計(jì)算出二者的結(jié)合常數(shù)為3.12×106L/mol、結(jié)合位點(diǎn)為0.98。實(shí)驗(yàn)表明:鹽酸藥根堿與G-四鏈體有很強(qiáng)的相互作用,藥根堿可以穩(wěn)定DNA的G-四鏈體結(jié)構(gòu),二者的作用模式可能為末端堆積。

鹽酸藥根堿;G-四鏈體;光譜法;Scatchard方程

0 引言

G-四鏈體(G-quadruplex)結(jié)構(gòu)是一種特殊的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)的形成會(huì)對(duì)相應(yīng)基因的表達(dá)水平及體內(nèi)一系列的生物學(xué)功能產(chǎn)生影響,例如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤的形成等。自從1991年Zahle[1]等證實(shí)K+能夠穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)并抑制端粒酶的活性以來(lái),以G-四鏈體為靶點(diǎn),通過(guò)穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)或促進(jìn)G-四鏈體的形成進(jìn)而抑制癌細(xì)胞的增殖[2-5]。 能誘導(dǎo)和穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)的化合物都可能成為潛在的治療癌癥新藥物。近年來(lái),G-四鏈體與配體相互作用的研究成為了腫瘤治療和防治的熱點(diǎn)研究之一,能與G-四鏈體結(jié)合的化合物的研究越來(lái)越引起化學(xué)家的關(guān)注。但是人們對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的研究還不夠透徹,因此篩選出高選擇性、高靈敏的能夠誘導(dǎo)和穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)的配體,仍然是個(gè)難題。

研究表明小檗堿類生物堿能夠穩(wěn)定G-四鏈體,從而抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)[6]。小檗堿對(duì)G-四鏈體具有較高的相對(duì)親和性[7]。藥根堿(Jatrorrhizine)屬季銨型原小檗堿(QPA),它不僅具有抗腫瘤活性高、易于修飾、毒性低等特點(diǎn)。若藥根堿對(duì)DNA四鏈體具有較強(qiáng)的選擇性作用,則可以克服傳統(tǒng)抗腫瘤藥物以雙螺旋DNA為靶點(diǎn)而對(duì)DNA非選擇性的結(jié)合所引起的毒副作用。目前關(guān)于藥根堿與G-四鏈體相互作用的系統(tǒng)研究報(bào)道甚少。

Fig.1 Structural formula of jatrorrhizine圖1 鹽酸藥根堿的結(jié)構(gòu)式

本文采用熒光光譜、紫外可見(jiàn)吸收光譜(UV)、圓二色譜(CD)和核磁共振氫譜(1H-NMR)探討了藥根堿和G-四鏈體DNA的相互作用,有望為潛在的抗腫瘤藥物研究提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器:F-4500型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司),U-2910紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司),MOS 450多功能圓二色譜儀(法國(guó)Bio-Logic公司),LX-200迷你型離心機(jī)(7 000 r/min),AVANCE Ⅲ HD(德國(guó)布魯克公司)。

主要試劑:Tris-HCl緩沖緩沖溶液(5×10-3mol/L,pH=7.4,cK+=0.06 mol/L);鹽酸藥根堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所);其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,實(shí)驗(yàn)所有用水均為二次蒸餾水。DNA(5’-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3’)購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配置

①pH=7.4Tris-HCl緩沖溶液(tris:0.605 5 g,KCl:0.745 5 g,濃鹽酸:41.67 μL,二次水),核磁所用的Tris-HCl由90%二次水和10%氘代水配置而成。

②5×10-3mol/L藥根堿用Tris-HCl緩沖液配制,使用前適當(dāng)稀釋。

③DNA的處理:加入37.1 μL Tris-HCl緩沖溶解,放入90℃水浴鍋中恒溫10 min,待其冷卻到室溫方置于冰箱,4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?5×10-3mol/L),使用時(shí)適當(dāng)稀釋。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1)紫外可見(jiàn)滴定光譜:向1 cm比色皿中加入2.5 mL含Tris-HCl緩沖和8 μL 5×10-3mol/L藥根堿,參比池中加入2.5 mL Tris-HCl,每次分別向比色皿和參比池中滴加0.5 μL DNA,掃描,直到吸光度無(wú)明顯改變。

2)熒光滴定光譜:取700 μL 2.5×10-5mol/L藥根堿加入1 cm熒光杯中,掃描藥根堿的熒光光譜,接著每次滴加0.5 μL DNA進(jìn)行掃描,直至熒光強(qiáng)度幾乎不變(激發(fā)和發(fā)射狹縫設(shè)置:EX=5.0 nm,EM=10.0 nm,激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm)。

