多粘類芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl基因在大腸桿菌中的表達(dá)

王艷，馬亞茹，萬(wàn)學(xué)瑞，王川，吳潤(rùn)，劉桂林，劉原子，吳自祥

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

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多粘類芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl基因在大腸桿菌中的表達(dá)

王艷，馬亞茹，萬(wàn)學(xué)瑞，王川*，吳潤(rùn)*，劉桂林，劉原子，吳自祥

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

為了有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性，本實(shí)驗(yàn)將多粘類芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl(bglA和bglB基因)基因分別連接在pET-28a上并在大腸桿菌C41中表達(dá)。將這3株重組菌分別命名為EA、EB及共表達(dá)菌株EAB，并將構(gòu)建好的工程菌EA和EB按1∶1，1∶2，2∶1進(jìn)行混合培養(yǎng)，分別比較單一酶組分、共表達(dá)及混合表達(dá)菌株的酶活。SDS-PAGE電泳圖顯示BglA和BglB的大小都為50 ku，EA和EB混合培養(yǎng)的蛋白大小也為50 ku，Bgl大小為100 ku，表明BglA和BglB在體外不能形成蛋白復(fù)合物，只有在生物體內(nèi)才能形成Bgl復(fù)合蛋白。酶活測(cè)定結(jié)果表明共表達(dá)Bgl與多粘類芽孢桿菌的酶活差異不顯著，但顯著高于其他組分酶活(P<0.05)。剛果紅染色結(jié)果也表明Bgl酶活比單一酶組分的酶活明顯提高。本實(shí)驗(yàn)為纖維素酶多組分人工組裝及集成生物工藝菌種的構(gòu)建奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

β-葡萄糖苷酶；多粘類芽孢桿菌；克隆和表達(dá)；共表達(dá)；酶活

纖維素是植物材料的主要成分，植物通過(guò)光合作用的形式使光能以生物能的形式固定下來(lái)，其生成量每年高達(dá)2000億t，其中50%以上為纖維素和半纖維素，這些能量相當(dāng)于全球人類每年能源消耗量的20倍，食物中所含能量的200倍，是永遠(yuǎn)不會(huì)枯竭的可再生資源[1]。但由于纖維素具有水不溶性的高結(jié)晶構(gòu)造，其外圍又被木質(zhì)素層包圍，要把它水解成可利用的葡萄糖相當(dāng)困難，所以到目前為止纖維素仍沒(méi)有得到很好地應(yīng)用[2]。纖維素的降解包括物理法、化學(xué)法和生物降解法，其中生物降解法因具有條件溫和、成本低廉而且對(duì)環(huán)境無(wú)污染的特點(diǎn)備受關(guān)注。

β-葡萄糖苷酶，又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，屬于糖苷水解酶家族3，能將各種寡糖及纖維二糖降解為葡萄糖，是纖維素水解糖化過(guò)程中的限速步驟。它不僅能夠水解纖維二糖產(chǎn)生兩分子的葡萄糖，更可解除纖維二糖對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的抑制，提高水解速率和程度。但在纖維素酶系中β-葡萄糖苷酶所占比例不足1%，這使其成為纖維素降解成單糖的瓶頸[3]。有報(bào)道指出，當(dāng)增加纖維素酶中β-葡萄糖苷酶活性，能有效提高纖維素的酶解效率[4]。由于不同來(lái)源的β-葡萄糖苷酶活性差異很大，因此獲得比活高、產(chǎn)量大、熱穩(wěn)定性好的β-葡萄糖苷酶一直是研究纖維素酶水解的熱點(diǎn)問(wèn)題。

