清腦片對(duì)小鼠鎮(zhèn)痛效果的實(shí)驗(yàn)研究＊

李重先，謝國(guó)旗，時(shí)敏秀，高延玲，張旭輝，孔學(xué)軍，李獻(xiàn)玉，朱秀卓，張正臣

疼痛是一種不愉快的感覺(jué)和情緒上的感受，伴有或具有潛在的組織損傷［1］，是臨床最常見(jiàn)的癥狀之一，涉及臨床各科，見(jiàn)于多種急、慢性疾病過(guò)程之中。疼痛在心理、生理、精神及社會(huì)多個(gè)方面都嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，已成為全球性的公共健康問(wèn)題。因而對(duì)各種疼痛癥的研究和治療日益受到全球醫(yī)藥界的重視。探討疼痛的發(fā)病機(jī)理，尋求有效防治痛癥的途徑、方法和藥物是當(dāng)前醫(yī)藥界的重要任務(wù)之一。

清腦片為復(fù)方制劑，主要由白芷、當(dāng)歸、川芎、勾藤、細(xì)辛、龍骨、薄荷等組成。功能主治：活血、行氣通竅、鎮(zhèn)痛、清利頭目。用于頭痛、頭暈、腦震蕩后遺癥。為探討其鎮(zhèn)痛作用，觀(guān)察了清腦片對(duì)小鼠尾根加壓的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥品 清腦片（主要成分：白芷、當(dāng)歸、川芎、勾藤、細(xì)辛、龍骨、薄荷；功能主治：活血、行氣通竅、鎮(zhèn)痛、清利頭目。用于頭痛、頭暈、腦震蕩后遺癥；用法用量：口服，3 次/d，3～5 片/次），中國(guó)人民解放軍第371中心醫(yī)院提供，批號(hào)20141125；暈痛定膠囊（陽(yáng)性藥）：生產(chǎn)廠(chǎng)家：河南龍都藥業(yè)有限公司；規(guī)格：0.4g×27 粒/盒；生產(chǎn)批號(hào)：150309；生理鹽水，河南雙鶴華利藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)130909 06B；醫(yī)用乙醇，新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司，批號(hào)20140105；純凈水，新鄉(xiāng)娃哈哈食品有限公司，批號(hào)20130811；醋酸溶液，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20131205

1.2 儀器 JM 1000電子秤，余姚記銘稱(chēng)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司；AL204電子天平，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；YLS－3E電子壓痛儀，濟(jì)南義延科技發(fā)展有限公司。

1.3 動(dòng)物 50只小鼠為昆明種，清潔級(jí)，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，合格證編號(hào)：37009200000 905。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（豫）2015－005。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 清腦片對(duì)小鼠尾部壓痛實(shí)驗(yàn)的影響 取50只小鼠，18～22 g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)3 d。預(yù)先篩選痛閾正常小鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，即清腦片大、中、小劑量組及暈痛定組、生理鹽水組。用尾壓測(cè)痛儀測(cè)定小鼠給藥前痛閾，即基礎(chǔ)痛閾，方法是：將小鼠尾（約尾尖1/3處）置于壓痛儀操作臺(tái)上，施加連續(xù)遞增壓力，當(dāng)小鼠出現(xiàn)掙扎退縮或嘶叫反應(yīng)時(shí)，顯示器讀出的壓力值即為痛閾指標(biāo)。然后分別灌服大、中、小劑量的清腦片混懸液（2.24 g/kg、1.12 g/kg、0.56 g/kg；相當(dāng)于臨床劑量的30倍、15倍、7.5倍），暈痛定混懸液（0.9 g/kg，相當(dāng)于臨床劑量的15倍）及同體積生理鹽水，各實(shí)驗(yàn)組小鼠給藥體積為0.1 ml/10 g，灌胃給藥1次/d，連續(xù)7 d，于末次給藥后1 h后測(cè)定痛閾值。痛閾提高值=給藥后痛閾－給藥前痛閾，凡痛閾提高值為負(fù)數(shù)時(shí)，按0計(jì)。并按下式計(jì)算痛閾值提高百分率（%）：閾值提高百分率（%）=［（給藥后痛閾值－給藥前痛閾值痛）/給藥前痛閾值］×100%［2，3］。結(jié)果見(jiàn)表1。

