酶法復合脫毒提高玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵效率

王風芹，謝媱嬛，蘇增平，楊 森，謝 慧，宋安東

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酶法復合脫毒提高玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵效率

王風芹，謝媱嬛，蘇增平，楊 森，謝 慧，宋安東※

（河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物酶工程重點實驗室，鄭州 450002）

利用玉米秸稈發(fā)酵產(chǎn)丁醇在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢。為解除玉米秸稈水解液中多種有毒物質(zhì)對微生物生長的抑制及對發(fā)酵產(chǎn)量的影響，該研究摒除常用的理化脫毒法，選擇高效環(huán)保的酶法脫毒以實現(xiàn)溶劑高產(chǎn)。研究結(jié)果表明：通過優(yōu)化漆酶和甲酸脫氫酶添加量以去除水解液中酚類和甲酸，單獨添加漆酶5 U/mL、甲酸脫氫酶1 U/mL，水解液發(fā)酵的丙酮-丁醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，ABE，總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為1.03和1.11 g/L。再在活性炭的輔助下形成高效酶法復合脫毒體系，經(jīng)復合脫毒處理的水解液發(fā)酵后丁醇產(chǎn)量達2.90 g/L，總?cè)軇〢BE產(chǎn)量達到4.4 g/L，比未作處理的對照組發(fā)酵產(chǎn)量高出約5倍，實現(xiàn)了生物質(zhì)的高效轉(zhuǎn)化。可為玉米秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)燃料丁醇提供參考。

秸稈；發(fā)酵；脫毒；水解液；丙酮丁醇

0 引 ?言

隨著石油資源逐漸耗竭、溫室氣體排放加劇、全球變暖日漸嚴重，生物燃料的生產(chǎn)逐漸受到了世人的廣泛關(guān)注[1]。丁醇作為一種可代替化石燃料的C4有機新能源，相較于乙醇具有熱值辛烷值高，與汽油混合性好，且便于管道輸送等優(yōu)勢[2]。因此，利用微生物進行丙酮-丁醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，ABE）發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料具有廣闊的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)的ABE發(fā)酵原料為玉米或糖蜜，原料成本占總生產(chǎn)成本的30%以上[3]，是導致丁醇價格居高不下的主要原因。木質(zhì)纖維素作為世界上豐富的可再生資源，通過預處理、酶解等多步轉(zhuǎn)化可得到微生物利用的糖[4]。利用玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)丁醇不僅實現(xiàn)了可再生能源的綠色生產(chǎn)，而且避免了每年因大量秸稈焚燒而造成的大氣污染。

玉米秸稈中的纖維素被緊密結(jié)合的木質(zhì)素與半纖維素所包裹，相互以共價鍵結(jié)合[5]。此特殊結(jié)構(gòu)需要經(jīng)過預處理將其打破，進而經(jīng)纖維素酶水解成為微生物所需單糖。在此過程中同時產(chǎn)生抑制微生物生長的副產(chǎn)物，筆者將其分為3類：酚類、醛類和小分子酸。爆破的玉米秸稈經(jīng)酶解糖化的總酚量超過300 mg/L[6]，其中香草醛與丁香醛的質(zhì)量濃度不低于10 mg/L[7]。爆破水解液中的5-羥甲基糠醛質(zhì)量濃度為0.26 g/L，并且2.42 g/L的糠醛量遠高于稀酸處理水解液中的糠醛質(zhì)量濃度0.22 g/L[8]。在高壓長時的爆破條件下，甲酸量最高可為2.2 g/L[9]。這些有毒抑制物雖然含量非常少，但足以影響菌體代謝。副產(chǎn)物通過破壞菌體細胞膜通透性及膜結(jié)構(gòu)[10]使得丙酮丁醇梭菌（）在此環(huán)境脅迫作用下生長提前停滯甚至死亡，丁醇產(chǎn)量隨之受到嚴重影響。Cho等[11]報道了1 g/L的酚類混合物，例如香豆酸、阿魏酸、香草醛和丁香醛明顯抑制了的生長，同時完全抑制了丁醇的產(chǎn)生；當醛類物質(zhì)量濃度為1 g/L時，5%的菌體受到抑制[12]，當糠醛與羥甲基糠醛質(zhì)量濃度分別達到5和8 g/L時菌體不再生長[13]。有研究表明當甲酸含量高達1 mmol/L時菌體生長以及丁醇產(chǎn)量受到嚴重抑制[14]，另外，木質(zhì)纖維素水解過程中約有0.5 g/L的甲酸由木聚糖轉(zhuǎn)化而來[15]，孫彥平等[12]發(fā)現(xiàn)甲酸質(zhì)量濃度達到0.5 g/L時菌體抑制率為88%，1 g/L的甲酸會完全抑制菌體生長。

