混合菌群發(fā)酵馬尾藻作為海藻肥料的研究

王明鵬, 陳 蕾, 劉正一, 王學(xué)江, 秦 松, 閆培生, 3

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混合菌群發(fā)酵馬尾藻作為海藻肥料的研究

王明鵬1, 陳 蕾2, 劉正一2, 王學(xué)江4, 秦 松2, 閆培生1, 3

(1. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院, 黑龍江哈爾濱 150090; 2. 中國科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所, 山東煙臺(tái) 264003; 3. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 山東威海 264209; 4. 五洲豐農(nóng)業(yè)科技有限公司, 山東煙臺(tái) 264000)

從馬尾藻原位分離發(fā)酵菌群, 采用分子生物學(xué)手段分析鑒定菌種組成, 獲得發(fā)酵菌株4株分別為巨大芽孢桿菌(), 非脫羧勒克氏菌(), 鞘氨醇單胞菌()以及賴氨酸芽孢桿菌(); 控制4菌株接種比例進(jìn)行馬尾藻發(fā)酵, 監(jiān)測發(fā)酵過程中菌種生物量、褐藻酸含量及褐藻寡糖含量變化規(guī)律, 結(jié)果表明, 馬尾藻經(jīng)發(fā)酵36 h生成聚合度2-5的褐藻寡糖, 并伴隨菌種二次生長及pH下降等易于觀察檢測的參數(shù)變化; 含褐藻寡糖的發(fā)酵原液稀釋600倍后, 能夠明顯促進(jìn)小麥種子萌發(fā)及根生長, 與清水對照相比萌發(fā)率提高26%, 根系長度增長37%。本研究為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)海藻肥料提供了可行案例, 證實(shí)該方法簡單有效, 可操作性強(qiáng), 有廣闊的應(yīng)用前景, 為將來實(shí)現(xiàn)海藻發(fā)酵肥工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持和數(shù)據(jù)支撐。

發(fā)酵; 馬尾藻; 褐藻寡糖; 促生長

公元4世紀(jì)已有海藻用作土壤肥料的記載。海藻富含多種營養(yǎng)物質(zhì), 能夠改善土壤并對植物生長產(chǎn)生有益功效, 加之獲取方便, 成本低廉, 常被人們用作天然有機(jī)肥料[1]。目前, 海藻肥料已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化, 全球范圍內(nèi)有眾多海藻肥生產(chǎn)廠家。根據(jù)國際農(nóng)業(yè)行業(yè)權(quán)威雜志New AG International對以海藻為主原料的海藻肥市場統(tǒng)計(jì), 2012年, 在歐洲市場上, 海藻肥經(jīng)濟(jì)價(jià)值20億~40億歐元, 全球預(yù)計(jì)最低為80億歐元, 僅占整個(gè)農(nóng)資市場(含化肥、殺蟲殺菌市場)總額的2%, 海藻肥在農(nóng)業(yè)上的經(jīng)濟(jì)價(jià)值空間巨大[2]。