1.4.2 清腦片對(duì)醋酸致小鼠扭體模型的影響 再取小鼠50只，體重18～21 g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)室正常飼養(yǎng)3 d，隨機(jī)分為5組，即模型組、暈痛定組、大、中、小劑量清腦片組，每組10只。分別灌服大、中、小劑量清腦片混懸液 （2.24 g/kg、1.12 g/kg、0.56 g/kg，0.22 g/ml、0.11 g/ml、0.056 g/ml，0.1 ml/10g）、暈痛定膠囊混懸液（0.9 g/kg，0.09 g/ml，0.1 ml/10g）及同體積的生理鹽水（0.1 ml/10g），給藥 1次/d，連續(xù)給藥3 d，于末次給藥1 h時(shí)，每只小鼠腹腔注射新配制的0.5%醋酸蒸餾水液0.1 ml/10 g，立即觀(guān)察小鼠首次出現(xiàn)扭體反應(yīng)的潛伏期及10 min內(nèi)的扭體次數(shù)。每組結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率。鎮(zhèn)痛百分率=（對(duì)照組扭體次數(shù)－給藥組扭體次數(shù)）/對(duì)照組扭體次數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21軟件統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異采用t檢驗(yàn)方法；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 清腦片對(duì)尾根加壓法小鼠疼痛反應(yīng)的影響給藥前各組基礎(chǔ)痛閾無(wú)明顯差異（P＞0.05），說(shuō)明分組均勻。與生理鹽水組比，大、中、小劑量清腦片組和暈痛定組均可顯著提高小鼠痛閾、使痛閾提高值顯著升高（P＜0.01）。 見(jiàn)表 1。

2.2 清腦片對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響 與生理鹽水組對(duì)比，大、中劑量清腦片組及暈痛定膠囊組均可顯著延長(zhǎng)小鼠首次扭體的潛伏期（P＜0.01）、顯著減少10 min內(nèi)扭體次數(shù)（P＜0.01），小劑量清腦片組可明顯延長(zhǎng)小鼠首次扭體的潛伏期 （P＜0.05）、明顯減少 10 min 內(nèi)扭體次數(shù)（P＜0.05）。 見(jiàn)表2。

表1 清腦片對(duì)尾根加壓法小鼠疼痛反應(yīng)的影響（±s，n=10）

表1 清腦片對(duì)尾根加壓法小鼠疼痛反應(yīng)的影響（±s，n=10）

注：與生理鹽水組比，＊P＜0.05；#P＜0.01。

痛閾提高百分率（%）生理鹽水組 － 270.39±25.48 7.58暈痛定組 0.90 267.35±20.67 99.64大劑量清腦片組 2.24 266.43±21.00 99.63中劑量清腦片組 1.12 264.68±32.27 85.08小劑量清腦片組 0.56 267.70±30.13 72.93組別 給藥劑量（g/kg） 基礎(chǔ)痛閾（g） 給藥后痛閾（g） 痛閾提高值（g）342.21±22.95 71.82±15.98 532.46±36.76 265.11±25.63#528.99±24.55 262.56±28.88#486.04±30.17 221.36±14.77#459.44±36.60 191.74±28.92#

表2 清腦片對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s，n=10）

表2 清腦片對(duì)醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響（±s，n=10）

注：與生理鹽水組比較，＊P＜0.05，#P＜0.01。

鎮(zhèn)痛率（%）生理鹽水組 － 3.41±0.57 33.6±4.14 －暈痛定膠囊組 0.90 5.01±0.56# 19.9±4.07# 40.77清腦片大劑量組 2.24 4.82±0.71# 21.7±5.10# 35.42中劑量組 1.12 4.48±0.60# 24.3±4.67# 27.68小劑量組 0.56 4.17±0.66＊ 27.6±5.46＊ 17.86分組 劑量（g/kg）潛伏期（min）10 min內(nèi)扭體次數(shù)（次）

