植物生長調(diào)節(jié)劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

張小萌 劉松江 龔文芳 孫君靈 龐保印 杜雄明

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植物生長調(diào)節(jié)劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

張小萌**劉松江**龔文芳 孫君靈 龐保印 杜雄明*

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 / 棉花生物學(xué)國家重點實驗室, 河南安陽 455000

天然彩色棉是理想的綠色、環(huán)保、健康紡織原料。本研究以棕1-61、RT白絮、綠棉CC28為材料, 采取不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑處理胚珠, 在離體培養(yǎng)30 d后觀察纖維顯色狀況, 測量纖維長度并稱取胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重。采用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。結(jié)果表明, 水楊羥基肟酸和氟啶酮處理下, 棕色棉和綠色棉纖維顏色均變淡, 且濃度越高顏色越淺; 添加低濃度尿素、氯霉素和蕓薹素唑可以使棕色棉顯色明顯, 但對綠色棉纖維色澤顯現(xiàn)影響不大; 添加氯化鈷后, 棕色棉纖維色澤變淡, 而對綠色棉纖維色澤影響不大; 另外氯化鈷還抑制愈傷組織的生成; 添加苯丙氨酸解氨酶抑制劑或4CL抑制劑后棕色棉和綠色棉纖維顏色變淺, 濃度越高, 顏色越淡; 水楊羥基肟酸、蕓薹素唑、氟啶酮、氯化鈷、苯丙氨酸解氨酶抑制劑或4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)抑制劑的添加均導(dǎo)致纖維長度、胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重等降低。本文篩選出參與調(diào)控彩色棉纖維發(fā)育和色素合成的植物生長調(diào)節(jié)劑, 為彩色棉纖維色澤改良提供一定的理論基礎(chǔ)。

