不同膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的比較

吳向陽(yáng) 柳奇奇 汪宗保 盧陶陶 喬曉迪 段文秀 廖艷芳 楊艷軍 徐亞林

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，安徽 合肥 230038)

不同膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的比較

吳向陽(yáng) 柳奇奇 汪宗保 盧陶陶 喬曉迪 段文秀1廖艷芳 楊艷軍 徐亞林2

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷臨床學(xué)院，安徽 合肥 230038)

目的 采取2%木瓜蛋白酶溶液關(guān)節(jié)腔注射和手術(shù)造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)兩種方法誘導(dǎo)大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)模型，比較兩種造模方法在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)的異同。方法 54只8周齡SD大鼠按體重分層后隨機(jī)分為3組，每組18只。手術(shù)組手術(shù)切除大鼠右膝內(nèi)側(cè)半月板、切斷內(nèi)側(cè)副韌帶誘導(dǎo)KOA；藥物組通過(guò)在大鼠右膝關(guān)節(jié)腔注射2%木瓜蛋白酶溶液誘導(dǎo)KOA；對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)。于造模后第4、6、8周取右膝股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨，行免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原表達(dá)。結(jié)果 造模后第4、6、8周，手術(shù)組和藥物組軟骨細(xì)胞Ⅱ膠原表達(dá)逐漸減低，軟骨表面缺損，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。手術(shù)組關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)與藥物組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論 手術(shù)切除膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板、切斷內(nèi)側(cè)副韌帶和關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶溶液是KOA的理想造模方法，在第4、6、8周關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)逐漸減少，Ⅱ型膠原的表達(dá)手術(shù)組與藥物組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)可根據(jù)個(gè)體需要，做出科學(xué)地選擇。

膝骨關(guān)節(jié)炎；木瓜蛋白酶；手術(shù)；Ⅱ型膠原

骨性關(guān)節(jié)炎(OA)在老年人群中極為常見(jiàn)，流行病學(xué)調(diào)查顯示〔1～4〕，老年人、肥胖者、有膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷病史者多發(fā)。選擇合適的造模方法是成功開(kāi)展OA防治研究的重要前提。 研究表明，Ⅱ型膠原是一種與關(guān)節(jié)軟骨退變有密切聯(lián)系的細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原的主要成分(含量占總膠原量的90%～95%)，在促進(jìn)組織損傷后的再生和修復(fù)方面具有重要作用〔5〕，關(guān)節(jié)軟骨正常生物力學(xué)的改變，常繼發(fā)于細(xì)胞外基質(zhì)中膠原、蛋白聚糖質(zhì)和量的改變，繼而生物力學(xué)的改變逐漸演變?yōu)檐浌峭俗?、關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成和軟骨下骨反應(yīng)性增生等病理變化〔6〕。實(shí)驗(yàn)證明，膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射2%木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸混合溶液、手術(shù)切除大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板、切斷內(nèi)側(cè)副韌帶是切實(shí)可行的造模方法〔7～9〕。既往也有不少對(duì)不同濃度木瓜蛋白酶造模研究的報(bào)道，但對(duì)于藥物關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射和關(guān)節(jié)不穩(wěn)這兩種造模方法的對(duì)比研究卻報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)將藥物造模和手術(shù)造模產(chǎn)生的膝關(guān)節(jié)OA(KOA)關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原表達(dá)的變化進(jìn)行對(duì)比，旨在為實(shí)驗(yàn)研究選取合適的模型提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、藥物和試劑 SD大鼠(安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)批號(hào)scxk(皖)2011-002；Ⅱ型膠原一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)批號(hào)130717w；Ⅱ型膠原二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)批號(hào)K142318B；木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸(美國(guó)Sigma公司)；鹽酸曲馬多注射液(歐洲麥道甘美大藥廠)批號(hào)AM06AB；注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司)批號(hào)F3076112。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組方法 選取健康8周齡雄性SD大鼠54只，按體重分層后隨機(jī)分為手術(shù)組、藥物組、對(duì)照組，每組18只，常規(guī)飼養(yǎng)1 w后進(jìn)行手術(shù)和關(guān)節(jié)腔注射。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 藥物組 木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射建立大鼠KOA模型。 在無(wú)菌條件下用0.9%氯化鈉溶液配制2%(W/V)木瓜蛋白酶溶液和0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液，于4℃恒溫冰箱儲(chǔ)存，至實(shí)驗(yàn)前4 h取出室溫放置，注射前30 min將 2% 的木瓜蛋白酶溶液和0.03 mol/L的L-半胱氨酸溶液按2∶1的比例混勻。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，麻醉成功后雙膝關(guān)節(jié)備皮、消毒、屈曲約45°，從髕骨下緣前內(nèi)側(cè)的膝眼向髁間窩方向進(jìn)針，明顯有落空感后，針尖抵達(dá)股骨內(nèi)側(cè)髁再回撤2 mm，注入2%木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸的混合溶液0.15 ml至右側(cè)膝關(guān)節(jié)腔。左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔同樣方法注射0.15 ml生理鹽水對(duì)照。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后第4、7天分別再注射1次。