3 討論

清腦片方中白芷為君藥，辛、溫，具有解表散風(fēng)、通竅鎮(zhèn)痛的作用。當(dāng)歸，辛、溫，具有補(bǔ)血、活血、鎮(zhèn)痛的作用。川芎，辛、溫，具有活血行氣、祛風(fēng)鎮(zhèn)痛的作用。勾藤，甘、微寒，具有息風(fēng)止痙、清熱平肝的作用。細(xì)辛，辛、溫，具有祛風(fēng)散寒、通竅鎮(zhèn)痛的作用。四藥合用為臣藥。龍骨，甘、澀，具有鎮(zhèn)靜安神、收斂固澀的作用，為佐藥。薄荷辛、涼，具有疏散風(fēng)熱，清利頭目的作用，為使藥，以上七藥合用具有活血行氣、通竅鎮(zhèn)痛的作用。可有效緩解腦震蕩后頭痛癥狀。臨床應(yīng)用取得了較好的療效［12］，前期的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)也證明了該制劑具有活血、抗平衡失調(diào)的作用［13－15］。為驗(yàn)證其鎮(zhèn)痛作用進(jìn)行了該實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物模型是研究疾病的發(fā)病機(jī)理以及尋求開(kāi)發(fā)新藥物或更有效治療手段的基礎(chǔ)，理想的疼痛模型應(yīng)該具備：（1）致痛原因近似臨床實(shí)際情況；（2）動(dòng)物的疼痛行為反應(yīng)以及逃避疼痛刺激的反射活動(dòng)與某種或某些慢性疼痛癥狀相似，可以客觀(guān)檢測(cè)；（3）便于進(jìn)行疼痛發(fā)生機(jī)制的研究；（4）模型制作簡(jiǎn)便，成功率高，可重復(fù)性強(qiáng)；（5）反復(fù)刺激幾乎不引起或只引起極小的組織損傷。

目前國(guó)內(nèi)外篩選鎮(zhèn)痛藥常用的鎮(zhèn)痛方法有物理（熱、電、機(jī)械）和化學(xué)刺激法，其中物理法多用于篩選較強(qiáng)鎮(zhèn)痛藥，化學(xué)法主要用于篩選具有抗炎作用的鎮(zhèn)痛藥，但這些方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。另外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床試驗(yàn)結(jié)果的平行關(guān)系也是未知的，因此對(duì)清腦片的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了多種鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)方法。其中小鼠尾根加壓法屬反射性測(cè)通模型，本方法的優(yōu)點(diǎn)在于同一小鼠痛閾變化很小，相近重量小鼠變異系數(shù)很小，重復(fù)性好，對(duì)強(qiáng)弱鎮(zhèn)痛藥均有效，所以輔以機(jī)械刺激實(shí)驗(yàn)以確保清腦片的鎮(zhèn)痛作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其具有明顯的對(duì)抗機(jī)械壓力引起的疼痛，疼痛提高百分率可達(dá)98.55%。腹腔注射醋酸引起小鼠長(zhǎng)時(shí)間的疼痛刺激，從而導(dǎo)致扭體反應(yīng)，即腹部?jī)?nèi)凹、軀干與后腿伸張、臀部高起。觀(guān)察給予醋酸10 min內(nèi)發(fā)生扭體反應(yīng)“扭體”次數(shù)。此實(shí)驗(yàn)方法具有敏感、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等特點(diǎn)，也是篩選鎮(zhèn)痛藥物經(jīng)典動(dòng)物模型之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明清腦片大、中、小劑量均能減少醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)，說(shuō)明清腦片對(duì)醋酸所致小鼠有鎮(zhèn)痛作用。以大、中劑量清腦片的鎮(zhèn)痛療效最優(yōu)。

綜上可知，清腦片具有鎮(zhèn)痛作用，可以對(duì)抗機(jī)械刺激引起的傷害性反應(yīng)，且有量效關(guān)系，但對(duì)其有效成分以及鎮(zhèn)痛機(jī)制尚有待于進(jìn)一步的研究探討。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知尾根加壓法和扭體反應(yīng)鎮(zhèn)痛率隨著劑量的增加而效果逐步增強(qiáng)，再增大劑量已無(wú)顯著療效，目前實(shí)驗(yàn)中的最佳劑量即為當(dāng)前大劑量，在大劑量的范圍內(nèi)目前無(wú)明顯的不良反應(yīng)。

志謝 本實(shí)驗(yàn)在河南中醫(yī)藥大學(xué)苗明三教授指導(dǎo)下完成，特此致謝。

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