彩色棉; 纖維發(fā)育; 色素合成; 植物生長調(diào)節(jié)劑

彩色棉因其棉纖維具有天然色彩, 無需化學(xué)印染, 被稱為理想的綠色、環(huán)保、健康紡織原料。但其產(chǎn)量低、纖維短、色素單調(diào)的問題嚴(yán)重制約其廣泛種植。前人研究表明, 彩色棉中色素含量與纖維品質(zhì)有密切關(guān)系。董合忠等[1]指出彩色棉中色素物質(zhì)的存在有可能干擾和影響纖維的伸長、纖維素的合成與纖維素大分子的排列, 最終導(dǎo)致彩色棉纖維品質(zhì)性狀較差及纖維顏色不穩(wěn)定。同時詹少華等[2]研究證明彩色棉纖維中的色素含量與單鈴重和纖維長度呈顯著負(fù)相關(guān)性。因此, 了解并明確彩色棉纖維色素的成分及其形成機(jī)理對改善彩色棉纖維品質(zhì)有重大影響。棕色棉的纖維色素可能為酚類[3]、兒茶素[4-5]或黃酮類化合物[6]。張美玲[7]在棕色棉纖維中檢測出的7種化合物以及在綠色棉纖維中檢測出的12種化合物都是黃酮類物質(zhì)。而綠色棉的纖維色素中除黃酮類化合物外, 可能還有木脂素類物質(zhì)[8]或類似于蘆丁的黃酮醇化合物[7]。汪淼等[9]對棕色棉纖維發(fā)育不同時期纖維的總黃酮、總酚、縮合單寧、PAL與棕色棉色素含量的相關(guān)分析結(jié)果表明, 縮合單寧可能是棕色棉色素合成的直接前體物質(zhì)。Gong等[10]通過轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn), 棕色棉纖維色素的形成可能是縮合單寧和糖基化的花青素相互作用的結(jié)果。彩色棉的纖維發(fā)育受到光[11-13]、溫度、糖[14]、激素、呼吸抑制劑[15]等多種因素的影響。棉胚珠纖維培養(yǎng)方法最早是由Beasley等[16]創(chuàng)立, 現(xiàn)已成為棉纖維發(fā)育研究的有效手段。Shi等[17]報道0.1 μmol L–1乙烯可以促進(jìn)纖維細(xì)胞伸長。Ling等[18]采用不同濃度的ABA對開花當(dāng)天的胚珠離體培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)1 μmol L–1ABA在早期發(fā)育階段促進(jìn)纖維生長。譚琨嶺[19]使用十三嗎琳來處理離體培養(yǎng)的胚珠, 可以抑制生長胚珠上的纖維的長度。Pang等[20]發(fā)現(xiàn)外源ATP合成酶抑制劑的加入使離體胚珠纖維細(xì)胞長度變短, ATP/ADP的比例顯著降低。本文主要研究激素合成抑制劑(茉莉酸甲酯合成抑制劑水楊羥基肟酸、油菜素內(nèi)酯合成抑制劑蕓薹素唑、脫落酸抑制劑氟啶酮、乙烯合成抑制劑氯化鈷)、類黃酮代謝抑制劑(苯丙氨酸解氨酶抑制劑、4CL專一性抑制劑)對彩色棉纖維發(fā)育和色素合成的影響, 另外還從蛋白質(zhì)合成代謝角度, 選擇蛋白質(zhì)合成促進(jìn)劑(尿素)和質(zhì)體蛋白質(zhì)合成抑制劑(氯霉素)來研究彩色棉纖維發(fā)育與蛋白質(zhì)代謝的相互關(guān)系, 從中篩選出參與調(diào)控彩色棉纖維發(fā)育和色素合成的植物生長調(diào)節(jié)劑, 為彩色棉纖維色澤改良提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用3個試材, 棕-61 (Z1-61, 棕色棉品系)、RT白絮(RT-White, 白色棉品系)和CC28 (綠色棉品系), 均由國家棉花種質(zhì)資源中期庫提供, 課題組每年自交保存。試驗用的植物生長調(diào)節(jié)劑有吲哚乙酸(indole acetic acid, IAA)、赤霉素(gibberellin, GA3)、茉莉酸甲酯(methyl jasmona, MeJA)和油菜素內(nèi)酯(brassinolide, BR), 購自阿拉丁(Aladdin Industrial Corporation)。茉莉酸甲酯抑制劑-水楊羥基肟酸(Salicylhydroxamic acid, SHAM)也購自阿拉丁, 蕓薹素唑(Brassinazole, BRz)購自Tokyo Chemical Industry (TCI)。PAL抑制劑-對羥基苯甲酸和4CL抑制劑-3,4 (亞甲二氧)肉桂酸均購自北京百靈威科技有限公司, 尿素和氯霉素為國產(chǎn)分析純, 胚珠離體培養(yǎng)所用試劑購自德國Amresco公司或美國Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 胚珠培養(yǎng) 于2014—2015年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所棉花生物學(xué)國家重點實驗室(安陽)。參考葉春燕等[21]的方法培養(yǎng)胚珠, 將BT培養(yǎng)基[16]分裝在100 mL三角瓶中, pH調(diào)至5.0, 經(jīng)高壓滅菌(121℃, 20 min)后備用。每瓶加50 mL培養(yǎng)基。每個處理分3組, 每組5瓶, 每瓶接種10~15枚胚珠。在32℃黑暗條件下培養(yǎng)30 d后觀察胚珠纖維發(fā)育和顯色狀況。參考徐楚年等[22]的研究進(jìn)行預(yù)試驗, 所有處理均添加10.0 μmol L–1的IAA和5.0 μmol L–1的GA3。MeJA、SHAM、BR、BRz、PAL抑制劑、4CL抑制劑都是先配成母液過濾滅菌后備用。

1.2.2 試驗設(shè)計 激素抑制劑分為茉莉酸甲酯抑制劑、油菜素內(nèi)酯抑制劑、脫落酸抑制劑和乙烯抑制劑試驗。含茉莉酸甲酯抑制劑(SHAM)、茉莉酸甲酯(MeJA)和品種的三因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計; 油菜素內(nèi)酯抑制劑(BRz)、油菜素內(nèi)酯(BR)和品種的三因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計; 脫落酸抑制劑(FLD)和品種的二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計; 乙烯抑制劑(CoCl2)、乙烯(ETH)和品種的三因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。