由此，對水解液進行脫毒成為提升玉米秸稈水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇效率的重要環(huán)節(jié)。常用的脫毒方法主要分為化學法脫毒、物理法脫毒和酶法脫毒?；瘜W法脫毒是通過化學沉淀或改變?nèi)芤簆H值以降低水解液中毒性，最常用的是過中和酸堿脫毒法（overliming），即使用過量固體Ca(OH)2將pH值調(diào)至10～11。Mu等[16]研究了用Ca(OH)2、NaOH和Na2SO3對汽爆玉米秸稈水解液脫毒，結(jié)果表明經(jīng)Ca(OH)2脫毒得到最高ABE產(chǎn)率0.16 g/g（干料）。物理法普遍使用具多孔結(jié)構(gòu)物質(zhì)如活性炭等，主要去除有色物質(zhì)糠醛及羥甲基糠醛[17]。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法與氣提法同樣是2種簡便的物理脫毒法，但這種方法僅去除易揮發(fā)物質(zhì)[18]。另外，離子交換樹脂通過與溶液中抑制物的陰陽離子結(jié)合以達到吸附抑制物的目的。酶法脫毒是根據(jù)酶的特異性催化活性通過改變抑制物的結(jié)構(gòu)或?qū)⑵浞纸舛档推涠拘裕吒咝院蛯Ｒ恍訹19]。以上3種脫毒方法中，理化脫毒法雖效果顯著但存在諸多弊端，譬如糖損失嚴重。王樂[20]采用先過陽離子732樹脂后過陰離子D261樹脂的組合脫毒，脫毒后水解液中糖損失超過30%。同時離子交換樹脂這種化工原料產(chǎn)品會對環(huán)境造成污染。overliming法Ca2+的沉淀損害后續(xù)蒸餾設(shè)備，提高產(chǎn)品提取成本[10]。因此酶法脫毒便成為一種操作簡單，目標明確且對水解液中的糖沒有影響的高效環(huán)保脫毒方法。據(jù)報道過氧化物酶用于生物脫毒法以減少酚類混合物[21]，漆酶脫毒處理可以減少約80%的總酚[22]。Moreno等[23]發(fā)現(xiàn)經(jīng)漆酶處理后的爆破料，糖化后總酚去除率達到60%～80%，經(jīng)脫毒后發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量也明顯高于未脫毒處理。目前，利用木質(zhì)素降解酶去除酚類有毒化合物研究較為廣泛，但對于小分子甲酸，在酶法脫毒方面的研究尚少。

本文研究了漆酶、甲酸脫氫酶（formatedehydrogenase，F(xiàn)DH）和活性炭吸附等脫毒方法對丁醇和總?cè)軇〢BE發(fā)酵的影響，并構(gòu)建了利用活性炭、漆酶和甲酸脫氫酶復合脫毒的新技術(shù)，以期為玉米秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)燃料丁醇提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

菌種：丙酮丁醇梭菌（CICC 8016），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

玉米秸稈：取自河南農(nóng)業(yè)大學毛莊試驗田，于75 ℃烘干后粉碎至10目，在2.0 MPa、150 s的條件下進行高壓蒸汽爆破，并于75 ℃烘干備用。

纖維素酶（455 U/g）和木聚糖酶（2 000 U/g），購自杰能科生物工程有限公司。漆酶（10 U/mg）購自北京華邁科生物技術(shù)有限公司、辣根過氧化物酶（150 U/mg）購自上海源葉生物科技有限公司，甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）（100 U/mL）購自福來格生物有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