據(jù)統(tǒng)計(jì), 2012年全世界海藻產(chǎn)量接近2 490萬噸, 其中有相當(dāng)比例的海藻作為生長促進(jìn)劑及土壤調(diào)節(jié)劑被應(yīng)用于種植領(lǐng)域[3]。大型海藻主要分為紅藻、綠藻、褐藻三大門類, 其中褐藻是全球范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的海藻肥生產(chǎn)原料, 包括海帶、馬尾藻、泡葉藻、巨藻等[4]。褐藻與其他藻類相比有其獨(dú)特的營養(yǎng)成分, 比如褐藻酸、褐藻糖膠、褐藻多糖等。褐藻酸是褐藻細(xì)胞壁的主要組成成分, 含量占褐藻干質(zhì)量的20%~40%。褐藻酸由甘露糖醛酸和古羅糖醛酸單體通過1→4糖苷鍵連接組成長鏈大分子結(jié)構(gòu), 并且與褐藻糖膠、多酚、蛋白質(zhì)等成分相互交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò), 對支撐和維持細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)起決定性作用[5-6]。如何將海藻中的營養(yǎng)物質(zhì)高效提取利用, 同時(shí)最大限度地保障其活性在加工過程中不被破壞是海藻肥料制造領(lǐng)域需要突破的關(guān)鍵技術(shù)。然而, 褐藻細(xì)胞壁的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和堅(jiān)韌特性是阻礙海藻細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)釋放的最大障礙。因此, 我們的需求就是分解褐藻酸這一關(guān)鍵成分的大分子結(jié)構(gòu), 進(jìn)而瓦解海藻細(xì)胞壁, 促使海藻細(xì)胞中的營養(yǎng)物質(zhì)的釋放。目前,海藻肥制備方法主要是依賴酸、堿及化學(xué)有機(jī)試劑等對海藻原料進(jìn)行提取, 該方法雖然簡單但是易造成藻肥活性物質(zhì)的不可逆性破壞, 同時(shí)酸、堿、有機(jī)試劑成分殘留在海藻肥產(chǎn)品中, 會(huì)對農(nóng)作物及土壤環(huán)境造成危害。物理法對儀器設(shè)備要求嚴(yán)苛, 成本較高, 難以實(shí)現(xiàn)行業(yè)推廣[7]。因此, 海藻肥生產(chǎn)廠家需要尋找更為環(huán)保高效的生產(chǎn)方法。

微生物發(fā)酵是一種反應(yīng)溫和, 簡單可控, 安全環(huán)保的生物反應(yīng)過程。自古以來, 人們已經(jīng)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)出多種產(chǎn)品, 但是利用微生物發(fā)酵海藻的研究主要集中在生產(chǎn)生物質(zhì)乙醇和抗性天然產(chǎn)物[8-10],利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)海藻肥料的研究相對較少。國內(nèi)相關(guān)的幾例研究是選用傳統(tǒng)發(fā)酵微生物比如酵母, 乳酸菌等混合菌群對海藻原料進(jìn)行類似堆肥發(fā)酵或好氧發(fā)酵處理。但其發(fā)酵過程可控性差, 發(fā)酵周期長, 目標(biāo)產(chǎn)物不明確, 難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求的統(tǒng)一, 穩(wěn)定, 可控的標(biāo)準(zhǔn), 產(chǎn)品的質(zhì)量難以保障[11-13]。發(fā)酵海藻的微生物, 因此, 本文擬從解決上述問題入手, 針對性地分離篩選特種發(fā)酵菌株, 對馬尾藻進(jìn)行微生物發(fā)酵處理, 并對其發(fā)酵過程及產(chǎn)物功效進(jìn)行初步研究, 探索微生物發(fā)酵生產(chǎn)海藻肥的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

馬尾藻樣品采自山東長島, 采集新鮮海藻裝入自封袋后放入冰盒, 運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于4℃冷柜保存。馬尾藻經(jīng)沖洗去除表面的沙粒、貝殼等雜質(zhì), 置于60℃烘干后, 研磨成粉末, 按照1︰20(/)與蒸餾水混合, 于121℃滅菌處理20 min, 冷卻后離心獲得海藻的熱水浸提液(SWE培養(yǎng)基), 加入2%瓊脂, 滅菌倒平板, 制成馬尾藻平板。

1.2 菌株的篩選與鑒定

新鮮海藻剪成3~5 cm的片段, 置于無菌三角瓶中, 瓶底加少量無菌2216E培養(yǎng)基, 封口后三角瓶置于30℃溫箱培養(yǎng), 待2~3周后, 將海藻片段表面附生的菌苔刮下, 用無菌水梯度稀釋后, 涂布馬尾藻平板。

1.2.1 菌株革蘭氏染色

挑取平板上生長24 h的新鮮菌落, 涂抹在載玻片中央的清水滴中, 用酒精燈火焰將水分輕輕烤干。菌體細(xì)胞固定后, 結(jié)晶紫染色1 min, 用自來水沖洗, 碘液媒染1 min, 自來水沖洗, 吸干水分, 加95%酒精數(shù)滴, 并輕輕搖動(dòng)進(jìn)行脫色, 20 s后水洗, 吸去水分, 最后加番紅染色1 min, 自來水沖洗, 干燥后鏡檢。

