辛伐他汀對胰腺癌BxPC-3細胞株Shh相關蛋白的影響

費洪新 張曉杰 張英博

(齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

·基礎研究·

辛伐他汀對胰腺癌BxPC-3細胞株Shh相關蛋白的影響

費洪新 張曉杰 張英博

(齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探討辛伐他汀對胰腺癌BxPC-3細胞株Shh相關蛋白的影響。方法 胰腺癌BxPC-3細胞株隨機分成對照組，5-氟尿嘧啶(5-FU)組(50 μmol/L)，辛伐他汀高、中、低劑量組(20，10，5 μmol/L)。采用臺盼藍染色法和MTT法檢測胰腺癌BxPC-3細胞株的生長曲線和增殖抑制率；采用細胞劃痕法檢測胰腺癌BxPC-3細胞株運動能力；采用免疫組織化學、RT-PCR法檢測胰腺癌BxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1水平。結果 與對照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組胰腺癌BxPC-3細胞OD值、運動能力和Shh、Ptch1、Smo、Gli1水平明顯降低(P<0.05)。結論 辛伐他汀通過抑制BxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1水平在胰腺癌治療中發(fā)揮積極作用。

辛伐他?。灰认侔?；BxPC-3細胞株

研究顯示，通過減弱腫瘤細胞增殖相關的Hedgehog信號通路活化水平可以抑制胰腺癌(PC)細胞增殖〔1〕，Hedgehog信號通路還參與介導PC和胰腺組織纖維化〔2〕，調控PC干細胞的分化〔3〕；使用Hedgehog信號通路抑制劑SANT1可以下調Hedgehog信號通路活化〔4〕，在PC中Hedgehog信號通路Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達上調，出現(xiàn)Hedgehog信號通路活化〔5〕，可見在PC中Hedgehog信號通路相關的Shh、Ptch1、Gli1蛋白表達失調。另外研究表明，辛伐他汀可以增加紫杉醇的抗腫瘤活性〔6〕，輔助橙皮苷治療類風濕關節(jié)炎〔7〕，降低心肌梗死患者并發(fā)肺炎的發(fā)生率〔8〕，降低C-反應蛋白和白細胞介素-6水平而有利于慢性心力衰竭患者的康復〔9〕，誘導體外培養(yǎng)非小細胞肺癌細胞凋亡〔10〕，抑制肝癌細胞生長〔11〕，減緩腎癌的細胞增殖〔12〕。雖然辛伐他汀的臨床應用較為廣泛，但是中國知識資源總庫(CNKI)、美國國家生物技術信息中心(NCBI)等數(shù)據(jù)庫顯示，辛伐他汀對PCBxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1表達的研究尚無相關文獻報道?；诖耍緦嶒炛荚谔接懶练ニxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白的影響。

1 資料與方法

1.1 藥物和細胞株 辛伐他汀(宜昌長江藥業(yè)有限公司，批號0021509002)，5-氟尿嘧啶(FU)(Sigma公司)，人原位BxPC-3細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心)。

1.2 試劑與儀器 兔抗人Shh多克隆抗體、兔抗人Gli1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗人Ptch1多克隆抗體、兔抗人Smo多克隆抗體(美國Abcam公司)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。CO2培養(yǎng)箱(力康發(fā)展公司)，胎牛血清(HyClone公司)，HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶(HyClone公司)，實時定量PCR檢測儀(美國伯樂公司)，6100型RT-雷杜酶標儀(美國RT公司)，Trizol試劑盒、DEPC(上海生工生物工程)等。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 參考文獻〔13〕進行人原位BxPC-3細胞株的培養(yǎng)，人原位BxPC-3細胞株在5%CO2、37℃無菌培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，BxPC-3細胞株恢復生長至對數(shù)生長期后凍存，在液氮中保存人BxPC-3細胞株，開始預實驗。正式實驗開始復蘇人BxPC-3細胞株，用含10%胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液于培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，觀察人BxPC-3細胞株的基本狀態(tài)，人BxPC-3細胞株均處于對數(shù)生長期后開始指標測定。