代謝抑制劑分為苯丙氨酸解氨酶(PAL)抑制劑和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)抑制劑試驗。含PAL抑制劑和品種的二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計; 4CL抑制劑和品種的二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。

蛋白質(zhì)合成促進(jìn)劑和質(zhì)體蛋白質(zhì)合成抑制劑試驗含蛋白質(zhì)合成促進(jìn)劑(尿素)與品種的二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計, 質(zhì)體蛋白質(zhì)合成抑制劑(氯霉素)與品種的二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。

1.2.3 顯色情況觀察 觀察30DPC (培養(yǎng)后的天數(shù))的纖維顯色狀況, 并照相記錄。用Photoshop提取圖片前景色多個點的顏色值(RGB), 計算顏色系數(shù)P=R/(G+B), 其中, R、G、B分別為紅、綠、藍(lán)三基色單位量, 對每個圖像隨機(jī)獲取4個P值, 求均值, 將纖維色澤數(shù)值化, 數(shù)值越大纖維顏色越深。

1.2.4 生理指標(biāo)的測定 參考徐楚年等[21]的方法。隨機(jī)取10枚30DPC的胚珠, 置載玻片上, 用高壓水流將棉纖維沖直, 用針小心將重疊纖維分離并使其伸展, 直尺測量纖維長度。隨機(jī)取10枚胚珠, 用濾紙將表面液體吸干, 剝離纖維后用精度為1 mg電子天平稱量胚珠鮮重, 3個重復(fù)。于85℃將纖維和剝離纖維的胚珠烘至恒重。

1.2.5 統(tǒng)計分析 試驗中每個處理的數(shù)據(jù)均以平均數(shù)表示, 采用SAS V9統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。主要采用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較, 并對顏色系數(shù)作方差分析(見附表)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茉莉酸甲酯合成抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

由圖1-A圖可知, 不同濃度茉莉酸甲酯合成抑制劑水楊羥基肟酸處理下, 棕色棉和綠色棉纖維顯色均不太明顯, 水楊羥基肟酸濃度越高顏色越淺, 分別呈現(xiàn)從淺棕到近白、淺綠到近白的變化, 顏色系數(shù)P數(shù)值越來越小; 由圖1-B圖可知, 同等濃度茉莉酸甲酯處理下, 添加抑制劑水楊羥基肟酸后, 棕色棉顯色明顯變淡, 綠色棉所受影響不大。由表1看出, 纖維長度、胚珠鮮重、纖維干重、胚珠干重均隨水楊羥基肟酸濃度的增加而降低, 濃度越高胚珠發(fā)育受毒害越嚴(yán)重, 當(dāng)達(dá)到261.20 μmol L–1時, 胚珠死亡(數(shù)據(jù)未給出)。由表2可見在同等程度的茉莉酸甲酯水平下, 施加水楊羥基肟酸后, 纖維長度、胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重都有所降低。其中纖維長度、胚珠鮮重、胚珠干重降低幅度最為明顯。

2.2 油菜素內(nèi)酯合成抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

由圖2可見, 添加2.5 μmol L–1油菜素內(nèi)酯抑制劑(BRz)后, 棕色棉纖維顏色加深, 而對綠色棉顯色影響不大。在同等程度的油菜素內(nèi)酯水平下, 施BRz后, 纖維長度、胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重明顯降低(表3)。

A: 水楊羥基肟酸處理; B: 茉莉酸甲酯和水楊羥基肟酸處理。

A: SHAM treatment; B: MeJA and SHAM treatments.CK: 0 μmol L–1SHAM; S1: 3.26 μmol L–1SHAM; S2: 6.53 μmol L–1SHAM; S3: 32.65 μmol L–1SHAM; S4: 65.30 μmol L–1SHAM; S5: 130.60 μmol L–1SHAM;MS1: 0 μmol L–1MeJA+0 μmol L–1SHAM; MS2: 0 μmol L–1MeJA+20 μmol L–1SHAM; MS3: 0 μmol L–1MeJA+40 μmol L–1SHAM; MS4: 40 μmol L–1MeJA+0 μmol L–1SHAM; MS5: 40 μmol L–1MeJA+20 μmol L–1SHAM; MS6: 40 μmol L–1MeJA+40 μmol L–1SHAM.