1.2.2 菌株分子鑒定

挑取馬尾藻平板上不同形態(tài)的單菌落, 接種于2216E培養(yǎng)基中, 過夜培養(yǎng), 取1 mL菌液提取基因組DNA, 用27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)通用引物擴(kuò)增16SrDNA, 將PCR產(chǎn)物送至英濰捷基公司測序。各菌株的16S rDNA序列經(jīng)比對后用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 菌株發(fā)酵

4株菌株分別經(jīng)2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)12~16 h, 測定600 nm處吸光值, 用無菌水分別調(diào)節(jié)OD600值至1.0, 將調(diào)好的4種菌懸液混合, 按照1%的接種比例將混合菌液轉(zhuǎn)接至馬尾藻液體培養(yǎng)基(SWE培養(yǎng)基), 30℃, 200 r/m培養(yǎng)。每隔4 h取樣, 測定馬尾藻發(fā)酵液OD600值, pH值和褐藻酸含量。另外, 發(fā)酵結(jié)束后, 取5個(gè)5 mL離心管, 各管內(nèi)加入0.3 mL馬尾藻發(fā)酵液和2.7 mL馬尾藻水提液, 置于30℃培養(yǎng), 分別在0、1、3、5、7 h各取出一管, 測定管內(nèi)褐藻酸含量。

1.4 褐藻酸含量檢測

發(fā)酵液中褐藻酸含量檢測采用分光光度法[14]。原理為褐藻酸與2價(jià)以上金屬離子生成的褐藻酸鹽類(鎂鹽除外)是水不溶性的。利用褐藻酸鈉與硫酸銅進(jìn)行反應(yīng), 生成褐藻酸銅[Cu(Alg)2], 過量的銅離子在pH為8.5的堿性條件下與二乙基二硫代氨基甲酸鈉(銅試劑)作用產(chǎn)生黃棕色配合物, 在其最大吸收波長447 nm條件下測定該配合物的吸光值, 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出與褐藻酸鈉結(jié)合的銅離子量進(jìn)而計(jì)算褐藻酸的含量。

1.5 褐藻寡糖的TLC檢測

褐藻寡糖的分析檢測可以用薄層層析法(TLC)對樣品進(jìn)行初步定性分析[15]。采用 Silica Gel 60 F254 硅膠板, 上樣量為 2 μL, 展開劑體系為正丁醇∶甲酸∶水 = 4∶5∶1(∶∶), 將硅膠板置于層析缸中使層析液將其兩次展開, 每次展開后室溫下吹干, 用硫酸-乙醇溶液作為顯色劑, 再次吹干后, 在 110℃下顯色5 min, 結(jié)果照相保存。

1.6 褐藻寡糖的質(zhì)譜鑒定

取36 h發(fā)酵液2 mL加入4倍體積的無水乙醇, 12 000 r/min離心15 min, 去除發(fā)酵液中大分子成分。離心后上清液凍干后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定[16]。

1.7 種子萌發(fā)及生長實(shí)驗(yàn)

挑選大小相近、顆粒飽滿的小麥種子, 分別用清水, 雷力2000 (北京雷力), 馬尾藻水提液, 馬尾藻36 h發(fā)酵液(含褐藻寡糖), 馬尾藻72 h發(fā)酵液(不含海藻寡糖)浸泡小麥種子, 每組處理分別稀釋200倍、400倍、600倍、800倍4個(gè)濃度, 清水處理和雷力海藻肥為對照組。

每組處理的種子均浸于相應(yīng)濃度的溶液中 12 h, 浸種完畢后用蒸餾水沖洗 3 次。將種子整齊播在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中, 每個(gè)培養(yǎng)皿中均放置 60 粒小麥種子, 每個(gè)處理3個(gè)平行共180粒種子, 用紗布蓋上, 置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 期間及時(shí)添加清水保持濕潤, 培養(yǎng)48 h后測定小麥種子萌發(fā)率。