1.3.2 細胞分組和用藥干預 生長旺盛的人BxPC-3細胞株隨機分成對照組，5-FU組(50 μmol/L)，辛伐他汀高、中、低劑量組(20，10，5 μmol/L)。

1.4 觀察指標

1.4.1 臺盼藍染色檢測人BxPC-3細胞株的生長曲線 利用臺盼藍可以穿透死亡或者壞死細胞的細胞膜并結合DNA的特點，從而鑒定出活細胞。實驗取對數(shù)生長期人BxPC-3細胞株，胰酶消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，制備人BxPC-3細胞株的細胞懸液，調整細胞的濃度為1×104個細胞/ml，選擇300 μl接種在24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)1 d，使用辛伐他汀(20、10、5 μmol/L)、5-FU(50 μmol/L)進行干預，模型組加上正常培養(yǎng)基，5%CO2、37℃的無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d。每日取單細胞懸液，按照單細胞懸液與臺盼藍的比例9∶1加入臺盼藍(4%)混合，3 min內計數(shù)，收集數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，繪制各組人BxPC-3細胞株的生長曲線。

1.4.2 噻唑藍比色法(MTT)檢測人BxPC-3細胞株的增殖抑制率 取各組對數(shù)生長期人BxPC-3細胞株，胰酶消化，PBS洗滌3次，制備人BxPC-3細胞株的細胞懸液，調整細胞的濃度為2×105個細胞/ml，人BxPC-3細胞株接種于96孔培養(yǎng)板；1 d后，辛伐他汀不同劑量進行干預，5%CO2、37℃無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，加入10 μl的MTT(5 mg/ml)及二甲基亞砜(DMSO)100 μl，搖床震蕩5 min，酶標儀在波長為490 nm處檢測各孔的吸光度(OD)，按照公式計算人BxPC-3細胞株的增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4.3 細胞劃痕法檢測人BxPC-3細胞株的運動能力 取對數(shù)生長期人BxPC-3細胞株，胰酶消化，PBS洗滌3次，制備人BxPC-3細胞株的細胞懸液，濃度為5×105個細胞/ml。黑色筆在6孔培養(yǎng)板的背后，每隔0.8 cm左右劃橫線，每孔至少穿過3條線。在每孔中加入人BxPC-3細胞株約5×105個細胞/ml，培養(yǎng)1 d后，垂直于背后，使用橫線畫劃痕。用PBS洗滌細胞3次/孔，去除劃下的人BxPC-3細胞。對照組加入正常完全培養(yǎng)基、5-FU組加入含有5-FU 50 μmol/L的完全培養(yǎng)基，辛伐他汀高、中、低劑量組分別加入含有辛伐他汀(20、10、5 μmol/L)的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。按0、24、48 h取細胞樣品，拍攝劃痕處，測量人BxPC-3細胞劃痕間的距離，使用人BxPC-3細胞的愈合百分比客觀評價人BxPC-3細胞的運動能力。愈合百分比(%)=(1-48 h劃痕距離/0 h劃痕距離)×100%。

1.4.4 免疫組化(IHC)檢測人BxPC-3細胞Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表達 選擇人BxPC-3細胞株，胰酶消化，收集人BxPC-3細胞，離心后接種到載玻片中，待人BxPC-3細胞貼壁后，選擇各組載玻片。PBS沖洗人BxPC-3細胞3次，檸檬酸緩沖液中修復，3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，滴加一抗，放入濕盒內4℃過夜，PBS沖洗3次，滴加二抗，放入37℃電熱溫箱中30 min，PBS沖洗3次，0.05%DAB+0.03%H2O2顯色10 min，蘇木素5 min復染，PBS洗滌，鹽酸酒精(0.5%)分化數(shù)秒，梯度乙醇脫水，二甲苯透明數(shù)秒，樹膠封片，鏡下觀察，計數(shù)人BxPC-3細胞的光密度值，并用HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學圖文系統(tǒng)進行分析。

