穩(wěn)消Ⅱ方對兔腹主動脈粥樣硬化模型NF-κB P65蛋白表達的影響

生書萌，梁 榮，霍清萍

穩(wěn)消Ⅱ方對兔腹主動脈粥樣硬化模型NF-κB P65蛋白表達的影響

生書萌，梁 榮，霍清萍

目的 觀察穩(wěn)消Ⅱ方對兔動脈粥樣硬化模型腹主動脈壁核因子-κB(NF-κB) P65蛋白表達的影響，探討其抗動脈粥樣硬化的作用機制。方法 將38只健康新西蘭大白兔隨機分為空白組(9只)和造模組(29只)，分別給予標準飼料和高脂飼料。8周后，造模組隨機處死1只兔子，確認造模成功。將造模組隨機分為3組：穩(wěn)消Ⅱ方組、辛伐他汀組、模型對照組，停用高脂飼料，改用標準飼料，分別給予穩(wěn)消Ⅱ方、辛伐他汀、蒸餾水灌胃治療8周，處死動物，采用免疫組化法觀察NF-κB P65表達。結果 與模型對照組比較，穩(wěn)消Ⅱ方組和辛伐他汀組NF-κBP65表達均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；干預前后穩(wěn)消Ⅱ方組和辛伐他汀組同組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 穩(wěn)消Ⅱ方可能通過抑制NF-κB P65表達防治和穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊，減少心腦血管病不良事件的發(fā)生。

動脈粥樣硬化；穩(wěn)消Ⅱ方；核因子-κB P65；兔

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性反應的病理過程，以血管壁巨噬細胞源性泡沫細胞和大量趨化因子、細胞因子和生長因子堆積為主要特征。AS斑塊破裂、血栓形成是導致急性心腦血管事件發(fā)生的主要原因，其發(fā)病機制復雜，炎癥學說(in flammatory hypothesis)是AS發(fā)生機制的重要學說。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一種具有調控多項基因轉錄調節(jié)作用的蛋白質，存在于血管內皮細胞、平滑肌細胞及單核-巨噬細胞中，參與多種與炎癥反應有關基因的表達調控，在動脈粥樣硬化病變形成過程起關鍵性的調控作用[1]。NF-κB活化被認為是AS的始動機制之一，研究其生物學特性并通過藥理學作用調控，對防治動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展具有重要臨床意義。

中藥穩(wěn)消Ⅱ方是霍清萍教授治療本病的經驗方，具有通絡活血、化瘀清熱、行氣化痰之功效。前期研究證實，穩(wěn)消Ⅱ方可通過調節(jié)脂質代謝、抑制炎癥反應、降低纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)IB)水平等發(fā)揮抗AS作用[2-8]。為了進一步探討其作用機制，本實驗通過喂飼高脂飼料方法建立兔AS模型，觀察穩(wěn)消Ⅱ方對實驗兔動脈粥樣硬化NF-κB信號通路的影響。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 38只體重2.2 kg～2.5 kg健康新西蘭大白兔，月齡3個月～4個月，雌雄不限，購自上海松江車墩實驗動物良種廠，飼養(yǎng)條件為2級，室溫在22 ℃～24 ℃，相對濕度50%，光照時間07：00～17：00。

1.2 實驗藥物 高脂飼料：膽固醇1%，蛋黃粉5%，豬油3%，普通食料91%，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心加工而成。穩(wěn)消Ⅱ方免煎顆粒：由水蛭、地龍、丹參、牡丹皮、郁金、半夏各藥按3∶3∶3∶3∶3∶2比例混合組成，江陰天江藥業(yè)有限公司代為生產，批號：1409050。辛伐他?。荷唐访娼抵?，默沙東公司產品，批號：130578。根據(jù)臨床用藥劑量[9]，按人與動物體質量比例折算，折合實驗兔用量：水蛭、地龍、丹參、丹皮、郁金各575 mg/kg，半夏383.33 mg/kg，辛伐他汀0.77 mg/kg，用蒸餾水溶解，混勻后灌胃。

1.3 實驗試劑與儀器 實驗試劑：NF-κB p65抗體：Life Span Bio Sciences公司；NF-κB免疫組化試劑盒：上海南溪生物有限公司； DAB顯色試劑盒：DAKO公司。實驗儀器：脫水機(JJ-12J)、包埋機(JB-P5)：武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(RM2016)：上海徠卡儀器有限公司；凍臺(JB-L5)：武漢俊杰電子有限公司；組織攤片機(KD-P)：浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；烤箱(DHG-9140A)：上?；厶﹥x器制造有限公司；載玻片(80312-3181)、蓋玻片(10212432C)：江蘇世泰實驗器材有限公司；微波爐(MM823LA6-NS)：美的微波電器制造有限公司；脫色搖床(WD-9405A)：北京市六一儀器廠；渦旋混合器(TYXH-II)：天悅電子；移液槍(KA0056573)：Dragon；組化筆(GT1001)：Gene tech；顯微鏡(XSP-C204)：CIC；成像系統(tǒng)(Nikon DS-U3)：日本尼康。

