聚乳酸-聚己內(nèi)酯/絲素蛋白三元復(fù)合納米纖維膜支架的結(jié)構(gòu)與性能

王利君， 熊 杰， 駱菁菁,3， 趙興艷， 趙新飛(. 浙江理工大學(xué) 材料與紡織學(xué)院， 浙江 杭州 3008； 2. 浙江理工大學(xué) 服裝學(xué)院， 浙江 杭州 3008；3. 浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 3008 )

聚乳酸-聚己內(nèi)酯/絲素蛋白三元復(fù)合納米纖維膜支架的結(jié)構(gòu)與性能

王利君1,2， 熊 杰1， 駱菁菁1,3， 趙興艷1， 趙新飛1
(1. 浙江理工大學(xué) 材料與紡織學(xué)院， 浙江 杭州 310018； 2. 浙江理工大學(xué) 服裝學(xué)院， 浙江 杭州 310018；3. 浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 杭州 310018 )

通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備出不同質(zhì)量比的聚乳酸-聚己內(nèi)酯/絲素蛋白(PLA-PCL/SF)復(fù)合納米纖維膜支架，采用掃描電子顯微鏡、傅里葉紅外光譜儀對(duì)納米纖維膜的形貌和結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，測(cè)試?yán)w維膜的孔隙率和吸附性能。結(jié)果表明：PLA-PCL與SF這2種組分的質(zhì)量比對(duì)復(fù)合納米纖維膜的形貌有顯著影響，質(zhì)量比為90∶10和70∶30的納米纖維表面分布著密集的孔洞；PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜中SF經(jīng)甲醇處理后由無(wú)定形結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊結(jié)構(gòu)；隨著復(fù)合納米纖維膜中SF含量的增加，納米纖維膜的孔隙率和吸附性也逐漸降低。接觸角實(shí)驗(yàn)和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)培養(yǎng)結(jié)果表明，SF的加入提高了納米纖維膜的親水性，有利于NIH-3T3細(xì)胞的黏附和增殖。

聚乳酸； 聚己內(nèi)酯； 絲素蛋白； 靜電紡絲； 納米纖維膜支架； 生物相容性

biocompatibility

組織工程通過(guò)整合生物支架材料、活體細(xì)胞和生物活性因子以實(shí)現(xiàn)修復(fù)和改善組織損傷的目的。其中組織工程支架作為修復(fù)過(guò)程中力學(xué)支撐的同時(shí)，為細(xì)胞提供增殖、黏附和遷移所需的微環(huán)境。眾多支架材料中，由于納米纖維支架能很好地模擬人體天然細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的結(jié)構(gòu)和功能而受到廣泛關(guān)注[1]。而靜電紡絲法被認(rèn)為是現(xiàn)階段制備納米纖維最簡(jiǎn)單有效的技術(shù)之一，其具有比表面積高，孔隙率高，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互貫通等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域[2]。