1.4.5 實時定量PCR(RT-PCR)法檢測人BxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1 mRNA的表達 按Trizol抽提試劑盒說明書提取細胞總RNA并計算濃度。設計引物Shh(上游5′-GCT CGG TGA AAG CAG AGA ACT-3′，下游5′-CCA GGA AAG TGA GGA AGT CG-3′)，Ptch1(上游 5′-CTC CTT TGC GGT GGA CAA-3′，下游5′-CCT CAG CCT TAT TCA GCA TTT C-3′),Smo(上游5′-CTG GTG TGG TTT GGT TTG TG-3′，下游 5′-CAG GTG GAA GTA GGA GGT CTT G-3′),Gli1(上游 5′-ATC CTT ACC TCC CAA CCT CTG T-3′，下游5′-CCA ACT TCT GGC TCT TCC TGT A-3′),GAPDH(上游 5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′，下游 5′-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3′)由上海生工生物工程股份有限公司合成。反轉錄條件：37℃、15 min，85℃、15 s。RT-PCR反應條件：預變性95℃，10 s；循環(huán)95℃、5 s，60℃、34 s，擴增40個循環(huán)。收集熒光信號在60℃、34 s反應階段中，使用iQTM5軟件分析PCR過程各檢測樣本的Ct值，計算目的基因相對于內參基因GAPDH的相對表達量(2-△△Ct法)，結果越大則目的基因的表達越強。

2 結 果

2.1 辛伐他汀對人BxPC-3細胞株生長曲線的影響 與對照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組第4、5、6、7天BxPC-3細胞株活細胞計數(shù)明顯減少(P<0.05)；與5-FU組比較，辛伐他汀低劑量組第4、5、6、7天BxPC-3細胞株活細胞計數(shù)明顯增加(P<0.05)。見表1。

與對照組比較：1)P<0.05；與5-FU組比較：2)P<0.05；下表同

2.2 辛伐他汀對人BxPC-3細胞株增殖抑制率的影響 與對照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組人BxPC-3細胞株OD值明顯降低(P<0.05)；與5-FU組比較，辛伐他汀低劑量組BxPC-3細胞株OD值明顯增加(P<0.05)。見表2。

2.3 辛伐他汀對人BxPC-3細胞株運動能力的影響 與對照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組BxPC-3細胞株48 h劃痕距離明顯增加(P<0.05)，愈合百分比明顯降低(P<0.05)；與5-FU組比較，辛伐他汀低劑量組BxPC-3細胞株48 h劃痕距離明顯降低(P<0.05)，愈合百分比明顯增加(P<0.05)。見表3。

2.4 辛伐他汀對人BxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白及mRNA表達的影響 與對照組比較，5-FU組，辛伐他汀高、中劑量組人BxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白及mRNA表達均明顯降低(P<0.05)；與5-FU組比較，辛伐他汀低劑量組BxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白及mRNA表達均明顯增加(P<0.05)。見表4。

表2 辛伐他汀對人BxPC-3細胞株增殖抑制率的影響

表3 辛伐他汀對人BxPC-3細胞株運動能力的影響

表4 辛伐他汀對BxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白(OD值)及mRNA表達量(2-△△Ct)的影響

3 討 論

PC的發(fā)病機制較復雜，PC與Raf〔13〕、Wnt、Hedgehog信號通路等密切相關，其中Hedgehog信號通路逐漸成為目前的研究熱點。在英文中Hedgehog是刺猬的含義，其相關的通路基因稱為刺猬基因。Hedgehog信號通路高度保守，參與機體組織器官的發(fā)育。在正常人群的成熟細胞中，Hedgehog信號通路表達水平較低，而在惡性腫瘤中如PC則會出現(xiàn)高表達，促進PC細胞增殖。