5%玉米醪培養(yǎng)基：將玉米粉與水按5∶100（w/v）的比例混合，煮沸5～10 min并不斷攪拌，將制成漿糊狀的玉米醪裝入18 mm×180 mm試管（9 mL/支）和300 mL三角瓶（裝液量270 mL）中，121 ℃滅菌25 min。

玉米秸稈水解液發(fā)酵培養(yǎng)基：稱取一定量爆破后烘干的玉米秸稈，按固液比1∶8(w/v)添加蒸餾水，后用10 mol/LNaOH調(diào)pH值至4.8，每克干物料添加纖維素酶10 FPU、木聚糖酶200 U，48 ℃、150 r/min糖化48 h，過濾后即得玉米秸稈水解液。對照組水解液用NaOH調(diào)pH值至7.0，添加酵母浸粉0.1 g/L，115 ℃滅菌15 min，加入10 mL/L經(jīng)0.22m微孔濾膜過濾的緩沖液[23]。試驗組按照以下步驟（1.3玉米秸稈水解液脫毒）對水解液進行脫毒，然后同對照組水解液相同處理。

P2培養(yǎng)基：50 g/L葡萄糖，0.1 g/L酵母浸粉，115 ℃滅菌15 min，冷卻后加入10 mL/L緩沖液[21]。

1.3 玉米秸稈水解液脫毒

1.3.1 漆酶脫毒

用10 mol/L NaOH將玉米秸稈水解液將pH值調(diào)至4.8，設(shè)置酶濃度梯度依次為0、5、10、15、20 U/mL（corn straw hydrolysate，CSH），50 ℃、150 r/min振蕩反應(yīng)48 h。

1.3.2 甲酸脫氫酶脫毒

用10 mol/L NaOH將玉米秸稈水解液pH值調(diào)整為8.5，加入FDH 1 U/mL（CSH），37 ℃下150 r/min振蕩反應(yīng)24 h。

1.3.3 活性炭吸附脫毒

玉米秸稈水解液調(diào)pH值至5.0，按1%（w/v）的比例加入活性炭后在40 ℃、150 r/min的條件下振蕩處理30 min，過濾除去沉淀備用。

1.3.4 復合脫毒

水解液按以上操作方法分別進行活性炭處理、添加漆酶處理、添加FDH處理（漆酶與FDH的添加量之比為5∶1）。

1.4 玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵

1.4.1 種子液制備

以體積比10%接種量，將玉米醪培養(yǎng)菌種轉(zhuǎn)接到5%的已滅菌玉米醪液體培養(yǎng)基試管中，在100 ℃沸水中熱激80～120 s后迅速放入涼水冷卻，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將已經(jīng)充分活化后的菌種以體積比10%的接種量接種到300 mL三角瓶（含有200 mL的P2培養(yǎng)基）中，放入普通恒溫培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，即發(fā)酵所需種子液。

1.4.2 丁醇發(fā)酵

以10%接種量轉(zhuǎn)接種子液到水解液培養(yǎng)基（試驗證實驗中使用的發(fā)酵培養(yǎng)基為P2培養(yǎng)基），37 ℃靜置發(fā)酵72～108 h。定期取2 mL樣品，12 000 r/min離心10 min后，取上清液，保存于–20 ℃冰箱，待測。

1.5 測定方法

溶劑產(chǎn)量的測定使用Agilent氣相色譜儀。參數(shù)如下，色譜柱: DB-FFAP（30 m×0. 32 mm×1m）；FID檢測器（250 ℃）；進樣溫度200 ℃；柱溫60 ℃；氮氣25 mL/min；氫氣40 mL /min；空氣45 mL/min；內(nèi)標物為異丁醇。

葡萄糖和木糖用Dionex P680高效液相色譜儀，離子排斥色譜柱Aminex HPX-87H，示差折光檢測器進行檢測。流動相0.005 mol/L H2SO4（pH值 2.0），流速0.6 mL/min，柱溫55 ℃。

