Keap1/Nrf2信號通路對人肺鱗癌細胞生長、轉移和耐藥的影響

吳媛媛

(滄州市中心醫(yī)院腫瘤內科，河北 滄州 061000)

Keap1/Nrf2信號通路對人肺鱗癌細胞生長、轉移和耐藥的影響

吳媛媛

(滄州市中心醫(yī)院腫瘤內科，河北 滄州 061000)

目的 探討Keap1/Nrf2信號通路對人肺鱗癌細胞株H520生長、轉移和耐藥的影響。方法 使用慢病毒轉染體系建立穩(wěn)定高表達Keap1的H520細胞株模型(H520-Keap1)，同時以Keap1失活的細胞株(H520-GFP)為陰性對照組；采用Western印跡法檢測各組細胞中Keap1、Nrf2蛋白表達，RT-PCR檢測Keap和Nrf2下游靶基因mRNA表達；通過SRB比色法、細胞劃痕實驗、Transwell侵襲實驗、體外細胞藥敏實驗分別檢測各組細胞生長、轉移和耐藥情況。結果 H520-Keap1細胞中Keap1蛋白表達量明顯高于H520-GFP細胞，Nrf2蛋白表達量明顯低于H520-GFP細胞(P<0.01)。H520-Keap1細胞中Keap1 mRNA表達量明顯高于H520-GFP細胞，H520-Keap1細胞中Nrf2下游靶基因Akr1c1、Nqo1、Gclc、Gclm mRNA相對表達量明顯高于H520-GFP細胞(P<0.01)。SRB比色法檢測顯示，第1～3天，H520-GFP與H520-Keap1細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第4天起H520-Keap1細胞增殖率明顯低于H520-GFP(P<0.05)。H520-GFP細胞遷移率明顯高于H520-Keap1細胞(P<0.01)；H520-GFP細胞的侵襲數明顯高于H520-Keap1細胞(P<0.01)。H520-Keap1細胞對卡鉑、吉西他濱的敏感性增加。結論 Keap1過表達可影響人肺鱗癌H520細胞中Nrf2及其下游靶基因表達，抑制癌細胞生長和轉移，提升對卡鉑和吉西他濱的敏感性。

肺鱗癌；H520細胞；Keap1；Nrf2

肺鱗癌約占肺癌總數的80%，化療藥物耐受性是治療失敗的主要原因〔1〕。Keap1/Nrf2信號通路在細胞氧化應激中發(fā)揮關鍵作用〔2〕。研究發(fā)現，腫瘤發(fā)展過程中該信號通路發(fā)揮兩種不同作用，Nrf2可預防腫瘤產生，但在已形成的腫瘤組織中Nrf2異常表達會促進腫瘤生長〔3〕；Keap1是Nrf2的內源性酶抑制劑，可調控Nrf2的表達水平〔4〕。目前，Keap1/Nrf2信號通路對肺鱗癌細胞增殖、遷移、耐藥方面影響的研究鮮有報道，本研究旨在探討Keap1/Nrf2信號通路對肺鱗癌細胞生物學功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肺鱗癌細胞株H520購于上海桑戈生物科技有限公司；真核重組質粒pGFP、pm Keap1-GFP購于上海舜百生物科技有限公司；DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Amresco公司；一抗Keap1、Nrf2、β-actin購于上海鈺博生物科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購于北京博然一新科技有限公司；SYBR Green試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司；卡鉑、吉西他濱購于齊魯制藥有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染 取對數期人肺鱗癌細胞H520，分為：①未轉染組；②陰性對照組：轉染慢病毒載體質粒pGFP(Lv-GFP)；③研究組：轉染過表達Keap1慢病毒載體質粒(Lv-Keap1)。取對數生長期H520細胞，接種于6孔板中，每孔根據病毒感染效率加入病毒液。加5 μg/ml溴化乙二甲銨，5 h后加血清，36 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)60 h后熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.2.2 Western印跡檢測 收集3組細胞，蛋白裂解后行蛋白定量，取50 μg蛋白，滴加上樣緩沖液，沸水浴加熱使蛋白變性后，電泳、轉膜、BSA封閉，滴加1∶1 000稀釋的Keap1、Nrf2、β-actin單克隆抗體，孵育過夜，加HRP標記的二抗，曝光后檢測3組細胞中Keap1、Nrf2蛋白表達情況。