體外設(shè)計(jì)和構(gòu)建納米纖維支架應(yīng)具有生物相容性、力學(xué)穩(wěn)定性及可降解性。作為常用的高分子合成材料，聚乳酸(PLA)和聚己內(nèi)酯(PCL)可在體內(nèi)降解為無(wú)毒物質(zhì)[3]。在性質(zhì)上，玻璃態(tài)的PLA具有良好的拉伸強(qiáng)度和生物降解速率，但其柔韌性差，橡膠態(tài)的PCL雖然柔韌性大，生物相容性強(qiáng)，但生物降解速率緩慢[4-5]，這限制了二者在很多領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，將具有良好生物相容性的PLA和PCL材料共混，可實(shí)現(xiàn)二者優(yōu)勢(shì)的互補(bǔ)，得到力學(xué)性能較好的復(fù)合材料[6]。前期研究[7]通過(guò)靜電紡絲方法獲得了具有表面溝壑結(jié)構(gòu)的PLA-PCL復(fù)合納米纖維，但由于PLA-PCL復(fù)合材料制備出的納米纖維膜親水性差，生物活性低，與天然的生物材料或人體組織相比，不利于細(xì)胞的黏附與增殖[8]，故常與細(xì)胞相容性強(qiáng)的天然材料進(jìn)行共混改性。絲素蛋白(SF)是具有良好的生物可降解性和相容性的天然蛋白質(zhì)，對(duì)水和氧通透性好，植入人體后無(wú)免疫原性，在臨床上用作醫(yī)用縫合線已有多年[9]，將其與合成材料復(fù)合，將有助于改善納米纖維膜的親水性，提高復(fù)合納米纖維膜的生物活性。然而現(xiàn)有研究主要集中在PLA-PCL復(fù)合納米纖維膜[2-6]、PLA或PCL與天然生物材料共混的靜電紡絲纖維膜[9]在組織工程中的應(yīng)用，絲素蛋白對(duì)PLA-PCL復(fù)合納米纖維的形貌、結(jié)構(gòu)和性能的影響鮮有報(bào)道，因此，本文采用靜電紡絲法制備不同質(zhì)量比的PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜材料，分析不同質(zhì)量比的納米纖維膜的形貌和結(jié)構(gòu)，測(cè)試材料的孔隙率、吸附性以及親水性，并研究了不同質(zhì)量比的納米纖維膜對(duì)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)生長(zhǎng)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

家蠶生絲(浙江桐廬)；聚乳酸(PLA，質(zhì)均分子質(zhì)量為100 000)、聚己內(nèi)酯(PCL，質(zhì)均分子質(zhì)量為80 000)、噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；六氟異丙醇(HFIP，鹽城冬陽(yáng)生物制品有限公司)；甲醇、乙醇(杭州高晶精細(xì)化工有限公司)；碳酸鈉、氯化鈣(國(guó)藥集團(tuán))；透析袋(截留分子質(zhì)量為14 ku，美國(guó)聯(lián)合碳化物公司)；高糖DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾有限公司)；青霉素鈉100 U/mL(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；硫酸鏈霉素100 U/mL(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；胎牛血清(FBS，Biowest公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，Amrcsco公司)；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH-3T3(實(shí)驗(yàn)室保存)。

KDS220型微量注射泵(KD Scientific)；FC60P2型高壓電源(Glassman公司)；FreeZone型冷凍干燥機(jī)(LABCONCO公司)；恒溫磁力攪拌器(C-MAG HS7digital IKANAG?，IKA公司)。

1.2 PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜的制備

前期研究結(jié)果表明，當(dāng)PLA與PCL質(zhì)量比為80∶20時(shí)，通過(guò)靜電紡絲可獲得具有表面溝壑結(jié)構(gòu)的納米纖維[7]。在此基礎(chǔ)上，為考察SF加入量對(duì)三元體系纖維形貌的影響，將PLA-PCL與SF以質(zhì)量比為100∶0、90∶10、70∶30、50∶50、30∶70、0∶100溶解于HFIP中，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的PLA-PCL/SF紡絲液。將紡絲液倒入直徑為16 cm的注射器中，以鋁箔為接收裝置，在溶液流速為0.6 mL/h，紡絲電壓為12 kV，接收距離為13 cm的條件下進(jìn)行靜電紡絲。將制備好的納米纖維膜放入真空干燥箱中干燥24 h后，浸入體積比為90∶10的甲醇和水混合溶液中浸泡10 min，晾干備用。

1.3 復(fù)合納米纖維膜的結(jié)構(gòu)表征

采用Vatrass掃描電子顯微鏡(FE-SEM)觀察甲醇處理前后納米纖維的形貌；采用Nicolet5700傅里葉紅外變換光譜儀(FT-IR)檢測(cè)甲醇處理前后纖維膜化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，采用溴化鉀壓片，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1。