酚類、醛類使用Waters 2695高效色譜儀，Waters 2489紫外檢測器。流動相為乙酸和甲醇，72%乙酸洗脫0~15 min，再用53%乙酸洗脫15~35 min，流速0.6 mL/min。甲酸使用Dionex ICS-3000離子色譜儀，IonPac AS-11分離柱（4 mm× 250 mm）與IonPac AS 11-保護柱（4 mm×50 mm），1 mmol/L NaOH的淋洗液，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃。抑制型電導，ASRS 3 004 mm，自循環(huán)模式的檢測方式。

1.6 溶劑產(chǎn)生速率和發(fā)酵的率的計算

“有白馬將出護其兵”譯為“but sent out one of their leaders on a white horse to reconnoiter”。唐張守節(jié)正義：其將乘白馬，而出監(jiān)護也?！白o”在這里意為監(jiān)護。而“監(jiān)護”意思是監(jiān)督、監(jiān)領(lǐng)；監(jiān)察保護，由此可知，白馬將是出來監(jiān)護自己的軍隊，而不是李廣的軍隊。“reconnoiter”意為偵查、勘察，很明顯，譯者以為是白馬將出來勘探敵情，與原文不合。這涉及譯者對于代詞的準確理解，這句中的“其”到底指代的是匈奴自己，還是李廣，需要聯(lián)系語境才能確定。

溶劑產(chǎn)生速率(g/(L·h))=（1）

發(fā)酵得率(g/g)=（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶脫毒

酚類物質(zhì)主要由預處理過程中木質(zhì)素的部分降解產(chǎn)生，對微生物的生長和發(fā)酵具有顯著的抑制作用。本研究設(shè)置5個漆酶添加濃度，研究了漆酶對玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖1所示。未經(jīng)脫毒的玉米秸稈水解液（漆酶0 U/mL），丁醇和總?cè)軇〢BE最高產(chǎn)量分別為0.50和0.58 g/L，添加5 U/mL漆酶脫毒處理的水解液丁醇和總?cè)軇〢BE產(chǎn)量在36 h達到最高，分別為0.78和1.03 g/L，較對照分別提高了56%和77.59%。另外結(jié)果顯示過量漆酶的添加反而使丁醇和總?cè)軇〢BE的產(chǎn)量降低，有文獻報道胞外的氧化還原電位可以通過影響胞內(nèi)NADH/NAD+的比例和酶活，從而影響菌體的代謝[24]。單瑞艷等[25]提出Trx二硫化物還原酶系統(tǒng)在微生物的機體氧化還原平衡及細胞增殖中有重要調(diào)節(jié)作用，漆酶作為一種氧化酶，可能是漆酶的過量添加影響發(fā)酵環(huán)境的氧化還原電勢，由此出現(xiàn)產(chǎn)量降低的情況。另外，鄭昀等[26]的試驗結(jié)果顯示適量的漆酶可以提高反應(yīng)速率與對雌酮的去除率，但過量的漆酶會導致酶分子對雌酮的包裹進而催化效率降低。因此催化效率降低同樣也可能是產(chǎn)量降低的原因之一。

圖1 不同質(zhì)量濃度漆酶脫毒對玉米秸稈水解液發(fā)酵溶劑產(chǎn)量的影響

2.2 甲酸脫氫酶脫毒

國內(nèi)外對木質(zhì)纖維素水解液中甲酸的去除研究尚少，本研究為實現(xiàn)甲酸抑制物去除，通過FDH催化甲酸脫氫生成二氧化碳，在不影響還原糖含量的條件下降低甲酸濃度。水解液發(fā)酵研究前以葡萄糖為碳源外添加甲酸鹽進行了初步研究，結(jié)果如圖2所示。P2培養(yǎng)基中添加0.74 g/L甲酸鈉后，溶劑的生成受到顯著抑制，發(fā)酵84 h時丁醇和溶劑的產(chǎn)量達到最大，分別為5.93和8.54 g/L，比未添加甲酸鈉的對照分別降低了44.94%和46.32%；當培養(yǎng)基中添加甲酸鈉并同時添加甲酸脫氫酶，發(fā)酵84 h時，丁醇和總?cè)軇〢BE產(chǎn)量分別達到最大10.17和15.35 g/L，與未添加甲酸鈉和甲酸脫氫酶的對照組相當。表明甲酸脫氫酶能夠?qū)⒓姿嵫趸啥趸己退?，從而解除甲酸對微生物的抑制作用?/p>