有研究指出，多粘類芽孢桿菌(Bacilluspolymyxa)所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶對(duì)木質(zhì)纖維素來(lái)源的纖維二糖水解專一性較高，這對(duì)于研究纖維素的酶解機(jī)制有重要意義，因而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的高度重視[5]。bglA和bglB基因是β-葡萄糖苷酶bgl的兩個(gè)亞基，單個(gè)亞基不足以充分發(fā)揮水解纖維素的作用或者對(duì)纖維素的水解作用相對(duì)較弱，因此本研究選擇來(lái)源于西北特殊地理環(huán)境的多粘類芽孢桿菌作為研究材料，并分別克隆表達(dá)了β-葡萄糖苷酶bglA及bglB基因后又將bglA和bglB基因進(jìn)行了共表達(dá)。

本研究將β-葡萄糖苷酶(bgl)的兩個(gè)亞基bglA和bglB分別連接到pET-28a上，與此同時(shí)將bglA和bglB連接在pET-28a上，將3個(gè)重組質(zhì)粒分別在大腸桿菌C41中表達(dá)，并比較重組菌株的酶活。本研究對(duì)提高β-葡萄糖苷酶的酶活及纖維素的降解具有極大的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌DH5α、C41及質(zhì)粒pBluescript ⅡKS(+)、pET-28a為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏，多粘類芽孢桿菌為本實(shí)驗(yàn)室分離所得。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ和SmaⅠ、T4DNA Ligase、T4磷酸化酶(PNK)購(gòu)于TaKaRa公司；鎳柱購(gòu)于GE公司；IPTG、X-gal、氨芐青霉素、卡那霉素、FastPfu fly DNA Polymerase購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；剛果紅、水楊苷、CMC-Na購(gòu)于國(guó)產(chǎn)分析純；CTAB購(gòu)于OXOID公司產(chǎn)品；質(zhì)粒DNA小提試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)大腸桿菌DH5α、C41及多粘類芽孢桿菌的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B(Luria-Bertani)培養(yǎng)基[3]，LB-微晶纖維素鈉培養(yǎng)基用于多粘類芽孢桿菌的誘導(dǎo)，2×YT(2×Yeast Tryptone)培養(yǎng)基用于重組菌株的誘導(dǎo)，LB-CMC培養(yǎng)基[4]用于剛果紅試驗(yàn)檢測(cè)β-葡萄糖苷酶的水解能力。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 試驗(yàn)材料為多粘類芽孢桿菌，于2015年3月14日在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌體后采用CTAB法提取基因組DNA[6]。

1.2.2 重組質(zhì)粒pET-28a::bglA和pET-28a::bglB的構(gòu)建 重組質(zhì)粒pET-28a::bglA和pET-28a::bglB的構(gòu)建策略見(jiàn)圖1A和圖1B。以多粘類芽孢桿菌基因組DNA為模板，bglA-F/R為引物(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增bglA片段，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s；64 ℃ 30 s；72 ℃ 80 s；共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；以多粘類芽孢桿菌基因組DNA為模板，bglB-F/R為引物(表1)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增bglB片段，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s；61 ℃ 30 s；72 ℃ 80 s；共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用膠回收試劑盒分別回收PCR產(chǎn)物后，將目的片段與pET-28a同時(shí)經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切，酶切后的目的片段與pET-28a純化后通過(guò)T4DNA Ligase進(jìn)行連接，分別得到重組質(zhì)粒pET-28a::bglA和pET-28a::bglB。重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證(BamHⅠ和XhoⅠ)正確后，送往金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 共表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a::bgl(pET-28a::bglA::bglB)的構(gòu)建 共表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a::bgl(pET-28a::bglA::bglB)的構(gòu)建策略見(jiàn)圖1C。首先將引物bglA-R1和bglB-F1磷酸化，然后以多粘類芽孢桿菌基因組DNA為模板，bglA-F/R1為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增bglA片段，PCR反應(yīng)條件同上；以多粘類芽孢桿菌基因組DNA為模板，bglB-F1/R為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增bglB片段，PCR反應(yīng)條件同上。用膠回收試劑盒分別回收bglA和bglB片段，用BamHⅠ酶切bglA片段，XhoⅠ酶切bglB片段，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切pBluescript Ⅱ KS(+)后，將酶切后的bglA、bglB與pBluescript Ⅱ KS(+)純化后通過(guò)T4DNA Ligase連接得到重組質(zhì)粒pBluescript Ⅱ KS(+)::bgl。重組質(zhì)粒通過(guò)SmaⅠ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證正確后，將重組質(zhì)粒pBluescript Ⅱ KS(+)::bgl與pET-28a分別用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物純化后用T4DNA Ligase進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒pET-28a::bgl。經(jīng)菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證(BamHⅠ和XhoⅠ)正確后，送往金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