將大小相近顆粒飽滿的小麥種子用清水浸泡12 h, 播撒在發(fā)芽盒中, 置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h, 期間保持濕潤。待小麥種子發(fā)芽后, 挑選長勢相近的幼苗, 轉(zhuǎn)移至盛有上述不同液肥處理的三角瓶中, 進(jìn)行水培實(shí)驗(yàn)。每個(gè)三角瓶中移接3株小麥幼苗, 每組處理設(shè)3個(gè)平行共9株幼苗, 置于光照培養(yǎng)箱(浙江托普 GTOP-310B)中培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為25℃光照12 h, 16℃暗處理12 h。培養(yǎng)72 h后, 對小麥植株進(jìn)行形態(tài)觀察并照相記錄, 選取5株幼苗, 用直尺測量小麥根長。上述實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS 19.0對不同處理的種子萌發(fā)率和根長數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種菌株的鑒定結(jié)果

馬尾藻表面生長的菌落經(jīng)稀釋涂布馬尾藻平板, 獲得4種形態(tài)不同的菌株(圖1), 其中菌株A1和M1為革蘭氏陽性菌, 菌株C1和S1為革蘭氏陰性菌。4種菌株經(jīng)16SrDNA測序, 序列比對結(jié)果顯示, M1菌株與巨大芽孢桿菌()相似度最高為99.79%, A1菌株與賴氨酸芽孢桿菌()相似度最高為99.17%, S1菌株與鞘氨醇單胞菌()相似度最高為99.06%, C1菌株與非脫羧勒克菌()相似度最高為99.37%。采用鄰接法構(gòu)建4株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹, 結(jié)果顯示與上述4種菌親緣關(guān)系最近(圖2)。

2.2 混合菌株發(fā)酵馬尾藻特性

4種菌株等比例混合接種到馬尾藻水提液培養(yǎng)基中, 菌株生長曲線與在2216E培養(yǎng)基中相比有顯著區(qū)別。首先菌種生物量即最大OD600值為2.5(圖3A)明顯低于2216E培養(yǎng)基中的4.0(圖3B), 說明馬尾藻水提液培養(yǎng)基對發(fā)酵菌種來說較難利用, 不如2216E培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分轉(zhuǎn)化利用率高。其次, 馬尾藻水提液培養(yǎng)基在發(fā)酵36 h出現(xiàn)菌種二次生長現(xiàn)象, 與此同時(shí)發(fā)酵液pH值出現(xiàn)小幅度先降后升的變化波動(dòng); 而在2216E培養(yǎng)基中則無此變化。該結(jié)果說明以馬尾藻為營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基在菌株發(fā)酵至一定階段后, 會(huì)出現(xiàn)某種代謝產(chǎn)物作為新的碳源為菌種二次生長提供營養(yǎng)。隨后檢測發(fā)酵液中的褐藻酸含量變化, 結(jié)果顯示發(fā)酵液中的褐藻酸含量在發(fā)酵前期基本保持穩(wěn)定, 但在36 h顯著下降, 含量降至初始值的40%并保持穩(wěn)定(圖3C)。由此推測菌株在發(fā)酵馬尾藻過程中會(huì)分泌褐藻酸裂解酶至胞外, 但該酶只偏好降解褐藻酸的其中一種組分(聚甘露糖醛酸或聚古羅糖醛酸), 故發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中仍有部分褐藻酸未被降解。為驗(yàn)證此推論, 將36 h的發(fā)酵上清液與馬尾藻水提液培養(yǎng)基混合, 置于30℃培養(yǎng), 結(jié)果顯示褐藻酸含量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長呈逐漸下降的趨勢(圖3D), 反應(yīng)7 h后褐藻酸含量降至初始值的40%左右, 與上述發(fā)酵結(jié)果一致; 而經(jīng)煮沸15 min后的發(fā)酵液則無法降解褐藻酸。該結(jié)果表明發(fā)酵液中確實(shí)含有褐藻酸裂解酶。

A. 混合菌群在馬尾藻培養(yǎng)基中的生長曲線和pH變化曲線; B. 混合菌群在2216E培養(yǎng)基中的生長曲線和pH變化曲線; C. 馬尾藻培養(yǎng)基褐藻酸含量變化; D.發(fā)酵液中褐藻酸裂解酶酶活檢測。SFE為海藻發(fā)酵液; SWE為海藻水提液