1.4 復(fù)合納米纖維膜的性能測(cè)試

1.4.1 接觸角測(cè)試

用DCA-322動(dòng)態(tài)接觸角分析儀測(cè)試納米纖維膜的表面親水性能，將樣品固定于載玻片上保持平整，滴加蒸餾水2 μL，每個(gè)樣品取5個(gè)平行樣。

1.4.2 孔隙率測(cè)試

通過(guò)排乙醇溶液的方法測(cè)定納米纖維膜的孔隙率。稱得纖維膜樣品質(zhì)量為ms，裝滿乙醇后比重瓶質(zhì)量為m1，將纖維膜浸入至比重瓶后真空排氣，使纖維膜與乙醇充分接觸，向比重瓶中加滿乙醇稱得其質(zhì)量為m2，用鑷子取出充分浸潤(rùn)的樣品，稱得剩余乙醇和瓶子質(zhì)量為m3[10]，按照下式計(jì)算納米纖維膜的孔隙率：

1.4.3 吸附率測(cè)試

采用羥基磷灰石吸附法評(píng)價(jià)納米纖維膜的吸附能力。將納米纖維膜(質(zhì)量為mb)置于0.5%納米羥基磷灰石水溶液中，于30 ℃轉(zhuǎn)速為120 r/min勻速搖床上孵育24 h，取出吸附羥基磷灰石的納米纖維膜，稱得質(zhì)量為ma，按照下式計(jì)算納米羥基磷灰石在納米纖維膜表面的吸附量：

1.4.4 力學(xué)性能測(cè)試

將納米纖維膜裁剪成尺寸為50 mm × 5 mm的樣條，通過(guò)KEG-G1型多功能拉伸儀測(cè)試其拉伸曲線，夾頭間距為20 mm，以2 mm/s的加載速度對(duì)樣品進(jìn)行拉伸測(cè)定，每組平行測(cè)試2個(gè)樣條。

1.4.5 細(xì)胞增殖測(cè)試(MTT法)

將各組纖維膜裁剪成直徑為6 mm的圓片置于96孔板中，用75%的乙醇消毒4 h，用無(wú)菌PBS溶液漂洗3次，用DMEM培養(yǎng)液浸泡試樣過(guò)夜。將胰酶消化后的NIH-3T3細(xì)胞以5×104個(gè)/mL的密度接種于纖維膜上，每孔加入100 μL細(xì)胞懸浮液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在接種后的第1、4、7天取出96孔板，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，小心吸棄培養(yǎng)液，加入150 μL的DMSO，振蕩10 min使紫色結(jié)晶物甲瓚完全溶解，吸取100 μL至新96孔板中，在酶標(biāo)儀上讀取490 nm波長(zhǎng)處吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)量比對(duì)復(fù)合納米纖維膜形貌的影響

PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜甲醇處理前后的FE-SEM照片分別如圖1、2所示。

圖1 不同質(zhì)量比PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜甲醇處理前的FE-SEM照片F(xiàn)ig.1 FE-SEM images of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite fibrous membranes before methanol treatment

圖2 不同質(zhì)量比PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜甲醇處理后的FE-SEM照片F(xiàn)ig.2 FE-SEM images of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite fibrous membranes treated by methanol

從圖1、2中觀察到，PLA/PCL納米纖維表面分布著溝壑，其形成機(jī)制是溶液從噴頭被擠出后，溶劑迅速?gòu)纳淞髦袚]發(fā)，在射流表面形成孔洞，射流被高壓電場(chǎng)拉伸，孔洞逐漸被拉伸成溝壑，當(dāng)纖維沉積在接受板上，孔洞以溝壑的狀態(tài)呈現(xiàn)在纖維表面[9]。隨著SF含量的增加，纖維表面形貌發(fā)生了改變，由PLA/PCL納米纖維表面溝壑狀形貌轉(zhuǎn)變?yōu)镻LA-PCL/SF復(fù)合納米纖維表面孔洞狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)SF含量增加到50%以上時(shí)，纖維表面光滑。SF的加入對(duì)復(fù)合納米纖維表面形貌的改變主要由于低含量的SF在甲醇處理后轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B結(jié)構(gòu)，分散于PLA-PCL相中進(jìn)而形成表面孔洞形貌的纖維[10]。而在高含量SF的PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜中，纖維表面主要受絲素蛋白的主導(dǎo)作用而趨于光滑。