3)圓二色譜:取350 μL Tris-HCl緩沖溶液和2.5 μL DNA加入1 cm石英比色皿中,掃描此時(shí)DNA的圓二色譜,每次滴加10 μL藥根堿,依次掃描直到無(wú)明顯變化。

4)核磁共振譜:取500 μL 1.1×10-3mol/L的DNA以及150 μL濃度為3.71×10-3mol/L的DNA和350 μL濃度為1.73×10-3mol/L的藥根堿的混合液分別加入核磁管中,掃描氫譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 藥根堿與G-四鏈體DNA的紫外滴定光譜

紫外吸收光譜能夠反映出化合物環(huán)境或結(jié)構(gòu)的變化。當(dāng)二者發(fā)生作用后,配合物的電子結(jié)構(gòu)就會(huì)受到DNA電荷分布的影響,使得紫外吸收光譜發(fā)生減色和紅移現(xiàn)象或者是增色和藍(lán)移現(xiàn)象。一般來(lái)說(shuō),二者發(fā)生作用時(shí),吸光度改變?cè)酱?說(shuō)明二者的相互作用就越強(qiáng)[8-9]。

從圖1可以看出藥根堿在340 nm附近出現(xiàn)最大吸收峰,依次加入 DNA后其吸光度不斷減弱,減色率為27.9%,最大吸收波長(zhǎng)紅移6 nm,并且分別在356 nm、366 nm、450 nm附近出現(xiàn)了等吸收點(diǎn)。由此說(shuō)明藥根堿與DNA形成了絡(luò)合物,該現(xiàn)象與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似,說(shuō)明在體系中達(dá)到了鍵合平衡。初步推斷藥根堿結(jié)合到了G-四鏈體的尾部或插入到了G-四鏈體的兩個(gè)G-四集體之間形成夾心結(jié)構(gòu)[9-12]。

Fig.2 Ultraviolet titration of jatrorrhizine with DNA，c藥根堿=1.6×10-5 mol/L，curves from up to down圖2 DNA與藥根堿相互作用的紫外滴定光譜。c藥根堿=1.6×10-5 mol/L，曲線由上到下cDNA=0～1.3×10-5 mol/L

Fig.3 Fluorescence spectra titration of jatrorrhizine with DNA. c藥根堿=5×10-5 mol/L，curves from down to up: cDNA=0～3.2×10-5 mol/L圖3 G-四鏈體DNA滴定藥根堿的熒光光譜，c藥根堿=5×10-5 mol/L，曲線由下到上cDNA=0～3.2×10-5 mol/L

2.2 藥根堿與G-四鏈體DNA的熒光光譜滴定

DNA與熒光較弱的小分子發(fā)生嵌插結(jié)合時(shí),會(huì)使其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[13]。從圖3可看出藥根堿本身幾乎沒(méi)有熒光,但是隨著DNA的不斷加入,在425 nm和525 nm左右的峰強(qiáng)度都出現(xiàn)了明顯的增強(qiáng)。這表明藥根堿與G-四鏈體DNA發(fā)生了較強(qiáng)的作用。

采用等摩爾連續(xù)變化曲線法考察藥根堿與G-四鏈體DNA作用的可能的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[14],由熒光發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度對(duì)兩者摩爾比作圖,如圖4示,由圖可看出藥根堿與G-四鏈體DNA之間是單一的鍵合模式, 即1∶1的比例結(jié)合。

當(dāng)G-四鏈體DNA與藥根堿按1∶1比例結(jié)合時(shí),可遵循Scatchard方程[14-15]:

r/cf=K(n-r)

(1)

其中K和n分別指的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn),r是cb/[ct-DNA]的比值,cf=ct-cb是游離的藥根堿濃度,并且cb可以用下列公式計(jì)算:

cb=ct[(F-F0)/(Fmax-F0)]

(2)

其中,藥根堿ct=2.5×10-5mol/L,F0和F分別是藥根堿最大熒光強(qiáng)度和每次加入DNA后的最大熒光強(qiáng)度,Fmax是二者反應(yīng)完全時(shí)的最大熒光強(qiáng)度。根據(jù)(1)及(2),分別以r為橫坐標(biāo),r/cf為縱坐標(biāo),作r-r/cf關(guān)系圖,如圖5所示。由直線的斜率和截距得到的結(jié)合常數(shù)K=3.12×106L/mol,結(jié)合位點(diǎn)n=0.977 6。說(shuō)明藥根堿與G-四鏈體發(fā)生了較強(qiáng)的結(jié)合。

Fig.4 Job’s plot of DNA was obtained by different concentration ratio，plots from left to right was respectively concentration of c藥根堿/cDNA：0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0圖4 藥根堿和DNA作用的等摩爾變化曲線，圖中從左到右各點(diǎn)所代表的摩爾比分別是c藥根堿/cDNA：0、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0