本研究利用的玉米秸稈水解液中甲酸質(zhì)量濃度為0.41 g/L，經(jīng)1 U/mL甲酸脫氫酶處理后，甲酸質(zhì)量濃度為0.16 g/L，去除率約61%。通過在水解液中添加甲酸脫氫酶與未處理水解液進行發(fā)酵對比結(jié)果如圖3顯示，添加1 U/mL FDH的試驗組丁醇和總?cè)軇〢BE的產(chǎn)量分別為0.77和1.11 g/L，比對照分別提高了57.14%和60.87%。添加1.5 U/mL FDH的試驗組產(chǎn)量低于對照組，可能是因為當FDH超過最適添加量時傳遞電子過多，由此菌體生長的電子傳遞系統(tǒng)受到影響，進而溶劑產(chǎn)量減少。

圖3 甲酸脫氫酶脫毒對玉米秸稈水解液發(fā)酵溶劑產(chǎn)量的影響

2.3 活性炭脫毒

本研究酶解后的水解液經(jīng)1%的活性炭吸附處理，葡萄糖和木糖損失率均分別為5.60%和5.62%，丁醇發(fā)酵的產(chǎn)量見圖4。經(jīng)活性炭處理的水解液發(fā)酵后丁醇和ABE產(chǎn)量在84 h達到最大值，分別為1.01和1.24 g/L，相比于對照組產(chǎn)量0.38和0.48 g/L，約為對照組的2倍。同時活性炭組葡萄糖和木糖利用率分別為87.5%和25.88%，均高于對照組的糖消耗率（62.38%和20.03%）。

基于以上脫毒試驗效果，復合漆酶、FDH和活性炭處理玉米秸稈水解液，經(jīng)發(fā)酵后結(jié)果見圖5。CK組的丁醇與總?cè)軇〢BE產(chǎn)量在36 h達到最大值，分別為0.47和0.73 g/L，而試驗組由于水解液經(jīng)漆酶去除部分酚類、甲酸脫氫酶去除甲酸以及活性炭輔助脫毒，菌體生長受抑制物影響較少，丁醇與總?cè)軇〢BE產(chǎn)量在60 h時達到最高，分別為2.90和4.4 g/L，分別是CK組的6.2倍和6.0倍。CK組在36 h時葡萄糖消耗達到81%之后木糖與纖維二糖幾乎沒有被利用，而試驗組在24 h將葡萄糖利用完全后開始利用木糖和纖維二糖，木糖利用率達到100%，纖維二糖利用率達到84.64%。

由表1可知，經(jīng)過不同處理方法的玉米秸稈水解液發(fā)酵所得丁醇與總?cè)軇〢BE產(chǎn)量均高于未處理，其中經(jīng)酶法復合脫毒處理的水解液發(fā)酵效果最優(yōu)，分別高出對照組2.43和3.67 g/L，同時遠高于單一的脫毒方法，即活性炭脫毒、漆酶脫毒或FDH脫毒。通過葡萄糖、木糖和阿拉伯糖利用率可看出復合脫毒3種糖被全部利用，而漆酶和FDH試驗組的葡萄糖利用率低于對照組，木糖的利用高于對照組，但ABE得率是對照組的1.5倍。酶法 復合脫毒的ABE得率和生產(chǎn)速率分別是對照組的4倍和3.5倍，同時也高于單一的酶法脫毒。

表1 玉米秸稈水解液未處理與不同處理的發(fā)酵結(jié)果對比

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著（<0.05）

Note：Different lower case letters in the same column mean significant difference among treatments（<0.05）