表1 水楊羥基肟酸處理對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

標(biāo)有不同字母的值在0.05水平差異顯著。Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

表2 茉莉酸甲酯抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

標(biāo)有不同字母的值在0.05水平差異顯著。Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

Z1: 0 μmol L–1BR+0.0 μmol L–1BRz; Z2: 0 μmol L–1BR+2.5 μmol L–1BRz; Z3: 0 μmol L–1BR+5.0 μmol L–1BRz; Z4: 5 μmol L–1BR+0.0 μmol L–1BRz; Z5: 5 μmol L–1BR+2.5 μmol L–1BRz; Z6: 5 μmol L–1BR+5.0 μmol L–1BRz.

2.3 脫落酸合成抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

由圖3可見, 脫落酸合成抑制劑氟啶酮處理下, 胚珠發(fā)育和纖維色澤均受到影響。氟啶酮濃度越高, 越不利于胚珠發(fā)育, 纖維顏色變淺。根據(jù)表4可見, 當(dāng)氟啶酮(FLD)濃度為1 μmol L–1時, 棉纖維長度達(dá)最大值, Z1-61、CC28分別比自身對照增加12.67%和1.98%, 差異顯著(<0.05), 超過此濃度時, 棉纖維長度、胚珠鮮重等指標(biāo)都明顯降低。

2.4 乙烯合成抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

由圖4可知, 加入乙烯抑制劑后胚珠發(fā)育和纖維顯色均受到影響。當(dāng)只加5 μmol L–1ETH時, 產(chǎn)生愈傷組織, 但當(dāng)同時加入乙烯和乙烯抑制劑氯化鈷后, 就不再產(chǎn)生愈傷。當(dāng)乙烯濃度相同的情況下, 氯化鈷濃度越高, 纖維越短, 達(dá)到0.5 mmol L–1時纖維很短, 無法測量。胚珠鮮重、胚珠干重等指標(biāo)也隨濃度增加而降低(表5)。

2.5 類黃酮代謝抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

圖5表明, 添加PAL抑制劑和4CL抑制劑后棕色棉和綠色棉纖維顏色變淺, 濃度越高, 顏色越淡, 胚珠和纖維發(fā)育也受到抑制, 胚珠和纖維長度隨著抑制劑濃度的增加而降低(表6和表7), 添加抑制劑后纖維變短, 基本不著生纖維或在胚珠表面有短絨。

表3 BR與BRz處理對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育影響

標(biāo)有不同字母的值在0.05水平差異顯著。

Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

表4 氟啶酮處理對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

標(biāo)有不同字母的值在0.05水平差異顯著。

Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

CK: 0 μmol L–1FLD; F1: 1 μmol L–1FLD; F2: 5 μmol L–1FLD; F3: 10 μmol L–1FLD.

2.6 蛋白質(zhì)合成促進(jìn)劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

由圖6-A可見, 只有當(dāng)尿素濃度為5 g L–1時棕色纖維顏色變深, 且隨著濃度的增加, 顏色逐漸變淺, 而綠色纖維色澤受尿素濃度影響不大。由表8可見, 當(dāng)尿素濃度為5 g L–1時纖維最長, Z1-61、RT白絮和CC28均比自身對照分別增加22.22%、6.00%和3.80%, 差異顯著。且纖維長度、胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重隨著尿素濃度的增加而降低。

G1: 0 μmol L–1ETH+0 mmol L–1CoCl2; G2: 0 μmol L–1ETH+0.1 mmol L–1CoCl2; G3: 0 μmol L–1ETH+0.2 mmol L–1CoCl2; G4:0 μmol L–1ETH+0.5 mmol L–1CoCl2; G5:5 μmol L–1ETH+0 mmol L–1CoCl2; G6: 5 μmol L–1ETH+0.1 mmol L–1CoCl2; G7: 5 μmol L–1ETH+0.2 mmol L–1CoCl2; G8: 5 μmol L–1ETH+0.5 mmol L–1CoCl2.