2.2 復(fù)合納米纖維膜化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

注：a—甲醇處理前(0∶100);b—甲醇處理后(0∶100)；c—甲醇處理前(50∶50);d—甲醇處理后(50∶50);e—甲醇處理前(100∶0)。圖3 PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜甲醇處理前后FT-IR圖譜Fig.3 FT-IR images of PLA-PCL /SF composite fibrous membranes before and after methanol treatment

2.3 接觸角分析

材料的親水性對(duì)細(xì)胞黏附增殖等行為具有較大影響，而接觸角是親水性能的重要指標(biāo)之一。為此，考察了不同含量SF的加入對(duì)材料表面接觸角的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖可知：PLA-PCL納米纖維膜呈疏水性，接觸角為134.66°；隨著SF含量的增加，復(fù)合納米纖維膜的接觸角不斷減小，表明親水性不斷增加。

圖4 PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜的水接觸角Fig.4 Water contact angle images of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite nanofibrous members

2.4 纖維膜對(duì)納米羥基磷灰石的吸附性能

表1示出甲醇處理后不同質(zhì)量比PLA-PCL/SF纖維膜的孔隙率。可見(jiàn)，隨著SF含量的增加，纖維膜孔隙率降低。這是由于甲醇處理使SF由無(wú)定型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B結(jié)構(gòu)，纖維膜發(fā)生收縮，孔隙率減小。

表1 PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜的水接觸角、孔隙率和吸附率Tab.1 Water contact angle, porosity and adsorptivity of PLA-PCL/SF composite nanofibrous membranes

通過(guò)羥基磷灰石吸附法測(cè)定不同納米纖維膜對(duì)納米羥基磷灰石的吸附能力，纖維膜的孔隙率與其對(duì)羥基磷灰石的吸附率呈正相關(guān)，隨著孔隙率減少，吸附性也下降。PLA-PCL與SF質(zhì)量比為90∶10和70∶30時(shí)，復(fù)合納米纖維膜的吸附率較大，不僅由于纖維表面的孔洞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步增加了纖維表面的比表面積，從而提高了纖維膜的吸附性，而且纖維膜的孔隙率較大時(shí)，有利于纖維膜對(duì)納米羥基磷灰石的吸附。

2.5 力學(xué)性能分析

表2示出不同絲素含量復(fù)合纖維膜的拉伸力學(xué)性能。從表可見(jiàn)，PLA-PCL纖維膜的彈性模量、平均斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均高于PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜。且隨著SF含量的增加，復(fù)合纖維膜的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率均逐漸減小。這是由于天然SF是脆性材料，相對(duì)于純絲素膜，PLA-PCL有效提高了復(fù)合纖維膜的拉伸性能(見(jiàn)圖5)。

表2 不同質(zhì)量比PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜的力學(xué)性能Tab.2 Mechanical properties of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite nanofibrous membranes

圖5 不同質(zhì)量比的PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜的應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖Fig.5 Stress-strain curves of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite nanofibrous members