Hedgehog信號通路的基本構成包括配體蛋白Hh蛋白、膜受體蛋白Ptch和Smo、核轉錄因子Gli、Hh蛋白信號復合體(HSC)等。Hh蛋白主要分為Shh、Ihh、Dhh幾種類型，Shh蛋白是Hedgehog信號通路的研究熱點。Ptch蛋白主要分為Ptch1、Ptch2兩種類型，Ptch1可以與Hh蛋白結合而調控Hedgehog信號通路的信息傳遞，Ptch1還可以調控下游的信號分子Smo的表達，倘若Ptch1表達上調，就會激活下游信號Smo蛋白，從而活化Hedgehog信號通路，進而誘發(fā)腫瘤。核轉錄因子Gli蛋白主要分為Gli1、Gli2、Gli3幾種類型，其中Gli1蛋白表達于細胞質和細胞核內，Gli1可以將Hedgehog信號通路中Shh、Ptch1、Smo的信號信息傳遞到腫瘤細胞的細胞核內，啟動相關靶基因(GAC CAC CCA)的轉錄和翻譯，例如Gli可以作用于B細胞淋巴瘤/白血病因子(Bcl)-2，促使腫瘤細胞免于細胞凋亡，調節(jié)細胞周期相關蛋白表達而促進腫瘤細胞增殖。經(jīng)過以上的分析，可見Hedgehog信號通路的關鍵蛋白Shh、Ptch1、Smo、Gli1的表達與PC密切相關。

辛伐他汀對人BxPC-3細胞株的藥理作用存在劑量-效應關系，而辛伐他汀高、中劑量對人BxPC-3細胞株生長具有抑制作用，與5-FU 對人BxPC-3細胞株的抑制作用等效，而辛伐他汀低劑量治療PC的效果較差。

辛伐他汀可以抑制人BxPC-3細胞株增殖，而低劑量對人BxPC-3細胞株的抑制作用較差。預示隨著辛伐他汀劑量的增加，辛伐他汀對人BxPC-3細胞株增殖抑制能力逐漸增強，提示辛伐他汀抗PC存在劑量-效應關系。

5-FU和辛伐他汀高、中劑量對人BxPC-3細胞株運動能力具有很強的抑制作用，隨著劑量的增加，辛伐他汀對人BxPC-3細胞株運動能力的影響就會更加明顯；而辛伐他汀低劑量對人BxPC-3細胞株的運動能力影響較差，以上顯示，開展辛伐他汀抗PC的研究需要選擇辛伐他汀高、中劑量(20、10 μmol/L)。

辛伐他汀不同劑量可以減弱Hedgehog信號通路活化水平，減少配體蛋白Shh的表達，降低膜受體蛋白Ptch1、Smo的表達，同時還降低核轉錄因子Gli1的表達，進而減少靶基因序列(GAC CAC CCA)的轉錄和翻譯，減少下游相關的信號如Bcl-2表達，促進細胞周期阻滯，從而抑制人BxPC-3細胞株增殖和生長。而辛伐他汀低劑量對Hedgehog信號通路活化水平影響較差。本實驗中人BxPC-3細胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1表達下調的同時伴有人BxPC-3細胞株生長增殖水平和運動水平受到抑制，推測辛伐他汀抑制PC生長增殖、運動等生物學活性是通過抑制Hedgehog信號通路Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白和基因表達來實現(xiàn)的。

綜上所述，辛伐他汀可以通過降低Hedgehog信號通路相關蛋白和基因表達體現(xiàn)對BxPC-3的抑制作用，預示Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白或將是治療PC的靶點蛋白。

1 Bai Y，Chen B，Hong W，etal.Sedum sarmentosum Bunge extract induces apoptosis and inhibits proliferation in pancreatic cancer cells via the hedgehog signaling pathway〔J〕.Oncol Rep，2016；35(5)：2775-84.

2 Bai Y，Bai Y，Dong J，etal.Hedgehog signaling in pancreatic fibrosis and cancer〔J〕.Medicine (Baltimore)，2016；95(10)：e2996.

3 Wang F，Ma L，Zhang Z，etal.Hedgehog signaling regulates epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer stem-like cells〔J〕.J Cancer，2016；7(4)：408-17.

4 Alam MM，Sohoni S，Kalainayakan SP，etal.Cyclopamine tartrate，an inhibitor of Hedgehog signaling，strongly interferes with mitochondrial function and suppresses aerobic respiration in lung cancer cells〔J〕.BMC Cancer，2016；16(1)：150.