表5 乙烯抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

標(biāo)有不同字母的值在0.05水平差異顯著。

Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

A: PAL抑制劑處理; B: 4CL抑制劑處理。

A: PAL inhibitor treatment; B: 4CL inhibitor treatment. CK: 0 μmol L–1PAL inhibitor; N1: 5 μmol L–1PAL inhibitor; N2: 15 μmol L–1PAL inhibitor; N3: 25 μmol L–1PAL inhibitor; N4: 50 μmol L–1PAL inhibitor; CK: 0 μmol L–14CL inhibitor; W1: 5 μmol L–14CL inhibitor; W2: 15 μmol L–14CL inhibitor; W3: 25 μmol L–14CL inhibitor; W4: 50 μmol L–14CL inhibitor.

表6 PAL抑制劑處理對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

標(biāo)有不同字母的值在0.05水平差異顯著。

Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

表7 4CL抑制劑對彩色棉胚珠培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

標(biāo)有不同字母的值在0.05水平差異顯著。

Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

2.7 質(zhì)體蛋白質(zhì)合成抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

由圖6-B可見, 當(dāng)氯霉素濃度為1 mg L–1時, 棕色纖維顏色變深, 隨著濃度的增加, 顏色逐漸變淺, 綠色纖維顏色基本無變化。由表9可知而纖維長度在1 mg L–1時達(dá)到最大值, 其中Z1-61、RT白絮和CC28纖維長度比自身對照分別增加24.08%、10.35%和5.81%, 差異顯著(< 0.05)。隨著氯霉素濃度增高, 纖維長度、胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重等指標(biāo)均呈降低趨勢。

A: 尿素處理; B: 氯霉素處理。A: urea treatment; B: chloramphenicol treatment.

CK: 0 g L–1urea; U1: 5 g L–1urea; U2: 10 g L–1urea; U3: 20 g L–1urea. CK: 0 mg L–1chloramphenicol; Chl1: 1 mg L–1chloramphenicol; Chl2: 5 mg L–1chloramphenicol; Chl3: 10 mg L–1chloramphenicol.

表8 尿素處理對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

標(biāo)有不同字母的值在0.05水平差異顯著。

Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

表9 氯霉素處理對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

標(biāo)有不同字母的值在0.05水平差異顯著。

Values followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

綜上所述, 添加適宜濃度的油菜素內(nèi)酯合成抑制劑(2.5 μmol L–1)、尿素(5 g L–1)、氯霉素(1 mg L–1)均有利于棕色棉纖維顯色, 而對綠色棉纖維顏色無明顯影響。其中在適宜濃度的尿素(5 g L–1)、氯霉素(1 mg L–1)培養(yǎng)條件下, 棉纖維長度均達(dá)到最大值。添加其他抑制劑均可造成棉纖維顏色變淺, 纖維長度、胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重等指標(biāo)降低。

3 討論

3.1 植物生長調(diào)節(jié)劑抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育和纖維色素合成的影響