3 討 論

利用玉米秸稈生產(chǎn)可再生能源的策略對于解決能源危機問題具有重大意義，而木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化過程中形成的多種抑制物需要經(jīng)過有效的脫毒方式去除，以解除對發(fā)酵菌株的抑制和對溶劑產(chǎn)量的不利影響。

漆酶作為一種廣泛應(yīng)用的木質(zhì)素降解酶，對于水解液中的強抑制劑如香草醛、丁香醛、阿魏酸等的去除有顯著效果，由于水解液中酚類的多樣復雜性，作為漆酶底物，其鄰位取代基團不同，致使電子轉(zhuǎn)移給漆酶并穩(wěn)定酚氧自由基結(jié)構(gòu)的能力不一樣，最終使得漆酶對底物催化氧化反應(yīng)活性不一樣[27]，因此，漆酶作為一種木質(zhì)素降解酶并不能完全去除水解液中的多種酚酸。作為具有相同底物結(jié)合能力的過氧化物酶，與漆酶相比，相同底物的作用效果不同，2種酶結(jié)合處理水解液可達到更高的抑制物去除效果，但由于漆酶與過氧化物酶的反應(yīng)條件有差別，考慮到試驗周期及常溫反應(yīng)下的菌體污染，選擇單種酶處理最為適宜。

作為水解液中另一類抑制物甲酸，因其小分子量的特性，難以尋找到一種高效脫毒方式。本研究所用的FDH，來自于重組大腸桿菌，甲酸受其氧化作用而分解。在以葡萄糖為碳源培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果顯示，添加FDH的溶劑產(chǎn)量和對照組未添加甲酸鹽的結(jié)果相近，分別為15.91和15.3 g/L。雖然FDH在此條件下對甲酸的去除率并未達到百分之百，但發(fā)酵結(jié)果接近于完全去除，這可能是由于甲酸對發(fā)酵菌株的抑制作用是在一定濃度范圍內(nèi)，經(jīng)過FDH的處理，培養(yǎng)基中的甲酸濃度已低于丙酮丁醇梭菌的最低抑制濃度，因此在61%的甲酸去除率下，即可得到理想效果。作為NAD+依賴型的FDH，在將甲酸氧化為CO2的同時，又將NAD+還原為NADH[28]。水解液中存在的糠醛和羥甲基糠醛，菌體細胞在抗衡此類抑制物的過程中消耗正常代謝過程中的NAD(P)H，氧化還原平衡被打破[29]，因此FDH的添加再生了輔酶NADH，優(yōu)化了細胞的代謝網(wǎng)絡(luò)。

本文在漆酶和FDH分別成功去除部分酚類和甲酸，活性炭吸附部分抑制物的基礎(chǔ)上將3種有效脫毒方法相結(jié)合，發(fā)酵產(chǎn)量相較于對照組提升約5倍，同時葡萄糖和木糖的利用率達到80%～90%。本文探索了鮮有人研究的水解液中抑制物甲酸的脫毒，但由于水解液中復雜的抑制物成分，單獨的甲酸去除并不能實現(xiàn)溶劑高產(chǎn)，同樣單獨的漆酶處理水解液僅僅對酚類物質(zhì)的抑制起到控制，而其余關(guān)鍵抑制物醛類和甲酸無法去除，為實現(xiàn)溶劑高產(chǎn)，2種酶結(jié)合使用并以最簡便的脫毒方式活性炭脫毒為輔助，由此在這種聯(lián)合脫毒方式下避免了理化脫毒法的盲目脫毒，對3類抑制物特別是甲酸、酚類更有針對性地去除。