1.2.3 RT-PCR檢測 提取3組細胞總RNA，逆轉錄得到cDNA，-20℃保存；Keap1和Nrf2下游靶基因(Akr1c1、Nqo1、Gclc、Gclm)引物序列由北京賽百盛基因技術有限公司合成；RT-PCR總反應體系30 μl(上、下游引物各1 μl，cDNA 0.5 μl，Taq酶15 μl，雙蒸水12.5 μl)；反應條件：95℃變性20 min，93℃ 40 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，共40個循環(huán)。

1.2.4 SRB比色法檢測3組細胞的增殖情況 取對數生長期3組細胞，按每孔2 000個細胞接種到96孔板中，每孔加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液150 μl，孵育24 h，10%三氯乙酸固定90 min，蒸餾水沖洗；每孔加入5 mg/ml的SRB溶液50 μl，室溫下靜置30 min，1%冰醋酸沖洗；每孔加入5 mmol/L的Tris，振蕩至晶體完全溶解，讀取510 nm波長處的吸光度值，設置3個復孔。

1.2.5 體外細胞遷徙和侵襲實驗 取對數期H520-GFP、H520-Keap1細胞，按1×106/孔的密度接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后在細胞表面用無菌注射器針頭制造劃痕，洗去漂浮細胞，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基拍照，培養(yǎng)24 h后拍照，比較細胞遷移率。將H520-GFP、H520-Keap1細胞以相同密度接種Transwell小室，含血清的DMEM培養(yǎng)基150 μl，下室加入500 μl無血清培養(yǎng)基，孵育24 h，結晶紫染色40 min，除去上室細胞，磷酸緩沖液沖洗，光學顯微鏡下隨機選取3個視野行細胞計數并拍照。

1.2.6 體外細胞藥敏檢測 取對數期H520-GFP、H520-Keap1細胞，2 000 r/min離心10 min，棄去上清，DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，計數后按5 000個/孔密度接種到96孔板中，每孔滴加150 μl細胞培養(yǎng)液，孵育24 h，加入不同濃度的吉西他濱、卡鉑，設置3個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，SRB比色法檢測細胞存活率，計算藥物對細胞增殖的IC50。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 質粒轉染人肺鱗癌細胞H520細胞情況 H520-GFP、H520-Keap1細胞轉染效率均>90%，見圖1。因Keap1蛋白主要在細胞質中表達，因此H520-Keap1細胞僅細胞質中存在綠色熒光。

圖1 H520-GFP和H520-Keap1細胞轉染效率(×200)

2.2 H520-Keap1細胞中Keap和Nrf2蛋白表達 H520-GFP、H520-Keap1細胞中Keap1蛋白表達量分別為(4.31±1.82)、(9.24±1.06)；Nrf2蛋白表達量分別為(7.35±1.51)、(3.82±0.94)。H520-Keap1細胞中Keap1蛋白表達量明顯高于H520-GFP細胞，Nrf2蛋白表達量明顯低于H520-GFP細胞(P<0.01)，見圖2。

圖2 3組細胞中Keapl和Nrf2蛋白表達情況

2.3 H520-Keap1細胞中Keap1 mRNA和Nrf2下游靶基因表達 H520-GFP、H520-Keap1細胞中Keap1 mRNA相對表達量分別為(1.17±0.31)、(7.69±1.44)，H520-Keap1細胞中Keap1 mRNA表達量明顯高于H520-GFP細胞(P<0.01)。H520-Keap1細胞中Nrf2下游靶基因Akr1c1、Nqo1、Gclc、Gclm mRNA相對表達量分別為(1.95±0.20)、(2.07±0.64)、(1.32±0.08)、(1.62±0.46)，明顯高于H520-GFP細胞中的(3.95±0.73)、(5.67±0.41)、(3.61±0.39)、(4.38±0.66)(P<0.01)。

2.4 過表達Keap1對H520細胞增殖的影響 第1～3天，H520-GFP與H520-Keap1細胞增殖率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第4天起H520-Keap1細胞增殖率明顯低于H520-GFP(P<0.05)，見表1。