表1 β-葡萄糖苷酶bglA和bglB基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers of β-glucosidase gene

1.2.4 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及培養(yǎng) 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-28a::bglA、pET-28a::bglB及pET-28a::bgl轉(zhuǎn)化至大腸桿菌C41感受態(tài)細(xì)胞中，在含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后，篩選陽(yáng)性克隆[7]。

1.2.5 β-葡萄糖苷酶的誘導(dǎo)表達(dá) 將篩選出的重組菌菌落接種到3 mL含卡那霉素的LB中，37 ℃ 220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按1∶100加入到100 mL 2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2.5 h，加入IPTG到終濃度1 mmol/L，28 ℃低溫誘導(dǎo)14 h。將菌液用Loading buffer洗滌兩次后，超聲破碎細(xì)胞：功率292.5 W，每超聲5 s間隔5 s，至菌液澄清后4 ℃ 8000 r/min離心30 min收集上清液，用GE公司的Ni-NTA柱進(jìn)行蛋白純化[8]。以誘導(dǎo)前的重組菌株為對(duì)照進(jìn)行SDS-PAGE電泳[9]，分析重組蛋白表達(dá)情況。

1.2.6 重組β-葡萄糖苷酶的定量分析和酶活力的測(cè)定 通過(guò)BCA試劑盒繪制562 nm下的蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，并測(cè)定樣品的OD562 nm值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的總蛋白濃度。

通過(guò)DNS法測(cè)定β-葡萄糖苷酶酶活[10-11]。酶活定義：每分鐘內(nèi)分解底物生成1 μg葡萄糖所需酶量定義為1個(gè)酶活單位，以U/mL表示。試驗(yàn)組取0.5 mL粗酶液(BglA為110 mg蛋白)與1 mL 1%水楊苷檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 4.8)，于50 ℃保溫60 min后，加入1.5 mL DNS煮沸10 min，定容至25 mL，測(cè)定OD540 nm。同時(shí)取粗酶液煮沸滅活測(cè)OD540 nm作為對(duì)照組，平行試驗(yàn)重復(fù)3次，樣品酶活值為試驗(yàn)組酶活值與對(duì)照組酶活值之差，并使用SPSS(Statistical Package for the Social Sciences, version 13.0 for Windows; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)軟件進(jìn)行顯著性差異分析。

通過(guò)LB-CMC培養(yǎng)基進(jìn)行剛果紅染色，并根據(jù)水解圈的大小判斷β-葡萄糖苷酶的水解活性[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1bglA和bglB克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)PCR方法克隆得到了多粘類芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB基因，測(cè)序結(jié)果表明bglA和bglB大小分別為1361和1358 bp，所得bglA基因序列與多粘類芽孢桿菌的bglA基因(GenBank登錄號(hào)M60210.1)序列比對(duì)同源性為99%，bglB基因序列與多粘類芽孢桿菌的bglB基因(GenBank 登錄號(hào)M60211.1)序列比對(duì)同源性為99%。將bglA、bglB分別連接pET-28a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a::bglA和pET-28a::bglB經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切驗(yàn)證無(wú)誤后分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌C41，質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證圖譜如圖1D，該結(jié)果說(shuō)明重組質(zhì)粒pET-28a::bglA和pET-28a::bglB已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌C41中。將得到的大腸桿菌重組菌株分別命名為EA(pET-28a::bglA)和EB(pET-28a::bglB)。