本研究的復合脫毒主要優(yōu)勢在于操作簡便環(huán)保，產(chǎn)量提升效果明顯。Zhang等[30]通過用Ca(OH)2對玉米芯進行預處理并酶解糖化，再用NCIMB 8052發(fā)酵產(chǎn)丁醇，結(jié)果顯示未用Ca(OH)2處理的ABE產(chǎn)量比處理過的高出76.25%。沈兆兵等[31]用1%活性炭脫毒玉米皮水解液發(fā)酵產(chǎn)丁醇，ABE產(chǎn)量比未脫毒的提升50.39%。以上單一的理化脫毒水解液對發(fā)酵產(chǎn)量的提升并不多，本研究通過復合脫毒水解液發(fā)酵的ABE產(chǎn)量相比對照提升了近5倍，遠高于理化處理效果。并且本研究提到了水解液中有強抑制作用的甲酸的去除。Guo等[32]對云杉水解液用陰離子交換樹脂脫毒，脫毒后甲酸由0.25降低到0.1 g/L，去除率為60%，相比甲酸脫氫酶的去除較低，與此同時經(jīng)過樹脂脫毒的水解液葡萄糖損失率高達98%。由此可見，復合脫毒玉米秸稈水解液對于產(chǎn)量的提升以及實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展具有深遠意義。

本文結(jié)果顯示，單一的脫毒方式酶法脫毒或是活性炭脫毒，均可提升溶劑產(chǎn)量。僅從丁醇和ABE產(chǎn)量比較單一方法處理玉米秸稈水解液的脫毒效果優(yōu)劣可知：活性炭優(yōu)于漆酶和FDH。活性炭試驗組的溶劑產(chǎn)量、葡萄糖和纖維二糖利用率均顯著高于酶法處理，而酶法脫毒在木糖的利用上顯著高于活性炭處理（<0.05）。經(jīng)FDH處理的水解液發(fā)酵后的溶劑產(chǎn)量同漆酶處理無顯著差異，但得率與生產(chǎn)速率較低，因此單獨添加漆酶比添加FDH更有效果。但是，酶法復合脫毒的高產(chǎn)結(jié)果可能并非是3種處理方法效果的累積。在課題組的試驗步驟中，先利用活性炭吸附法去除大分子物質(zhì)，特別是醛類物質(zhì)，根據(jù)Zhang等[30]的報道推測，醛類物質(zhì)醛基的存在可能會影響漆酶氧化酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性，因此活性炭處理去除部分糠醛和HMF，進而與單一添加漆酶的實驗組相比，漆酶的作用效果有所提升。另外，酚類抑制物對脫氫酶也有一定抑制作用，所以在使用FDH處理水解液前用漆酶去除酚類可能有助于減弱酚類抑制物對FDH活性的影響[33]。因此酶法復合脫毒的最終效果可能是在水解液處理過程中前一脫毒方法的實行使得后一脫毒效果的提升而實現(xiàn)的，從而溶劑產(chǎn)量得到有效提升。

酶法脫毒雖然有著環(huán)保低能耗的優(yōu)勢，但因其成本高，所以并未使其在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化領(lǐng)域產(chǎn)業(yè)化，為實現(xiàn)脫毒過程中低成本高效地利用漆酶與FDH的自身優(yōu)勢，可進行自脫毒發(fā)酵菌株的構(gòu)建，Wang等[25]通過構(gòu)造表達FDH的重組菌DSM 1731（pITF）實現(xiàn)了胞內(nèi)FDH的降解。以此減少購買酶的投入成本，同時避免了前期脫毒處理的能耗。

4 結(jié) 論

本文在漆酶去除酚類物質(zhì)、甲酸脫氫酶去除甲酸的基礎(chǔ)上，利用活性炭輔助脫毒，以實現(xiàn)爆破玉米秸稈水解液中抑制物對丙酮丁醇梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇過程中抑制作用的解除。通過水解液發(fā)酵，結(jié)果顯示單獨使用漆酶和甲酸脫氫酶，丁醇產(chǎn)量和總?cè)軇┫噍^于對照組分別提升0.6倍和0.4倍；最終通過聯(lián)合脫毒，丁醇產(chǎn)量達到2.90 g/L，總?cè)軇〢BE產(chǎn)量達到4.40 g/L，相較于對照組均增長了約5倍。以上結(jié)果顯示，通過酶法復合脫毒，丙酮丁醇梭菌在爆破玉米秸稈水解液中的發(fā)酵效率有明顯提升，達到了高效利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)可再生能源的目的。

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Enzymatic composite detoxification improving effect of butanol fermentation from corn stover hydrolysate

Wang Fengqin, Xie Yaohuan, Su Zengping, Yang Sen, Xie Hui, Song Andong※

(450002,)