A. The growth and pH curves of mixed strain in seaweed water extract media; B. The growth and pH curves of mixed strain in 2216E media; C. Change of alginate content in seaweed water extract media; D. Detection of alginate lyase activity of fermentation broth

SFE stands for seaweed fermentation extract; SWE stands for seaweed water extract

2.3 馬尾藻發(fā)酵液中褐藻寡糖的檢測

褐藻寡糖是褐藻酸降解后產(chǎn)生的低聚合度的糖鏈片段, 同時(shí)也是發(fā)酵液中含褐藻酸裂解酶的有力證明。因此, 我們通過薄層層析(TLC)對馬尾藻發(fā)酵液進(jìn)行褐藻寡糖的檢測, 從而進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)酵液中是否存在褐藻酸裂解酶。TLC結(jié)果顯示, 36 h發(fā)酵液中含有褐藻寡糖, 聚合度在2~8之間(圖4A); 隨后根據(jù)此次點(diǎn)樣結(jié)果, 調(diào)整取樣時(shí)間(自24 h至48 h, 每4 h取一次樣), 結(jié)果表明在28~40 h這一時(shí)段均能檢測的褐藻寡糖, 但褐藻寡糖含量及種類隨發(fā)酵時(shí)間的延長呈遞減趨勢, 發(fā)酵40 h后便檢測不到褐藻寡糖(圖4B)。褐藻寡糖出現(xiàn)的時(shí)間段與褐藻酸含量突然下降、微生物二次生長的時(shí)間段一致。由此我們推測, 在發(fā)酵36 h褐藻酸降解成為褐藻寡糖, 而褐藻寡糖作為碳源被菌株利用并出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象。該結(jié)果顯示發(fā)酵32~36 h為褐藻寡糖的最佳收獲時(shí)間。隨后, 36 h的發(fā)酵液經(jīng)質(zhì)譜鑒定, 結(jié)果顯示此發(fā)酵液中富含聚合度2~5的褐藻寡糖(圖4C)。

A. 不同時(shí)間發(fā)酵液中褐藻寡糖的薄層層析圖譜; B. 取樣時(shí)間縮短后發(fā)酵液中褐藻寡糖的薄層層析圖譜; C. 36 h發(fā)酵液中褐藻寡糖質(zhì)譜結(jié)果。Control為寡糖標(biāo)準(zhǔn)品; DP2為寡聚二糖; DP8為寡聚八糖

A. The TLC profile of alginate oligosaccharides in fermentation broth with different fermentation time; B. The TLC profile of alginate oligosaccharides in fermentation broth with sampling intervals narrowed; C. The MS result of alginate oligosaccharides in 36 h fermentation broth. Control stands for standard alginate oligosaccharides; DP2 stands for degree of polymerization of 2; DP8 stands for degree of polymerization of 8

2.4 馬尾藻發(fā)酵液的促生長效果

上述TLC及ESI-MS結(jié)果顯示, 馬尾藻36 h發(fā)酵液中含有褐藻寡糖。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道褐藻寡糖對植物有促生長及誘導(dǎo)抗性等有益功效[17-23]。隨后, 設(shè)計(jì)對照及實(shí)驗(yàn)組, 驗(yàn)證褐藻寡糖的促生長功能。結(jié)果如圖5和表1、2所示, 與清水對照相比, 各濃度馬尾藻發(fā)酵液的促生長效果明顯, 小麥萌發(fā)率顯著提高, 根系長度明顯增加, 并且稀釋倍數(shù)越大, 其促生長效果越明顯。而海藻水提液的功效與發(fā)酵液相反, 稀釋倍數(shù)越大, 其促生長效應(yīng)減弱, 并且水提液的促生長效應(yīng)大多遜于同濃度下的發(fā)酵液。在所有對照組和實(shí)驗(yàn)組中, 含褐藻寡糖的發(fā)酵液稀釋600和800倍的處理對小麥的促生長效果最為顯著。