2.6 細(xì)胞增殖性能分析

細(xì)胞在支架材料上生長(zhǎng)、黏附和增殖情況是評(píng)價(jià)纖維膜生物相容性的重要指標(biāo)。利用MTT法，檢測(cè)活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的活力，其總活性與細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，可間接反映細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞增殖能力。圖6示出不同質(zhì)量比PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜上NIH-3T3細(xì)胞的活性。可以看出，隨著SF含量的增加，細(xì)胞活性呈明顯增加趨勢(shì)，表明PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜具有良好的生物相容性，SF的加入有利于NIH-3T3細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。從細(xì)胞電鏡照片(見(jiàn)圖7)可看出，支架表面細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，細(xì)胞呈鋪展的形態(tài)，且隨著SF含量的增加，細(xì)胞鋪滿支架表面，該現(xiàn)象與MTT結(jié)果一致，表明SF的加入可改善材料的生物相容性。

圖6 不同質(zhì)量比PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜上NIH-3T3細(xì)胞的活性Fig.6 NIH-3T3 cell activities of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite nanofibrous membranes

圖7 NIH-3T3細(xì)胞在不同質(zhì)量比PLA-PCL/SF復(fù)合纖維膜上培養(yǎng)7 d的FE-SEM照片F(xiàn)ig.7 FE-SEM images of NIH-3T3 cells on different mass ratios of PLA-PCL/SF composite membranes after 7 d

3 結(jié) 論

通過(guò)靜電紡絲法制備的復(fù)合納米纖維膜經(jīng)醇處理后，絲素蛋白相由無(wú)規(guī)自由態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)棣抡郫B結(jié)構(gòu)，質(zhì)量比為90∶10和70∶30的PLA-PCL/SF納米纖維表面分布密集的孔洞，且纖維表面的孔洞隨著SF含量的增加而減少。通過(guò)調(diào)節(jié)PLA-PCL和SF的質(zhì)量比可調(diào)控纖維的表面形貌。隨著復(fù)合納米纖維膜中SF含量的增加，纖維膜的孔隙率和吸附率逐漸降低，但親水性卻逐漸改善。NIH-3T3細(xì)胞能在PLA-PCL/SF復(fù)合納米纖維膜上很好地生長(zhǎng)，且絲素蛋白含量越大，細(xì)胞增殖越好，與纖維膜的孔隙率和吸附率相比，纖維膜親水性對(duì)細(xì)胞相容性影響更大。

FZXB

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Structure and properties of polylactic acid-polycaprolactone/silk fibroin composite nanofibrous scaffolds

WANG Lijun1,2， XIONG Jie1, LUO Jingjing1,3, ZHAO Xingyan1, ZHAO Xinfei1
(1.CollegeofMaterialsandTextiles，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou，Zhejiang310018，China； 2.SchoolofFashionDesign，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou，Zhejiang310018，China； 3.CollegeofLifeSciences，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou，Zhejiang310018，China)

Polylactic acid-polycaprolactone/silk fibroin (PLA-PCL/SF) composite nanofibrous scaffolds with different mass ratios were fabricated by electrospinning. The morphologies and structures of nanofibrous mats were characterized by scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). The porosity and adsorbent behavior of the fibrous mats were also measured. The results shows that the mass ratio of PLA-PCL and SF components has obvious influence on the morphologies of nanofibrous scaffolds, and high density pores present on nanofibrous surfaces at mass ratios of 90∶10 and 70∶30. The structure of SF in PLA-PCL/SF composite scaffold is changed from amorphous structure to β-sheet conformation by methanol treatment. The porosity and adsorbent behavior of the nanofibrous mats decrease with increasing SF contents in composite nanofibrous scaffolds. The water contact angle test and mouse fibroblasts cells (NIH-3T3) culture results indicate that the hydrophilicity of nanofibrous scaffolds is improved by the addition of SF for better adhesion and proliferation of NIH-3T3 cells.

polylactic acid; polycaprolactone; silk fibroin; electrospinning; nanofibrous scaffold;

2016-04-27

2017-01-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11272289)

王利君(1971—)，女，博士生。主要研究方向?yàn)閺?fù)合納米纖維材料。熊杰，通信作者，E-mail: jxiong@zstu.edu.cn。

10.13475/j.fzxb.20160407606

TQ 342.87

A