Bioethanol has been indispensable in future due to the consumption of fossil fuels, greenhouse effect and environmental degradation. Thus acetone–butanol–ethanol (ABE) fermentation byspecies has played a vital role in production of renewable energy used to relieve the energy crisis. Renewable biomass such as corn stover as a kind of low cost raw material has replaced molasses needed for fermentation. Butanol production from corn stover hydrolysates (CSH) has obvious advantages in the field of biomass conversion. The inhibitory compounds formed during the corn stover pretreatment. Therefore detoxification of hydrolysate can be used to increase butanol production by overcoming inhibitory effects of toxic by-products such as phenols, furfural and acid. All kinds of detoxification especially the physical and chemical methods havesome disadvantages because of the damage of glucose and the pollution of the environment in the downstream process. Among the different detoxification methods, enzymatic detoxification has become a high efficient and environmental-friendly biological method. In order to relieve the influence of a variety of toxic substances in the CSH on microbial growth and fermentation production, the best strategy of detoxification with laccase and formate dehydrogenase(FDH) was studied. The optimum adding content of laccase and FDH was studied to eliminate phenols and formate in hydrolysates, respectively. The results showed that ABE and butanol production from CSH dealt with 5U/mL laccase were respectively 0.78 and 1.03 g/L by fermentation withCICC 8016, which were increased by 56% and 77.59% compared to that from non-detoxified hydrolysate, respectively. However, ABE production was lower than control group when adding laccase greater than or equal to 15U/mL. The production from P2 medium with 0.74g/L formate when adding 1U/mL FDH achieved the same effect with that without adding formate medium. And ABE and butanol production from CSH dealt with 1U/mL FDH were 0.77 and 1.11 g/L, respectively, which were increased by 57.14% and 60.87% compared with that from non-detoxified hydrolysate, respectively. Through the fermentation results with P2 and corn straw hydrolysate as medium, FDH hadan obvious effect for removing formic acid in the medium. In addition, butanol production and glucose consumption were increased by 165.78% and 27.16% respectively through adsorbing treatment with 1% activated carbon. Under this condition, an efficient enzymatic composite detoxification strategywas formed assisted with activated charcoal detoxification. The enzymatic composite detoxification strategy was feasible for the CSH treated by 5U/mL laccase, 1U/mL FDH and 1% activated carbon after steam explosion and pretreatment of corn straw. Butanol and ABE production from composite detoxified CSH were 2.90 and 4.4g/L respectively, which were about 5 times higher than the control group. The utilization of reducing sugar reached 98%-100%, and the yield of ABE increased by 300% compared with the control group. This research provides a reliable detoxification method for butanol fermentation with the hydrolysate of steam exploded corn straw, and the enzymatic composite detoxification strategyis more efficient and environmental-friendlythan the single physical or chemical detoxification method.

straw; fermentation; detoxification; hydrolysate; acetone-butanol-ethanol

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.08.028

TQ35

A

1002-6819(2017)-08-0204-07

2016-09-22

2017-04-14

河南省科技創(chuàng)新人才計劃（164100510016）；河南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃（15IRTSTHN014）

王風芹，女（漢族），河南林州人，副教授，博士，主要從事纖維質(zhì)原料生產(chǎn)燃料乙醇、丁醇研究。鄭州 河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，450002。Email：w_fengqin@163.com。

宋安東，男（漢族），河南宜陽人，教授，博士，主要從事農(nóng)業(yè)生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和生物能源技術(shù)研究。鄭州 河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，450002。Email：song1666@126.com。

王風芹，謝媱嬛，蘇增平，楊 森，謝 慧，宋安東. 酶法復合脫毒提高玉米秸稈水解液丁醇發(fā)酵效率[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2017，33(8)：204－210. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.08.028 http://www.tcsae.org

Wang Fengqin, Xie Yaohuan, Su Zengping, Yang Sen, Xie Hui, Song Andong.Enzymatic composite detoxification improving effect of butanol fermentation from corn stover hydrolysate[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(8): 204－210. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.08.028 http://www.tcsae.org