5 Zhou ZG，Zhang CY，F(xiàn)ei HX，etal.Phenolic alkaloids from Menispermum dauricum inhibits BxPC-3 pancreatic cancer cells by blocking of Hedgehog signaling pathway〔J〕.Pharmacogn Mag，2015；11(44)：690-7.

6 Kretzer IF，Maria DA，Guido MC，etal.Simvastatin increases the antineoplastic actions of paclitaxel carried in lipid nanoemulsions in melanoma-bearing mice〔J〕.Int J Nanomedicine，2016；11(7)：885-904.

7 Ahmed YM，Messiha BA，Abo-Saif AA.Protective effects of simvastatin and Hesperidin against complete Freund′s adjuvant-induced rheumatoid arthritis in rats〔J〕.Pharmacology，2015；96(5-6)：217-25.

8 Lin CF，Chang YH，Liu JC，etal.Statin use associated with a reduced risk of pneumonia requiring hospitallization in patients with myocardial infarction：a nested case-control study〔J〕.BMC Cardiovasc Disord，2016；16(1)：24.

9 Pinchuk TV，F(xiàn)edulaev YN，Khairetdinova GA，etal.Anti-inflammatory effects of simvastatin in patients with chronic heart failure〔J〕.Bull Exp Biol Med，2014；157(5)：552-4.

10 Lee HY，Kim IK，Lee HI，etal.The apoptotic effect of simvastatin via the upregulation of BIM in non small cell lung cancer cells〔J〕.Exp Lung Res，2016；42(1)：14-23.

11 Huang X，Ma J，Xu J，etal.Simvastatin induces growth inhibition and apoptosis in HepG2 and Huh7 hepatocellular carcinoma cells via upregulation of Notch1 expression〔J〕.Mol Med Rep，2015；11(3)：2334-40.

12 Gbelcova H，Sveda M，Laubertova L，etal.The effect of simvastatin on lipid droplets accumulation in human embryonic kidney cells and pancreatic cancer cells〔J〕.Lipids Health Dis，2013；12：126.

13 張英博，費洪新，仲麗麗，等.甘草酸二銨對胰腺癌BxPC-3細胞株的影響〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(3)：523-5.

〔2016-09-16修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effects of simvastatin on Shh associated protein of BxPC-3 cell line in the pancreatic cancer

FEI Hong-Xin，ZHANG Xiao-Jie，ZHANG Ying-Bo.

Qiqihar Medical College，Qiqihaer 161006，Heilongjiang，China

Objective To study the effects of simvastatin on Shh associated protein of BxPC-3 cell line in the pancreatic cancer.Methods BxPC-3 cell line of pancreatic cancer were randomly divided into control, 5-Fluorouracil(5-FU,50 μmol/L), simvastatin high-(20 μmol/L)，middle-(10μmol/L)， low-dose (5 μmol/L) groups. The trypan blue staining and MTT were used to determine growth curve of BxPC-3 cell line and OD values of pancreatic cancer. The cell scratch was used to determine the exercise capacity of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer. Immunohistochemistry (IHC) and real-time PCR (RT-PCR) was applied for detecting Shh，Ptch1，Smo，Gli1 levels in BxPC-3 cell line of pancreatic cancer.Results Compared with the control group, OD values of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer, exercise capacity，Shh, Ptch1, Smo, Gli1 level were significantly decreased in 5-FU, simvastatin high-dose and middle-dose groups(allP<0.05).Conclusions Simvastatin plays a certain role in the treatment of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer by inhibiting Shh, Ptch1, Smo, Gli1.

Simvastatin；Pancreatic cancer；BxPC-3 cell line

國家自然科學基金 (81173576，81373777，81173599)；黑龍江省自然科學基金(H201354)；黑龍江省教育廳資金(12521624，12531788，12531790)；齊齊哈爾醫(yī)學院院內科研博士專項基金項目(QY2016B-21)

張英博(1973-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤、肝纖維化、癡呆研究。

費洪新(1978-)，男，博士，講師，主要從事腫瘤、抑郁癥、癡呆、痛風研究。

R285

A

1005-9202(2017)09-2081-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.001