表1 不同發(fā)酵液處理下的小麥種子萌發(fā)率

注: 不同字母表示處理間差異達(dá)到5%顯著水平. 下同

表2 不同發(fā)酵液處理下小麥根長

3 討論與結(jié)論

微生物發(fā)酵是利用微生物的代謝過程將底物轉(zhuǎn)化成為所需的產(chǎn)品。因此, 微生物是發(fā)酵過程的主導(dǎo)者, 選用合適的發(fā)酵微生物是獲取目的產(chǎn)物的關(guān)鍵。Uchida課題組發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室冰箱中存放的石莼被微生物發(fā)酵釋放出酯類的氣味, 經(jīng)分離純化他們得到了具有較強(qiáng)發(fā)酵能力的一株乳酸菌和酵母菌群, 并利用該微生物對海藻乳酸型和乙醇型發(fā)酵進(jìn)行初步探索[24]。Shobharani等則是通過目的篩選的方法, 以馬尾藻提取物為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選得到了能夠發(fā)酵馬尾藻的海洋來源的乳酸菌, 用來發(fā)酵馬尾藻獲取具有抗氧化功能的活性物質(zhì)[25]。上述研究都是以海藻自身為菌種來源, 篩選分離能夠?yàn)榧核玫摹皩Ｓ谩本N。這是符合自然界物種互相作用影響、共同進(jìn)化規(guī)律的。因此, 海藻原位生長的菌種理論上可滿足各種海藻發(fā)酵需求。本研究從降解褐藻細(xì)胞壁成分的需求出發(fā), 針對性的篩選馬尾藻原位生長的能夠破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的菌群。發(fā)酵結(jié)果證明該菌群在馬尾藻發(fā)酵過程中產(chǎn)生褐藻酸裂解酶, 能夠降解褐藻細(xì)胞壁組成成分褐藻酸, 有利于破壞海藻細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)促使胞內(nèi)活性物質(zhì)釋放, 而單一菌種發(fā)酵馬尾藻在72 h內(nèi)均無法降解褐藻酸(數(shù)據(jù)未顯示)。這一結(jié)果表明, 混合菌群在降解褐藻酸方面比單一菌種更有優(yōu)勢, 或許存在協(xié)作共生關(guān)系, 其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步的深入研究。

同時(shí), 褐藻酸降解產(chǎn)物褐藻寡糖也是一種功能成分, 能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種反應(yīng)。近年來, 褐藻寡糖的功能成為研究熱點(diǎn), 結(jié)果表明褐藻寡糖有明顯的促生長功能及免疫誘抗功能[26, 27]。本研究在馬尾藻發(fā)酵液中檢測到褐藻寡糖成分, 這是首次報(bào)道以海藻提取液為發(fā)酵底物獲得褐藻寡糖。褐藻寡糖成分可被微生物作為碳源利用, 因此需要控制發(fā)酵過程及時(shí)間, 最大限度的收獲褐藻寡糖。多次發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 通過控制發(fā)酵菌株的接種比例(4菌株等比例混合), 發(fā)酵32~36 h可獲得穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)物, 即聚合度為2-5的褐藻寡糖, 并且褐藻寡糖生成伴隨明顯的pH波動(dòng), 菌體二次生長等現(xiàn)象。將來在海藻工業(yè)化生產(chǎn)中, 通過監(jiān)測發(fā)酵過程pH變化即可反映發(fā)酵產(chǎn)物的生成狀況。