圖1 重組質(zhì)粒圖譜及β-葡萄糖苷酶基因的雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Plasmids map and β-glucosidase gene recombinant plasmid digested from Bacillus polymyxa A：pET-28a::bglA重組質(zhì)粒圖譜Plasmid map of pET-28a::bglA；B：pET-28a::bglB重組質(zhì)粒圖譜Plasmid map of pET-28a::bglB；C：pET-28a::bgl重組質(zhì)粒圖譜Plasmid map of pET-28a:: bgl；D：β-葡萄糖苷酶基因的雙酶切驗(yàn)證β-glucosidase gene recombinant plasmid digested；M：DNA marker；1：pET-28a::bglA重組質(zhì)粒雙酶切(BamHⅠ和XhoⅠ)pET-28a::bglA digested by BamHⅠand XhoⅠ；2：pET-28a::bglB重組質(zhì)粒雙酶切(BamHⅠ和XhoⅠ) pET-28a::bglB digested by BamHⅠand XhoⅠ；3：pET-28a；4：pBluescriptⅡKS(+)；5：pBluescriptⅡKS(+)::bgl重組質(zhì)粒雙酶切(SmaⅠ和BamHⅠ)pBluescriptⅡKS(+)::bgl digested by SmaⅠand BamHⅠ；6：pET-28a::bgl重組質(zhì)粒雙酶切(BamHⅠ和XhoⅠ)pET-28a::bgl digested by BamHⅠand XhoⅠ.

2.2bgl克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

利用PCR獲得bglA、bglB基因片段，酶切連接到pBluescript ⅡKS(+)獲得重組質(zhì)粒pBluescript ⅡKS(+)::bgl，通過(guò)SmaⅠ和BamHⅠ酶切驗(yàn)證無(wú)誤后(圖1D)，將bgl基因從pBluescript Ⅱ KS(+)::bgl上切下連接pET-28a，獲得重組質(zhì)粒pET-28a::bgl，通過(guò)BamHⅠ和XhoⅠ酶切驗(yàn)證無(wú)誤后(圖1D)轉(zhuǎn)化大腸桿菌C41，挑選陽(yáng)性重組子提取質(zhì)粒，DNA測(cè)序后證明所得片段正確，說(shuō)明共表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a::bgl已成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌C41中。將得到的大腸桿菌共表達(dá)重組菌株命名為EAB(pET-28a::bgl)。

2.3 BglA、BglB及Bgl的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳

將EA、EB、EAB、EA與EB等體積混合的重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，超聲破碎后進(jìn)行純化，得到蛋白BglA、BglB、BglA與BglB等體積混合蛋白及Bgl，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。SDS-PAGE分析表明(圖2)，誘導(dǎo)前無(wú)特異條帶，誘導(dǎo)后出現(xiàn)特異條帶，純化后條帶單一。誘導(dǎo)后的BglA、BglB、BglA與BglB等體積混合的蛋白在50 ku處有明顯的蛋白表達(dá)帶，與文獻(xiàn)中報(bào)道的多粘類芽孢桿菌所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶分子量為50 ku相符[13]，誘導(dǎo)后的Bgl蛋白在100 ku處出現(xiàn)明顯的蛋白表達(dá)帶。根據(jù)蛋白大小可知，BglA與BglB等體積混合蛋白并沒(méi)有形成完整的復(fù)合蛋白，還是以兩個(gè)相等大小的單體存在，而誘導(dǎo)后的共表達(dá)蛋白Bgl在生物體內(nèi)形成了一個(gè)完整的蛋白復(fù)合體。