茉莉酸甲酯(MeJA)、油菜素內(nèi)酯(BR)、脫落酸(ABA)和乙烯(ETH)都是廣泛存在于植物體內(nèi)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。國內(nèi)外已經(jīng)有許多關(guān)于茉莉酸及其衍生物作為外源誘導(dǎo)子應(yīng)用于植物次生代謝的報道[23-24]。這是由于MeJA可以激活次生代謝產(chǎn)物合成途徑, 導(dǎo)致功能基因或轉(zhuǎn)錄因子的過量表達(dá), 而這些受到MeJA高度調(diào)節(jié)的功能基因或轉(zhuǎn)錄因子大都是途徑上的關(guān)鍵酶基因, 過量表達(dá)的關(guān)鍵酶基因打破了目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑上的瓶頸反應(yīng), 使得代謝更多地向目標(biāo)產(chǎn)物合成的方向流動, 最終過量積累目標(biāo)產(chǎn)物[25]。馬杰等[26]研究表明MeJA處理可有效提高鮮切萵苣和鮮切甘藍(lán)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性, 同時提高次生代謝產(chǎn)物如總酚、類黃酮以及木質(zhì)素的含量, 證明茉莉酸甲酯作為外界信號分子可誘導(dǎo)并激活苯丙烷代謝途徑。內(nèi)源JAs產(chǎn)量的提高也會導(dǎo)致植物中相應(yīng)代謝產(chǎn)物的積累, 與單純加強(qiáng)代謝途徑中單一或若干步驟的表達(dá)相比, JA生物合成途徑的基因工程操作可能是一個更加有效的方法, 能夠全面調(diào)控目標(biāo)化合物的合成。谷曉策[27]通過過量表達(dá)茉莉酸甲酯生物合成途徑中重要的關(guān)鍵酶-丙二烯氧化物環(huán)化酶(AOC)和茉莉酸羧甲基轉(zhuǎn)運(yùn)酶(JMT), 提高了丹參的次生代謝產(chǎn)物丹參酮的含量, 并且發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)異源和內(nèi)源基因能夠產(chǎn)生同樣的效果。植物中高水平的SHAM 可誘導(dǎo)香豆素[28]、類胡蘿卜素[29]等多種羥基苯甲酸和羥基苯丙烯酸衍生物的合成。本研究通過添加茉莉酸甲酯合成抑制劑(SHAM)來調(diào)控MeJA的產(chǎn)量, 結(jié)果顯示, 隨著SHAM濃度的增加, 棕色棉顏色變淺, 胚珠鮮重、纖維干重和胚珠干重等都有所下降, 當(dāng)SHAM濃度達(dá)到40 mg L–1時, 胚珠死亡。這從反方向證明MeJA在棕色棉纖維色素合成和纖維發(fā)育過程中的關(guān)鍵作用。JAs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在植物界中廣泛存在, 并且MeJA合成途徑上的基因被大量克隆, 這些基因的功能域非常保守。因此可以通過對茉莉酸合成途徑上一個限速步驟的遺傳改造, 提高內(nèi)源MeJA合成, 以達(dá)相關(guān)次生代謝途徑合成能力提高的目的, 從而改良彩色棉的色澤和纖維品質(zhì)。

油菜素內(nèi)酯可以在細(xì)胞水平上誘導(dǎo)植物發(fā)生一系列復(fù)雜的生理效應(yīng), 其最顯著的作用是可以誘導(dǎo)細(xì)胞伸長和細(xì)胞分裂。黃婕[30]研究提出了BR促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物紫草寧合成的一種機(jī)制, 即BR調(diào)控紫草寧合成中重要酶類的酶活性, 調(diào)節(jié)紫草寧合成中前體物質(zhì)的供給和分流, 最終促進(jìn)紫草寧的合成。淦慶雷[31]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)BR的這種促進(jìn)作用是通過鈣信使發(fā)生作用的, 與鈣離子及鈣調(diào)蛋白密切相關(guān), 同時提出改變膜的通透性是BR改變離子通道促進(jìn)紫草寧合成的另一種機(jī)制。劉松江等[32]研究發(fā)現(xiàn)高濃度BR影響茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制纖維伸長發(fā)育。本研究則發(fā)現(xiàn)一定濃度的內(nèi)源油菜素內(nèi)酯抑制劑可有助于棕色棉顯色, 而對纖維伸長發(fā)育起抑制作用。從反向印證了油菜素內(nèi)酯在棕色棉纖維發(fā)育中的關(guān)鍵作用。

任杰和冷平[33]研究表明外源ABA能促進(jìn)內(nèi)源ABA的合成和乙烯的釋放, 提高甜櫻桃果實的成熟度和花青苷含量, 促進(jìn)果實軟化。方榮俊等[34]研究表明在一定濃度范圍內(nèi), 乙烯對植物次生代謝產(chǎn)物的合成起促進(jìn)作用, 低于或超過該濃度范圍則起抑制作用。劉金等[35]研究表明乙烯啟動并調(diào)控早熟蘋果成熟期花青苷的積累, 可能是通過調(diào)控UFGT酶的活性。本研究表明脫落酸合成抑制劑(FLD)和乙烯抑制劑(CoCl2)處理均對胚珠和纖維發(fā)育不利。從反向證明脫落酸和乙烯可能對纖維次生代謝物質(zhì)合成有促進(jìn)作用。