Fig.5 Scatchard plot of G-quadruplex and jatrorrhizine圖5 G-四鏈體和藥根堿相互作用的Scatchard圖

2.3 藥根堿與G-四鏈體DNA相互作用的核磁共振氫譜研究

核磁共振譜圖能夠明了的顯示出小分子與DNA鍵合的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息,亞胺質(zhì)子化學(xué)位移>12.5 ppm,表示的是Watson-Crick堿基對(duì)(NH…N)氫鍵存在;化學(xué)位移在10.5～12 ppm,表示鳥嘌呤的氫鍵(NH…O)的存在,形成了G-四分體[18]。圖6可以看出,未加入藥根堿時(shí),G-四鏈體低場(chǎng)區(qū)出現(xiàn)了四個(gè)峰,表明四分體的形成;加入藥根堿后,其中兩個(gè)峰消失,另外兩個(gè)峰向高場(chǎng)移動(dòng),且峰強(qiáng)度減弱,表明藥根堿與G-四鏈體

Fig.6 CD titration spectra of jatrorrhizine with DNA cDNA=3.5×10-5 mol/L,c藥根堿=0～7.1×10-5 mol/L圖6 藥根堿滴定DNA的圓二色譜，cDNA=3.5×10-5 mol/L,a-g:c藥根堿=0～7.1×10-5 mol/L

Fig.7 1H-NMR spectra of the mixture of jatrorrhizine and DNA (curve 1 is the 1H-NMR curve of interaction between jatrorrhizine and DNA；curve 2 is the 1H-NMR curve of DNA)圖7 藥根堿與G-四鏈體的1H-NMR(曲線1是藥根堿與DNA發(fā)生相互作用后的1H-NMR；曲線2是DNA的1H-NMR)

發(fā)生相互作用,藥根堿與G-四鏈體結(jié)合之后氨基質(zhì)子周圍的電子云密度增大,屏蔽效應(yīng)也隨之增強(qiáng),導(dǎo)致峰位向高場(chǎng)移動(dòng)[17-19]。

3 結(jié)論

本文利用圓二色譜(CD)證實(shí)K+存在下,核酸適配體PS2.M形成了平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu),并通過(guò)熒光滴定光譜、紫外滴定光譜以及核磁共振譜研究了鹽酸藥根堿與G-四鏈體的相互作用。通過(guò)等摩爾連續(xù)變化法推測(cè)藥根堿和DNA的結(jié)合比為1∶1,且紫外滴定光譜的紅移和減色現(xiàn)象表明藥根堿可能堆積在G-四鏈體的尾部,并通過(guò)Π-Π堆積和偶極-偶極相互作用達(dá)到穩(wěn)定;根據(jù)Scatchard方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)達(dá)到106,核磁共振氫譜也同樣表明藥根堿能夠改變DNA的構(gòu)象,形成G-四鏈體。以上結(jié)果均說(shuō)明藥根堿能夠和G-四鏈體發(fā)生很強(qiáng)的作用,并且能夠使G-四鏈體的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,其作用模式可能是末端堆積作用,后期還將對(duì)其作用模式進(jìn)一步研究探討。

[1] Zahler A M,Williamson J R,Cech T R,etalInhibition of Telomerase by G-quartet DNA structures[J].Nature,1991,350(6320):718-720.DOI：10.1038/350718a0.

[2] 鄭小輝,穆舸,譚彩萍,等.G-四鏈體DNA穩(wěn)定劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)科學(xué)：化學(xué)，2014,44:485-488.DOI:10.1360/0302013-340.

[3] Zhao Xiaolong,Liu Xiaoyuan,Yang Ruibo,etal.Research Progress in Interaction between Ruthenium Complexes and G-quadruplex DNA[J].Chemistry,2015,78(10):873-876.DOI:10.14159/j.cnki.0441-3776.2015.10.002.

[4] Gao Chao,Liu Shuyao,Zhang Xian,etal.Two-photon Fluorescence and Fluorescence Imaging of Two Styryl Heterocyclic Dyes Combined with DNA[J].Elsevier,2015:4-6.DOI:10.1016/j.saa.2015.11.014.

[5] Boschi E,Davis S,Touylor S,etal.Interaction of a Cationic Porpluyrion and its Metal Devivatives with G-Quadmplex DNA[J].Journal of Physical Chemistry B,2016,120(50):12807-12819.DOI:10.1021/acs.jpcb.6b09827.

[6] 劉慧，黃承志.熒光碳點(diǎn)與小檗堿類藥物的作用及鹽酸藥根堿的選擇性測(cè)定[J].中國(guó)科學(xué)·化學(xué)，2016，8:810-815.DOI:10.1360/N032015-00200.