圖2 SDS-PAGE電泳Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis M：蛋白Marker Protein marker；1：EA誘導(dǎo)前EA before induction；2：EB誘導(dǎo)前EB before induction；3：EA和EB混合表達(dá)誘導(dǎo)前EA and EB cultivation by mixed proportion 1∶1 before induction；4：EAB誘導(dǎo)前EAB before induction； 5：EA誘導(dǎo)后EA after induction； 6：EB誘導(dǎo)后EB after induction； 7：EA和EB混合表達(dá)誘導(dǎo)后EA and EB cultivation by mixed proportion 1∶1 after induction； 8：EAB誘導(dǎo)后EAB after induction； 9：EA純化后 EA after purification；10：EB純化后 EB after purification；11：EA和EB混合表達(dá)純化后EA and EB cultivation by mixed proportion 1∶1 after purification；12：EAB純化后EAB after purification.EA: bglA基因連接pET-28a后轉(zhuǎn)入C41感受態(tài)細(xì)胞的重組菌株Recombination strains of bglA was linked with pET-28a and expressed in Escherichia coli C41；EB: bglB基因連接pET-28a后轉(zhuǎn)入C41感受態(tài)細(xì)胞的重組菌株Recombination strains of bglB was linked with pET-28a and expressed in Escherichia coli C41；EAB: bglA,bglB基因連接pET-28a后轉(zhuǎn)入C41感受態(tài)細(xì)胞的重組菌株Recombination strains of bglA,bglB was linked with pET-28a and expressed in Escherichia coli C41. 下同 The same below.

2.4 DNS法測(cè)定重組β-葡萄糖苷酶酶活

用DNS法測(cè)定重組β-葡萄糖苷酶酶活值見(jiàn)表2。通過(guò)SPSS軟件分別比較Bgl與多粘類芽孢桿菌、BglA、BglB、EA和EB(1∶1)、EA和EB(1∶2)及EA和EB(2∶1)的酶活值。結(jié)果顯示，Bgl與多粘類芽孢桿菌的酶活值差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于BglA、BglB、EA和EB(1∶1)、EA和EB(1∶2)及EA和EB(2∶1)的酶活值(P<0.05)，是由于Bgl的bglA和bglB兩個(gè)亞基形成了完整的復(fù)合蛋白，因此酶活值大大提高；而EA和EB混合表達(dá)的酶活值與單個(gè)表達(dá)的酶活值差異不顯著，是由于EA和EB混合培養(yǎng)時(shí)bglA和bglB兩個(gè)亞基沒(méi)有形成完整的復(fù)合蛋白。

表2 DNS法測(cè)定酶活值Table 2 DNS method for the determination of enzyme activity U/mL

注：* 表示差異顯著(P<0.05)，# 表示差異不顯著(P>0.05)。

Note：* means significant difference (P<0.05). # means no significant difference (P>0.05).

2.5 剛果紅染色

圖3 剛果紅染色水解圈Fig.3 Congo red stain hydrolysis circle 1：EA上清EA supernatant；2：EB上清EB supernatant；3：EA和EB(1∶1)混合上清EA and EB 1∶1 supernatant；4：共表達(dá)上清EAB supernatant；5：EA純化后蛋白EA protein after purification；6：EB純化后蛋白EB protein after purification；7：EA和EB(1∶1)混合表達(dá)純化后蛋白EA and EB 1∶1 protein after purification；8：EA破碎后EA after breaking；9：EB破碎后EB after breaking；10：EA和EB(1∶1)混合表達(dá)破碎后EA and EB 1∶1 after breaking；11：共表達(dá)破碎后EAB after breaking；12：共表達(dá)純化后蛋白EAB protein after purification；13：BglA和BglB(1∶1)BglA and BglB 1∶1；14：多粘類芽孢桿菌B. polymyxa；15：BglA和BglB(2∶1)BglA and BglB 2∶1；16：BglA和BglB(1∶2)BglA and BglB 1∶2.