3.2 類黃酮代謝抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

有關(guān)黃酮類化合物的生物合成途徑主要集中在以苯丙氨酸為前體的黃酮化合物的代謝途徑。作為苯丙烷類代謝過程中的關(guān)鍵酶, 苯丙氨酸解氨酶(PAL)聯(lián)系著植物初級代謝和次級代謝, 它催化苯丙氨酸生成反式肉桂酸, 是苯丙烷類代謝的限速酶。而4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)催化反式-4香豆酸生成香豆酰CoA, 隨后進(jìn)入類黃酮代謝過程。Srinivasan等[36]指出外加代謝抑制劑阻斷法是研究次級代謝途徑的一種可靠方法。目前關(guān)于類黃酮代謝抑制劑的研究較少。李賀勤等[37]采用PAL酶專一性抑制劑(AOA)和4CL酶專一性抑制劑(MDCA)處理野葛愈傷后發(fā)現(xiàn), AOA處理顯著抑制以苯丙氨酸為前體的異黃酮化合物的合成, MDCA處理導(dǎo)致其前體物質(zhì)的積累。本研究中發(fā)現(xiàn)PAL抑制劑和4CL抑制劑的添加顯著抑制棕色棉和綠色棉纖維伸長和色素合成, 證實了彩色棉色素成分中黃酮類物質(zhì)的存在。

3.3 蛋白質(zhì)合成促進(jìn)劑和質(zhì)體蛋白質(zhì)合成抑制劑對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維發(fā)育的影響

梁穎等[38]用蛋白質(zhì)合成促進(jìn)劑-尿素和質(zhì)體蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素處理甘藍(lán)型油菜植株發(fā)現(xiàn), 尿素可以顯著提高種皮蛋白質(zhì)含量, 降低色素含量, 而氯霉素可降低種皮蛋白質(zhì)含量, 使種皮色澤變深。而本文研究發(fā)現(xiàn)用5 g L–1尿素或1 mg L–1氯霉素處理時, 棕色纖維顏色變深, 纖維長度增加, 且濃度越高顏色越淺, 纖維長度、胚珠鮮重等指標(biāo)均降低。說明適宜濃度的蛋白質(zhì)含量可以促進(jìn)彩色棉纖維伸長和色素合成。

4 結(jié)論

茉莉酸甲酯抑制劑從反向印證了茉莉酸甲酯在棕色棉纖維伸長和色素合成過程中的關(guān)鍵作用; 油菜素內(nèi)酯抑制劑也從反向揭示出BR在棉胚珠發(fā)育和纖維伸長中的作用; 脫落酸合成抑制劑和乙烯抑制劑處理均對胚珠和纖維發(fā)育不利, 從反向證明脫落酸和乙烯可能對纖維次生代謝物質(zhì)合成有促進(jìn)作用; 苯丙氨酸解氨酶(PAL)專一性抑制劑和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)抑制劑的添加顯著抑制棕色棉和綠色棉纖維發(fā)育和色素合成, 證實了彩色棉色素成分中黃酮類物質(zhì)的存在; 適宜濃度蛋白質(zhì)含量促進(jìn)彩色棉纖維伸長和色素合成。

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附表1 處理對彩色棉胚珠離體培養(yǎng)纖維顏色系數(shù)影響的方差分析結(jié)果

Supplementary table 1 Variance analysis for fiber color coefficient of ovule culturein colored cotton