海藻發(fā)酵液的促生長功能通過小麥種子萌發(fā)及根長實(shí)驗(yàn)得到了初步驗(yàn)證。結(jié)果表明馬尾藻發(fā)酵液的要比未發(fā)酵的水提液促生長效果明顯, 而含褐藻寡糖的發(fā)酵液要比不含褐藻寡糖的發(fā)酵液效果好, 這說明微生物發(fā)酵過程確實(shí)將海藻肥中的營養(yǎng)成分“升級換代, ”更有利于植物吸收利用。同時(shí), 該結(jié)果再次證明褐藻寡糖的促進(jìn)植物生長功效顯著, 是海藻發(fā)酵液中至關(guān)重要的功能成分。另外, 馬尾藻發(fā)酵液對根的促生長效果存在濃度劑量效應(yīng), 結(jié)果顯示馬尾藻發(fā)酵液稀釋至600~800倍對小麥促根生長效果最為顯著, 與Anisimov等[28]的研究結(jié)果相符。本次使用的陽性對照為商品化的雷力海藻肥, 但其促生長效果不太理想, 可能是因?yàn)槔琢Ｔ宸蕿楦叨葷饪s產(chǎn)品, 若稀釋倍數(shù)太低, 其促生長效應(yīng)大打折扣甚至?xí)种谱魑锷L。

本研究通過原位篩選馬尾藻附生菌群, 獲得了4株發(fā)酵馬尾藻的菌株, 控制4菌株接種比例可以獲得穩(wěn)定的發(fā)酵產(chǎn)物, 發(fā)酵36 h生成聚合度2-5的褐藻寡糖, 并伴隨菌株二次生長及pH下降等易于觀察監(jiān)測的參數(shù)變化, 這對海藻發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。發(fā)酵原液稀釋600倍后, 能夠明顯促進(jìn)小麥種子萌發(fā)及根生長, 萌發(fā)率提高26%, 根系長度增長37%, 具有商業(yè)化產(chǎn)品開發(fā)潛力和價(jià)值。

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Studies on fermentation ofby mixed microorganism utilized as seaweed fertilizer

WANG Ming-peng1, CHEN Lei2, LIU Zheng-yi2, WANG Xue-jiang4, QIN Song2, YAN Pei-sheng1, 3

(1. School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China; 2. Yantai Institute of Costal Zone Research Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 3. School of Marine Science and Technology, Harbin Institute of Technology, Weihai 264209, China; 4. Worldfull Agricultural Science and Technology Co., Ltd, Yantai 264000, China)

Fermentative microorganisms present on the surface of seaweed were screened and then identified by 16S rDNA sequence analysis. We obtained the following four fermentative strains:,,, and. Using controlled inoculation proportion of these four strains, we obtained a stable fermentation product. We studiedthe changes and mechanisms of seaweed fermentation processto provide theoretical and data support for industrialization production of seaweed fermentation fertilizer. At 36 h in the fermentation process, alginate oligosaccharides with polymerization degrees of 2–5 were generated and accompanied by secondary growth of fermentative strains and a decreased pH, which were the parameters that could be easily observed and monitored. Fermentation broth diluted 600 times could significantly promote the germination and root growth of wheat seeds. Germination rate was 26% higher and root growth was 37% longer than those in the control group, respectively. These results provided a feasible strategy for the production of seaweed fertilizer by microbial fermentation. This simple and effective fermentation method has strong operability and broad application prospects.

fermentation;; alginate oligosaccharide; growth promotion

Q815

A

1000-3096(2017)02-0117-08

10.11759/hykx20160428001

2016-04-28;

2016-07-26

威海市科技發(fā)展研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2010-3-96); 國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013BAB01B0); 中國科學(xué)院科技服務(wù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)劃項(xiàng)目(KFJ-EW-STS-060); 國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(41401285); 河口與海岸學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(SKLEC-KF201412); 海洋公益性行業(yè)科研項(xiàng)目(201505022)

王明鵬(1988-), 男, 山東聊城人, 博士研究生, 從事海洋生物資源利用研究, 電話: 0535-6929515, E-mail: wmpdsg@ 126.com; 閆培生, 通信作者, E-mail: yps6@163.com; 秦松, 通信作者, E-mail: sqin@yic.ac.cn

Apr. 28, 2016

[Science and Technology Development Project of Weihai (2010-3-96), National Key Technology R&D Program of China (2013BAB01B0), Science and Technology Service Network Initiative of Chinese Academy of Sciences (KFJ-EW-STS-060), Young Scientists Fund of National Natural Science Foundation of China (41401285), Open Foundation of State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research (SKLEC-KF201412), PublicScience and Technology Research Funds Projects of Ocean (201505022)]

(本文編輯: 康亦兼)