1.2.2.2 手術(shù)組 以關(guān)節(jié)不穩(wěn)建立大鼠KOA模型。器械滅菌，鋪好無(wú)菌手術(shù)單(長(zhǎng)40 cm、寬60 cm)，將大鼠按3 ml/kg水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，選取右膝關(guān)節(jié)，膝關(guān)節(jié)上下1.5 cm范圍備皮、碘伏消毒、75%酒精脫碘，鋪巾。在髕韌帶內(nèi)側(cè)取長(zhǎng)約0.5 cm切口，鈍性分離軟組織后切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，將髕骨向外側(cè)脫位，分離并切除內(nèi)側(cè)半月板、分離并切斷內(nèi)側(cè)副韌帶。髕骨復(fù)位，關(guān)閉關(guān)節(jié)囊，縫合手術(shù)切口。對(duì)側(cè)膝關(guān)節(jié)打開(kāi)關(guān)節(jié)囊后不行內(nèi)側(cè)副韌帶切斷和內(nèi)側(cè)半月板切除，關(guān)閉關(guān)節(jié)囊，縫合手術(shù)切口。術(shù)后肌注青霉素鈉1 ml預(yù)防感染、1 ml噴灑于傷口，大鼠麻醉清醒后肌注鹽酸曲馬多注射液鎮(zhèn)痛。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，切口愈合良好無(wú)滲出。

1.2.3 取材和標(biāo)本處理 分別在第4、6、8周取材大鼠右膝關(guān)節(jié)股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨，4%甲醛溶液固定1 d，10%EDTA溶液對(duì)所取標(biāo)本脫鈣，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟過(guò)液，石蠟包埋、切成4 μm厚的切片，免疫組化染色，中性樹(shù)膠封片，觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 改良Mankin評(píng)分 光鏡下觀察改良Mankin評(píng)分，并根據(jù)評(píng)分對(duì)KOA標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)分期：0～1分為正常，2～5分為早期，6～9分為中期，10～14分為晚期。

1.3.2 觀察Ⅱ型膠原的表達(dá) 分別在第4、6、8周觀察大鼠右腿股骨內(nèi)側(cè)髁形態(tài)改變和關(guān)節(jié)表面變化，對(duì)每張切片選取4個(gè)不同的視野，放大400倍觀察軟骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析及秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下觀察改良Mankin評(píng)分 藥物組大鼠第4周處于KOA早期，第6周處于KOA早期、中期過(guò)渡時(shí)間，第8周處于KOA中期；手術(shù)組大鼠第4周處于KOA早期，第6周處于KOA早期、中期過(guò)渡時(shí)間，第8周處于KOA中期。藥物組與手術(shù)組大鼠Mankin評(píng)分相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩種造模方法不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)KOA大鼠改良Mankin評(píng)分

與同期對(duì)照組比較：1)P<0.05

2.2 各組膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá) 正常關(guān)節(jié)軟骨從關(guān)節(jié)面到軟骨下骨、軟骨基質(zhì)都是均一和完整的。軟骨基質(zhì)中度、深度著色；接近關(guān)節(jié)表面的軟骨細(xì)胞較??；軟骨中層或深層的軟骨細(xì)胞則較大。對(duì)照組Ⅱ型膠原表達(dá)正常，軟骨面呈均勻的褐色，細(xì)胞周圍均勻的包裹大量淡褐色區(qū)域。藥物組和手術(shù)組第4周軟骨細(xì)胞分布不均勻，Ⅱ型膠原表達(dá)減少，著色不均勻。第6周藥物組和手術(shù)組軟骨細(xì)胞周圍Ⅱ型膠原著色不規(guī)則且大量減少，手術(shù)組軟骨表面欠光滑。至第8周，藥物組與手術(shù)組軟骨表面均有缺損，Ⅱ型膠原表達(dá)極少。見(jiàn)圖1，圖2。