將樣品按順序加入CMC-Na的LB平板孔中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，經(jīng)剛果紅染色、NaCl溶液脫色后出現(xiàn)水解圈，根據(jù)水解圈直徑的大小即可判斷水解活性的強(qiáng)弱。結(jié)果顯示(圖3)，EA上清、EB上清、EAB上清、EA和EB(1∶1)混合表達(dá)上清沒(méi)有出現(xiàn)水解圈，說(shuō)明在上清中不存在蛋白，不能將蛋白分泌到細(xì)胞外。超聲破碎后樣品的水解圈大于純化后蛋白樣品的水解圈，是因?yàn)槠扑楹蟮鞍缀性S多雜蛋白，而純化后的蛋白只含有單一的蛋白條帶，因此形成的水解圈更小。將BglA和BglB按1∶1，2∶1，1∶2混合后形成的水解圈，差別并不明顯，但將共表達(dá)蛋白Bgl加入到平板孔中，發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)生的水解圈大于混合表達(dá)及單一酶組分所產(chǎn)生的水解圈，說(shuō)明共表達(dá)β-葡萄糖苷酶Bgl的水解活性最強(qiáng)。

3 討論

β-葡萄糖苷酶作為纖維素降解過(guò)程中的一個(gè)重要酶組分，在醫(yī)療、食品、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，特別是隨著近年來(lái)環(huán)境能源等危機(jī)的加重，纖維素作為自然界最廣泛的碳源受到了各國(guó)政府的高度重視。本試驗(yàn)采用多粘類芽孢桿菌為試驗(yàn)材料，克隆表達(dá)了β-葡萄糖苷酶bglA、bglB及bgl基因，希望能夠解決β-葡萄糖苷酶酶活低的問(wèn)題。

本實(shí)驗(yàn)先后將β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl分別連接pET-28a，并在大腸桿菌C41中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)，實(shí)驗(yàn)表明BglA、BglB和Bgl 3個(gè)蛋白都為可溶性的蛋白。將重組菌株EA、EB、EA和EB(1∶1)混合表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)的蛋白條帶差別不大，都在50 ku(BglA蛋白大小)的位置上有蛋白條帶，可能是EA和EB(1∶1)混合表達(dá)在體外不能形成完整的復(fù)合蛋白。

目前，纖維素酶活力的測(cè)定方法缺乏一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，所用的方法與底物各有不同，測(cè)得的酶活差異較大，因此不具有可比性[14]。趙云等[15]從多粘類芽孢桿菌(B.polymyxa1.794)中克隆得到β-葡萄糖苷酶基因bglA，將其構(gòu)建在pET-28a上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，通過(guò)β-對(duì)硝基酚葡萄糖苷(β-pNPG)為底物測(cè)定酶活，重組β-葡萄糖苷酶的酶活為24.7 IU/mL。胡開(kāi)蕾等[16]從嗜熱脫氮土壤芽孢桿菌中克隆得到bglB基因，將該基因連接到pGEX-2TL上并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，通過(guò)β-pNPG為底物測(cè)定酶活，在最適反應(yīng)條件下該酶比活力為0.043 IU/mg。為了更方便的比較酶活，本實(shí)驗(yàn)使用國(guó)內(nèi)較便宜的水楊苷(salicin)作底物，也能準(zhǔn)確地反映β-葡萄糖苷酶的活力[17]。BglA與BglB單一酶組分用DNS法比較酶活時(shí)，BglA的酶活值比BglB的大，Gonzalez等[13]研究表明來(lái)自多粘類芽孢桿菌的bglA基因編碼的β-葡萄糖苷酶相比bglB基因?qū)w維二糖底物的水解作用更強(qiáng)。將EA、EB誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白純化后，其酶活值較低，且水解圈也不明顯，究其原因可能是在IPTG誘導(dǎo)時(shí)蛋白合成速度較快，空間折疊不充分而影響其活性，也可能是與大腸桿菌C41胞內(nèi)成分發(fā)生了協(xié)同作用，研究表明錯(cuò)誤折疊的重組蛋白與其正確折疊的蛋白相比，其酶活顯著下降[18]。而影響其酶活最主要的原因是BglA和BglB沒(méi)有形成復(fù)合蛋白，試驗(yàn)表明，當(dāng)BglA和BglB形成完整的復(fù)合蛋白后才能更好地發(fā)揮水解活性。目前大部分研究是將β-葡萄糖苷酶和其他的酶進(jìn)行共表達(dá)，王遠(yuǎn)等[19]將β-葡萄糖苷酶基因bglA和bglB分別與內(nèi)切葡聚糖酶基因celA在枯草芽孢桿菌WB800中共表達(dá)，共表達(dá)重組菌WB800(pP43JM2-celAbglA)的胞內(nèi)酶液與纖維二糖底物作用釋放出317.4 mg/L的葡萄糖，其胞外酶液和纖維二糖底物反應(yīng)釋放出24 mg/L的葡萄糖；唐自鐘等[20]將β-葡萄糖苷酶基因和內(nèi)切葡聚糖苷酶基因在大腸桿菌BL21(DE3)中共表達(dá)，酶活力可達(dá)1196.8 U/mL。