2.5 過表達Keap1對H520細胞遷移和侵襲力的影響 劃痕實驗顯示，24 h時H520-GFP細胞遷移率為(53.61±9.37)%，明顯高于H520-Keap1細胞的(36.28±6.32)%(P<0.01)。Transwell侵襲實驗顯示，H520-GFP細胞的侵襲數(291.53±21.27)個/高倍鏡視野，明顯高于H520-Keap1細胞的(148.20±12.16)個/高倍鏡視野(P<0.01)，見圖3。

與H520-GFP細胞比較：1)P<0.05

圖3 H520-GFP和H520-Keap1細胞侵襲能力(×100)

2.6 過表達Keap1對H520細胞化療藥物敏感性的影響 卡鉑、吉西他濱分別作用48 h后空白對照組H520細胞生長良好，卡鉑給藥組和吉西他濱給藥組均呈現劑量依賴的增殖抑制作用。其中卡鉑對H520細胞、H520-GFP細胞、H520-Keap1細胞的IC50分別為(87.51±5.63)μmol/L、(106.70±11.87)μmol/L、(51.06±4.64)μmol/L；吉西他濱IC50分別為(9.43±0.51)μmol/L、(9.86±0.48)μmol/L、(6.72±1.16)μmol/L，提示過表達Keap1的H520細胞株對卡鉑、吉西他濱的敏感性增加。

3 討 論

細胞抗氧化反應過程中Nrf2發(fā)揮中樞調節(jié)作用，是細胞正常狀態(tài)下抵抗外界不良刺激所產生的保護性應激反應的重要調控因子〔5〕。Keap1是Nrf2的內源性酶抑制劑，細胞質中Keap1與Nrf2結合后可介導其降解；但細胞處于氧化應激狀態(tài)

時，親核試劑和應激源作用于Keap1，誘發(fā)其構象改變，Keap1與Nrf2相互解離后失去介導Nrf2降解的活性，引發(fā)胞內Nrf2高表達〔6〕。中國目前對晚期肺鱗癌的治療仍首選化療，但耐藥性的產生常導致治療低于預期。相關研究顯示，癌細胞中因Keap1突變導致細胞核中Nrf2大量積累，Nrf2表達水平上升，會增加二相解毒酶、抗氧化酶基因、藥物泵基因等Nrf2調控的下游基因表達水平，加速抗腫瘤藥物在胞內的代謝速度，產生腫瘤細胞耐藥性〔7〕。研究發(fā)現，人卵巢癌細胞株對順鉑、奧沙利鉑的耐藥性與Nrf2表達水平呈明顯正相關〔8〕。本研究結果顯示，過表達Keap1可明顯提升H520細胞對卡鉑、吉西他濱的敏感性，可為提升肺鱗癌化療效果提供新的途徑。

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2 王大朋.Keap1-Nrf2/ARE信號通路在砷致HaCaT細胞惡性轉化過程中的動態(tài)變化及其機制研究〔D〕.蘇州：蘇州大學，2015.

3 Koenigkam Santos M，Muley T，Warth A，etal.Morphological computed tomography features of surgically resectable pulmonary squamous cell carcinomas：impact on prognosis and comparison with adenocarcinomas〔J〕.Eur J Radiol，2014；83(7)：1275-81.

4 張逸平，李正祎.IL-24聯(lián)合大蒜素體外抗肺癌細胞生長的實驗研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2016；17(3)：335-8.

5 Zhu YJ，Xu B，Xia W，etal.Hsa-mir-182 downregulates RASA1 and suppresses lung squamous cell carcinoma cell proliferation〔J〕.Clin Lab，2014；60(1)：155-9.

6 楊勵勵.2010-2013年錦州市居民惡性腫瘤死亡原因分析〔J〕.中國衛(wèi)生工程學，2016；15(1)：75-6.

7 Fode MM，Hilberg O，Bendstrup E，etal.Squamous cell carcinoma of the lung in lung transplantation--A relation to human papilloma virus〔J〕?Acta Oncologica，2012；51(6)：812-3.

8 Kim MJ，Shin HC，Shin KC，etal.Best immunohistochemical panel in disting adenocarcinoma from squamous cell carcinoma of lung：tissue microarray assay in resected lung cancer specimens〔J〕.Ann Diagnost Pathol，2013；17(1)：85-90.

〔2016-12-11修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

滄州市科技技術局項目(162302040)

吳媛媛(1978-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤相關疾病的臨床診治研究。

R73

A

1005-9202(2017)09-2123-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.018