1.4 實驗過程

1.4.1 分組、造模 動物飼養(yǎng)在本院實驗動物中心，飼養(yǎng)條件為2級，室溫在22 ℃～24 ℃，相對濕度50%，光照時間07：00～17：00。每只實驗兔每日給予150 g標準飼料，觀察7 d無異常后稱重。采用隨機分組法將其分為空白組(9只)和造模組(29只)。其中空白組繼續(xù)標準飼料喂養(yǎng)，造模組給予高脂飼料每日100 g，余由標準飼料補足，均自由飲水。高脂飼料喂養(yǎng)至第8周末，在造模組隨機處死實驗兔1只，于腹主動脈至髂總動脈分叉處(以左右髂動脈分叉為參照)向上留取2 cm標本，進行石蠟切片，光鏡下觀察造模情況。實驗兔動脈內膜可見乳白色或淡黃色、大小不等的彌漫性隆起脂紋、斑塊；HE染色，光鏡下可見廣泛的泡沫細胞，證實造模成功。

1.4.2 藥物干預 造模成功后，將造模組隨機分為穩(wěn)方Ⅱ組、辛伐他汀組、模型對照組。各組給予相應藥物灌胃，停用高脂飼料，改為標準飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件同前。

1.4.3 取材 實驗第16周末，于取材前夜禁食禁水12 h，用戊巴比妥鈉(1.3 mL/kg)麻醉實驗兔，無菌條件下取腹主動脈標本。用0.9%氯化鈉溶液輕輕沖洗后各留取1 cm置于4%多聚甲醛中固定，-40 ℃凍存。

1.5 觀察項目及檢測方法 采用免疫組織化學法檢測NF-κB P65，實驗步驟均按試劑盒說明書嚴格操作。每組內每張切片隨機挑選3個200倍視野進行拍照。應用Image-Pro Plus6.0軟件選取相同的棕黃色作為判斷所有照片陽性的統(tǒng)一標準，對每張照片進行分析得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD)，保存圖片中組織的面積(AREA)及IOD/AREA(Mean Density)，以Mean Density數(shù)值為最終觀測結果。

2 結 果

2.1 一般情況 共34只兔完成實驗。造模實驗階段：腹瀉死亡1只；造模后隨機處死1只觀察造模情況；給藥實驗階段：穩(wěn)消Ⅱ方組肺炎死亡1只，模型組壞疽死亡1只；其余存活實驗兔均能自由活動，狀況良好。

2.2 各組兔NF-κB P65水平比較 模型對照組增厚的動脈內膜及中膜內可見大量的棕黃色顆粒狀陽性染色物質，明顯高于空白組(P<0.05)；穩(wěn)消Ⅱ方組動脈內膜及中膜內可見較多的棕黃色顆粒狀陽性染色物質，較模型對照組明顯降低(P<0.05)；辛伐他汀組動脈內膜及中膜內可見較多的棕黃色顆粒狀陽性染色物質，較模型對照組明顯降低(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 各組兔NF-κB P65水平比較(±s)

圖1 各組NF-κB P65免疫組織化學染色(×200)

3 討 論

炎癥學說、內皮損傷學說是目前公認的AS發(fā)病學理論。NF-κB是細胞因子、黏附分子和生長因子間重要的聯(lián)絡因子，在AS形成起重要作用[8-9]，可促進硬化斑塊形成、生長和破裂，最終導致心臟病和腦卒中等疾病發(fā)生。

NF-κB/Rel家族成員主要包括：RelA(p65)、RelB、C-Rel、NF-κB1(p50)及NF-κB2(p52)[10]。NF-κB的活化形式為二聚體，NF-κB家族成員間可相互形成同源或異源二聚體，不同NF-κB/Rel蛋白二聚體具有各自獨有特性，可識別不同DNA靶目標。在細胞發(fā)揮主要生理作用且豐富的二聚體是p50-p65異源二聚體，故通常一般將NF-κB定義為p50/p65異源二聚體。