[7] 馬彥,黃志紓.高選擇性端粒G-四鏈體穩(wěn)定性配體:9-O-多胺取代小檗堿衍生物的合成及活性評(píng)價(jià)[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2012,33:2219-2221.DOI:10.7503/cjcu20120327.

[8] 黃琦,汪維鵬,鐘文英,等.藥物分子與DNA相互作用的研究方法[J].中南藥學(xué),2004,2:354-356.

[9] 龍玉華.原小檗堿衍生物的合成及其與DNA作用的研究[D].廣州：中山大學(xué),2006:43-50.

[10] 鄢遠(yuǎn),許金鉤,陳國(guó)珍.三維熒光光譜法研究蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象[J].中國(guó)科學(xué)(B輯),1997,27(1):16-22.

[11] 李靜,李景印,郭玉鳳.生物小分子與DNA相互作用的光譜及電化學(xué)研究進(jìn)展[J].化學(xué)學(xué)報(bào),2005,16:101-104.

[12] 孫紅霞,向俊鋒,張亞周,等.光譜法研究G-四鏈體與亞甲藍(lán)之間的相互作用[J].科學(xué)通報(bào),2006,51(9):1022-1026.

[13] Wu Fei.DNA Recognition base on Sequence·Dependent Site Strong Binding of the Alkaloids to DNA Abasic Site[D].Zhejiang Normal University,2013:6-19.DOI:10.1371/journal.pone.0048251.

[14] Prabal Giri,Gopinatha Suresh Kumar.Spectroscopic and Calorimetric Studies on the Binding of the Phototoxic and Cytotoxic Plant Alkaloid Sanguinarine with Double Helical Poly(A)[J].Elsevier,2008,194:111-121.DOI:10.1016/j.jphotochem.2007.07.022.

[15] 孟彥波,張立峰,蔣曄.藥物分子與DNA相互作用分析方法的概述[J].中國(guó)藥師,2010,13:572-574.

[16] 鮑偉偉.G-四聯(lián)體的構(gòu)象調(diào)控及其與小分子配體的相互作用研究[D].溫州：溫州大學(xué),2014:16-28.

[17] Zhou Qiuju,Li Lin,Xiang Junfeng,etal.Fast Screening and Structural Elucidation of G-quadruplex Ligands from a Mixture Via G-quadruplex Recognition and NMR Methods[J].Biochimie,2009,91(2):304-308.DOI:10.1016/j.biochi.2008.10.011.

[18] 周秋菊,向俊鋒,唐亞林.核磁共振波譜在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用[J].波譜學(xué)雜志,2010,27(1):71-73.

[19] Liu Changdong,Zhu Guang.Quadruplex Nucleic Acid Structure Determination by Solution NMR[J].ChineseJournalofMagneticResonance,2015,32(2):151-156.DOI:10.11938/cjmr20150202.

Study on the Interaction of Jatrorrhizine and DNA G-quadruplex

LI Junfen1,FAN Ge1,DONG Chuan2

(1.School of Chemistry and Chemical Engineering,Shanxi University,Taiyuan,Shanxi 030006,China;2.Institute of Chemistry,Environmental-science and Engineering-study Center,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

Single stranded DNA(PS2.M) is induced to fold into G-quadruplex in the presence of K+. The characteristic spectra of G-quadruplex were characterized by NMR and CD, meanwhile the interactionspectra between jatrorrhizine and G-quadruplex was studied by fluorescence spectrum,ultraviolet absorption spectrum and nuclear magnetic resonance, which showed the strong interaction of jatrorrhizine with the G-quadruplex. With the addition of G-quadruplex, the fluorescence spectra show that the fluorescence intensity of jatrorrhizine appeared significant increase in 530nm, and UV spectra show the phenomenon of hypochromic effect and red shift. Jatrorrhizine has strong binding ability with DNA, and the binding mode is intercalation. According to the continuous equivalent change method, it is inferred that the jatrorrhizine and DNA combined with 1∶1. And according to the Scatchard equation,the binding constant is 3.12×106L/mol and the binding site is 0.98. The experiments indicate that jatrorrhizine has strong binding capacity with G4 DNA and combined with DNA by terminal stacking.

jatrorrhizine;G-quadruplex;spectrometry;scatchard equation

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.02.019

2016-10-20；

2016-12-21

國(guó)家自然科學(xué)基金(21105060)

李俊芬(1974-)，女，山西運(yùn)城人, 副教授，博士，研究方向:分子光譜分析及藥物分析,E-mail:junfenli@sxu.edu.cn

O657.3

A

0253-2395(2017)02-0311-05