圖1 手術(shù)組Ⅱ型膠原在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的表達(dá)(DAB，×400)

圖2 藥物組Ⅱ型膠原在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的表達(dá)(DAB，×400)

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)除水外主要是膠原和蛋白聚糖。在幾種遺傳學(xué)上不同的膠原中，Ⅱ型膠原是關(guān)節(jié)軟骨的主要成分和張力的決定性因素，Ⅱ型膠原的減少直接導(dǎo)致軟骨的受力發(fā)生變化〔10～14〕。研究認(rèn)為，人類OA軟骨最早發(fā)生的顯著變化之一是水分的增加和蛋白多糖的減少〔15〕。研究OA的動(dòng)物模型制備方法對(duì)動(dòng)物的選擇很廣泛，有大鼠、兔、豬、羊等〔16～20〕。而大鼠具有基因與人類類似、價(jià)廉且易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，故被經(jīng)常用于制作OA動(dòng)物模型。

木瓜蛋白酶對(duì)動(dòng)植物蛋白具有較強(qiáng)的水解能力，其誘導(dǎo)大鼠KOA具有成功率高、時(shí)間短、重復(fù)性好等特點(diǎn)。與韓冠英等〔21〕選用不同濃度木瓜蛋白酶誘導(dǎo)KOA的做法不同，本研究采用的木瓜蛋白酶溶液濃度相對(duì)較低，注射的是木瓜蛋白酶與L-半胱氨酸溶解成2%的木瓜蛋白酶與0.03 mol/L 的 L-半胱氨酸的混合溶液。手術(shù)法復(fù)制OA模型的重點(diǎn)在于破壞關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，造成膝關(guān)節(jié)的生物力學(xué)紊亂，具有成功率高、效果切實(shí)可靠、時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)后會(huì)使關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生肥厚性表現(xiàn)、膠原網(wǎng)消失。初始階段是軟骨蛋白聚糖合成增加、膠原減少，其后軟骨基質(zhì)循環(huán)加快，只消耗重要成分軟骨基質(zhì)。Hayami等〔22,23〕研究證明半月板具有吸收震蕩、分布負(fù)荷和延伸關(guān)節(jié)滑液等作用。膝關(guān)節(jié)是人體最大最復(fù)雜的受力關(guān)節(jié)，在關(guān)節(jié)軟組織的損傷后如果沒(méi)有得到足夠的修復(fù)，常發(fā)展為創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎。Stoop等〔24〕通過(guò)手術(shù)造成關(guān)節(jié)不穩(wěn)建立大鼠膝關(guān)節(jié)OA，發(fā)現(xiàn)早期即有關(guān)節(jié)軟骨的Ⅱ型膠原裂解產(chǎn)物增多。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)在軟骨基質(zhì)大分子的裂解過(guò)程中起主要作用(主要是膠原酶3，即MMP-13)，在OA時(shí)，各種MMPs的含量表達(dá)增高，由于Ⅱ型膠原是被膠原酶裂解變性的，Ⅱ型膠原裂解也明顯增加。這種裂解最先發(fā)生于健康關(guān)節(jié)軟骨淺表部位的軟骨細(xì)胞周圍，繼之發(fā)展到整個(gè)關(guān)節(jié)軟骨層。雖然OA時(shí)，Ⅱ型膠原的合成是顯著增加的，但是原有的和新合成的Ⅱ型膠原都在被裂解，這種增加不足以抵消MMPs對(duì)它的裂解。

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〔2015-01-09修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

中國(guó)博士后基金項(xiàng)目(No.2011M501355)；安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.1508085MH181)；安徽中醫(yī)藥大學(xué)省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(No.2014048)

汪宗保(1973-)，男，主治醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，臨床醫(yī)學(xué)博士后，主要從事運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究。 徐亞林(1970-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，臨床醫(yī)學(xué)博士后，主要從事康復(fù)醫(yī)學(xué)研究。

吳向陽(yáng)(1992-)，男，主要從事骨關(guān)節(jié)炎的針灸、康復(fù)療法研究。

R274

A

1005-9202(2017)09-2114-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.014

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部

2 廣東醫(yī)學(xué)院附屬開(kāi)平醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科