處理Treatment變異來源Source of variation自由度df平方和SS均方MSF值F-valueP值P-value 水楊羥基肟酸SHAM品系Variety20.02700.0135101.60P < 0.0001 處理間Treatment50.09800.0196147.80P < 0.0001 品系×處理Variety× treatment100.00680.00075.10P < 0.0001 誤差Residual540.00720.0001 茉莉酸甲酯MeJA品系Variety20.23320.1166787.20P < 0.0001 處理間Treatment50.31950.0639431.50P < 0.0001 品系×處理Variety× treatment100.06590.006644.47P < 0.0001 誤差Residual540.00800.0001 BR與BRz品系Variety20.03930.0196126.80P < 0.0001 處理間Treatment50.07260.014593.83P < 0.0001 品系×處理Variety× treatment100.02350.002415.21P < 0.0001 誤差Residual540.00840.0002 氟啶酮FLD品系Variety20.02440.012286.01P < 0.0001 處理間Treatment30.03320.011177.87P < 0.0001 品系×處理Variety× treatment60.03700.006243.48P < 0.0001 誤差Residual360.00510.0001 乙烯抑制劑ETH inhibitor品系Variety20.10340.0517505.10P < 0.0001 處理間Treatment70.10230.0146142.80P < 0.0001 品系×處理Variety× treatment140.00470.00033.31P = 0.0004 誤差Residual720.00740.0001 PAL抑制劑PAL inhibitor品系Variety20.06790.0339867.60P < 0.0001 處理間Treatment40.03210.0080205.40P < 0.0001 品系×處理Variety× treatment80.00410.000513.18P < 0.0001 誤差Residual450.00180.0000 4CL抑制劑4CL inhibitor品系Variety20.02380.0119346.20P < 0.0001 處理間Treatment40.08840.0221644.10P < 0.0001 品系×處理Variety× treatment80.02150.002778.35P < 0.0001 誤差Residual450.00150.0000 尿素Urea品系Variety20.18450.09231502.00P < 0.0001 處理間Treatment30.02340.0078126.90P < 0.0001 品系×處理Variety× treatment60.00480.000812.90P < 0.0001 誤差Residual360.00220.0001 氯霉素Chloramphenicol品系Variety20.07680.0384264.50P < 0.0001 處理間Treatment30.00730.002416.74P < 0.0001 品系×處理Variety× treatment60.00410.00074.73P = 0.0012 誤差Residual360.00520.0001

Effects of Plant Growth Regulators on Fiber Growth and Development in Colored Cotton Ovule Culture

ZHANG Xiao-Meng**, LIU Song-Jiang**, GONG Wen-Fang, SUN Jun-Ling, PANG Bao-Yin, and DU Xiong-Ming*

Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences / State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, China

Naturally colored cotton is an ideal textile raw material for the environmental protection and human health. The ovule of cotton varieties Z1-61, Lyumian CC28, and RT-baixu (CK) was cultured in the media with different concentrations of plant growth regulators (MeJA, SHAM, BR, BRz, FLD, ETH, CoCl2, PAL inhibitor, 4CL inhibitor, Urea, and Chl). After 30 days, the fiber color, fiber length, ovule fresh weight, ovule dry weight and fiber dry weight were determined and analyzed with Duncan's new multiple range method. Under the treatments of salicylhydroxamic, phenylalanine ammonia solution enzyme inhibitor and 4CL inhibitor, the color of Z1-61 and Lyumian CC28 cotton fiber was light, and the higher the concentration of the Salicylhydroxamic acid, the lighter of the cotton fiber color. BRz (2.5 μmol L–1) was conducive to the pigment accumulation in brown cotton fiber, while did not have any significant effect on the pigment appearance of green cotton. Both FLD and CoCl2made the color of brown cotton fiber lighter, while CoCl2had little influence on the green color cotton fiber and inhibited the formation of callus.Moreover,salicylhydroxamic acid, BRz, FLD, CoCl2, phenylalanine ammonia solution enzyme inhibitor or 4CL inhibitor decreased the fiber length, ovule fresh weight, fiber dry weight and ovule dry weight. In addition, 5 g L–1urea or 1 mg L–1Chl were advantageous to the brown cotton fiber pigment synthesis. In conclusion, the growth regulators tested in this study revealed the correlations among pigments synthesis, hormone, flavonoid metabolism and protein metabolism, which would be useful for developing colored cotton cultivars.

Colored cotton; Fiber growth; Pigment synthesis; Plant growth regulators

10.3724/SP.J.1006.2017.00763

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31601353)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31601353).

(Corresponding author): 杜雄明, E-mail: dxm630723@163.com**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

張小萌, E-mail: 18738237057@163.com; 劉松江, E-mail: shj0805938@163.com

(收稿日期): 2016-07-14; Accepted(接受日期): 2017-01-21; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2017-02-17.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1146.038.html