4 結(jié)論

本研究將β-葡萄糖苷酶兩個(gè)亞基bglA和bglB在大腸桿菌C41中共表達(dá)后，其酶活比單一酶組分及混合表達(dá)的酶活提高了4倍，與原始菌株酶活差別不顯著，這一研究結(jié)果對(duì)纖維素降解及基因的共表達(dá)提供了實(shí)驗(yàn)材料。

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Expression of β-glucosidase genesbglA,bglB, andbglfromBacilluspolymyxainEscherichiacoli

WANG Yan, MA Ya-Ru, WAN Xue-Rui, WANG Chuan*, WU Run*, LIU Gui-Lin, LIU Yuan-Zi, WU Zi-Xiang

CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

To improve the enzyme activity of β-glucosidase, two β-glucosidase genes fromBacilluspolymyxawere introduced separately (bglAandbglB) and together (bgl) into the pET-28a vector and expressed inEscherichiacoliC41. The three recombinant strains were designated as EA, EB, and co-expression EAB. Strains EA and EB were mixed at ratios of 1∶1, 1∶2, and 2∶1 and their total β-glucosidase activity was compared with those of each single enzyme group, the co-expression strain, and mixed expression strains. The results of SDS-PAGE analyses showed that both BglA and BglB were 50 ku, and the size of these proteins in the EA and EB mixed cultures was also 50 ku. The size of Bgl in the co-expression strain EAB was 100 ku. These results indicated that a Bgl complex was able to form in cells, but notinvitro. In an enzyme activity assay, the activity of Bgl from the co-expression strain was not significantly different from that ofbglinB.polymyxa, but it was significantly higher than those of BglA in EA and BglB in EB (P<0.05). The results of Congo red staining also showed that the enzyme activity of Bgl was significantly higher than those of BglA and BglB. This study lays the foundation for the construction of artificial assemblies, and for the integration of biological technologies in cellulose processing.

β-glucosidase;Bacilluspolymyxa; clone and expression; coexpression; enzyme activity

10.11686/cyxb2016220

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-05-27；改回日期：2016-07-06

甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(1204NKCA103)和國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31500067)資助。

王艷(1991-)，女，甘肅嘉峪關(guān)人，在讀碩士。E-mail：409193838@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail：wurun@gsau.edu.cn，wclwhy@163.com

王艷, 馬亞茹, 萬(wàn)學(xué)瑞, 王川, 吳潤(rùn), 劉桂林, 劉原子, 吳自祥. 多粘類芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl基因在大腸桿菌中的表達(dá). 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(5): 189-196.

WANG Yan, MA Ya-Ru, WAN Xue-Rui, WANG Chuan, WU Run, LIU Gui-Lin, LIU Yuan-Zi, WU Zi-Xiang. Expression of β-glucosidase genesbglA,bglB, andbglfromBacilluspolymyxainEscherichiacoli. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(5): 189-196.