細胞黏附分子、單核細胞趨化因子等炎癥因子在AS炎癥過程有重要作用，這些因子基因的啟動子或增強子存在一個或多個κB序列，其活化受到NF-κB調控[11-13]。有研究證實，AS早期多種刺激因素作用于動脈壁造成內皮細胞受損，NF-κB激活啟動靶基因轉錄，刺激下游相關基因表達，激發(fā)一系列級聯(lián)式炎癥反應，誘發(fā)動脈壁脂質聚集部位的炎癥反應，NF-κB信號通路位于炎癥反應軸心，是促進AS發(fā)生的共同通路[14-15]。大量實驗研究結果顯示，動脈粥樣硬化斑塊等疾病可通過調控NF-κB信號通路，減輕炎癥反應取得滿意療效[16-20]。因此，NF-κB認為是一種治療靶點，備受研究者關注。

中醫(yī)治療動脈粥樣硬化歷史悠久，認為本病與體虛、年老、勞累、情緒、飲食、氣滯、瘀血、痰濁、寒侵等因素有關?；羟迤冀淌谠陂L期臨床實踐中發(fā)現(xiàn)本病病人不但痰濕瘀滯，且蘊而化熱者也頗多見，瘀、痰、熱是產生AS斑塊的主要病理因素。病機為本虛標實，在機體臟腑虛損、陰陽失衡、氣血運行失利基礎上，加之痰、瘀、毒的相互作用，終致疾病發(fā)生[21]。瘀熱互結、痰濁凝聚為其重要的發(fā)病機制并據(jù)此創(chuàng)立活血通絡、清熱化瘀、祛痰化濁的穩(wěn)消Ⅱ方。方中水蛭破血逐瘀消癥，為君藥；地龍通經活絡，力專善走，周行全身，為臣藥；輔以丹參、牡丹皮涼血活血化瘀，清血分之熱，解淤積之毒；半夏燥濕化痰、消痞散結；郁金性辛，行周身氣血以散瘀結，同時兼有涼血、清解郁熱之效。全方共奏通絡活血、化瘀清熱、行氣化痰之功，藥專力強。

本研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)消Ⅱ方組及辛伐他汀組NF-κB均較模型對照組 P65表達明顯下調(P<0.05)。本實驗結果提示，穩(wěn)消Ⅱ方及辛伐他汀均能抑制NF-κB P65水平表達，抑制炎癥反應，達到穩(wěn)定斑塊作用，且穩(wěn)消Ⅱ方抑制NF-κB P65的作用與辛伐他汀相近。由于本研究樣本量有限，其結果有待擴大樣本數(shù)量后進一步驗證。

初步結果提示，穩(wěn)消Ⅱ方通過下調NF-κB p65蛋白表達，抑制一系列炎性因子的釋放，減緩動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展，有益于動脈粥樣硬化斑塊的防治與穩(wěn)定，減少心腦血管病不良事件發(fā)生。

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(本文編輯薛妮)

Effect of Wenxiao Ⅱ Granule on the Expression of NF-κB P65 in Experimental Atherosclerosis Rabbits

Sheng Shumeng，Liang Rong，Huo Qingping

The Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200233，China

Huo Qingping

Objective To observe the effect of different dose of Wenxiao Ⅱ granule (WXG) on the expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB) P65 in experimental atherosclerosis rabbits，and explore its mechanism in treating atherosclerosis.Methods Thirty-eignt New Zealand rabbits were randomly divided into blank group (n= 9) and model group (n= 29).After 8 weeks，a rabbit was randomly killed in model group to confirm model established successfully.Then rabbits in model group were divided into 3 subgroups：WXG group，simvastatin group and model control group.The rabbits in three subgroups were treated with WXG，simvastatin，distilled water， respectively and fed with the standard food for another 8 weeks.At the end of experiment，all the rabbits were sacrificed. The expression of NF-κB P65 was determined by immunohistochemistry staining. Results Compared with the model group，the levels of NF-κB P65 decreased in WXG group and simvastatin group(P<0.05).There was significant difference in the level of NF-κB P65 between pre and post treatment in WXG group and simvastatin group (P<0.05).Conclusion WXG can inhibit the expression of NF-κB P65，which may stabilize plaque of atherosclerosis，reduce incidence of adverse events of cardiovascular and cerebrovascular disease.

atherosclerosis；Wenxiao Ⅱ granule；nuclear factor-kappa B P65；rabbits

上海市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科研基金項目(No.2012L057A)；上海市臨床優(yōu)勢專科建設項目(No.ZYSNXD-YL-YSZK013)；申康中醫(yī)驗方項目(No.SHDC12012409)

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院(上海 200233)

霍清萍，E-mail：huoqingping005@126.com

R543.5 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.08.008

1672-1349(2017)08-0928-04

2016-07-23)

引用信息：生書萌，梁榮，霍清萍.穩(wěn)消Ⅱ方對兔腹主動脈粥樣硬化模型NF-κB P65蛋白表達的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(8)：928-931.