無(wú)機(jī)鹽對(duì)甘草愈傷組織生長(zhǎng)及總黃酮含量的影響

柳福智，楊秀艷

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

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無(wú)機(jī)鹽對(duì)甘草愈傷組織生長(zhǎng)及總黃酮含量的影響

柳福智*，楊秀艷

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

本研究以甘草無(wú)菌苗的下胚軸為供試材料,以MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.4 mg/L+agar 8 g/L+sugar 30 g/L為基本培養(yǎng)基，利用組織培養(yǎng)技術(shù)并結(jié)合紫外分光光度法探究了MS培養(yǎng)基中5種不同無(wú)機(jī)鹽濃度及各種成分之間的交互作用對(duì)甘草愈傷組織增長(zhǎng)量、生理指標(biāo)及次生代謝產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明，適量增加KNO3和MnSO4·4H2O的含量有利于甘草愈傷組織生物量的積累；隨著MS培養(yǎng)基中CaCl2·2H2O濃度的增加，有利于可溶性糖和總黃酮含量的積累；濃度為2533 mg/L KNO3最有利于提高POD活性；KH2PO4濃度在170～226 mg/L范圍內(nèi)，愈傷組織生長(zhǎng)量和總黃酮含量顯著提高；MS培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O有利于甘草愈傷組織的生長(zhǎng)及總黃酮的合成。而愈傷組織的生長(zhǎng)狀況與總黃酮的合成是多種無(wú)機(jī)鹽離子之間交互作用的結(jié)果，通過(guò)正交試驗(yàn)及極差分析得出最優(yōu)營(yíng)養(yǎng)元素組合為MgSO4·7H2O 493 mg/L+MnSO4·4H2O 7 mg/L+KNO32533 mg/L+KH2PO4170 mg/L+CaCl2·2H2O 733 mg/L。

甘草；愈傷組織；無(wú)機(jī)鹽；次生代謝

甘草(Glycyrrhizauralensis)為豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza)多年生、耐旱、耐鹽堿的深根性草本植物[1-2]，廣泛分布于北緯45°的干旱半干旱地區(qū)。以根和根莖入藥，具有補(bǔ)脾益氣、止咳祛痰、抗?jié)儭⒖寡趸?、抗癌、保肝等功效，素有“十方九草，無(wú)草不成方”之說(shuō)[3-7]。甘草除藥用外，也作為食品、飲料、飼料、卷煙和化妝品行業(yè)用；也是荒漠或半荒漠地區(qū)重要防風(fēng)固沙、改良土壤的植物，具有生態(tài)和經(jīng)濟(jì)雙重價(jià)值[8]。近年來(lái)，隨著全世界對(duì)甘草需求量的劇增，野生資源破壞嚴(yán)重，造成土地沙化面積增加，草場(chǎng)質(zhì)量惡變，生態(tài)環(huán)境極其脆弱，甘草遂成為干旱半干旱地區(qū)亟待保護(hù)的植物資源。

目前，甘草培育以野生馴化和農(nóng)家種植為主，栽培年限長(zhǎng)達(dá)3年多，栽培甘草與野生甘草的各項(xiàng)光合特性指標(biāo)均較接近，受強(qiáng)光的抑制作用不明顯，才可有較強(qiáng)的光合作用[9]，而且在生產(chǎn)中存在種子硬實(shí)嚴(yán)重、成苗率低、生長(zhǎng)早期植株弱小、蟲(chóng)草害嚴(yán)重、自然栽培采收種子晚(至少栽培4年才能采收種子)、地下根莖進(jìn)行無(wú)性繁殖系數(shù)低等問(wèn)題，極大地限制了甘草的大面積推廣應(yīng)用和育種工作的開(kāi)展[10]。因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)甘草進(jìn)行無(wú)性快繁，加快甘草次生代謝活性物質(zhì)的提取已迫在眉睫。有關(guān)甘草組織培養(yǎng)多為愈傷組織誘導(dǎo)與分化方面的研究較多[11-15]，而培養(yǎng)基類型及其中營(yíng)養(yǎng)元素的濃度及培養(yǎng)條件對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物含量的積累有很大影響。研究表明[16-18]，在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的酵母提取物、水解酪蛋白、真菌誘導(dǎo)子、茉莉酸、稀土元素、碳源和氮源等可以有效地提高甘草愈傷組織中黃酮類化合物的合成；李琰等[19]研究了杜仲(Eucommiaulmoides)愈傷組織中不同次生代謝產(chǎn)物的積累對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素有最適要求，可見(jiàn)不同的植物或同種植物生物量的積累及次生代謝產(chǎn)物的大量合成對(duì)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度有要求差異。有研究表明，不同濃度的氮源對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)有顯著的影響[20]，不同的碳源對(duì)愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的合成不一致，適宜的外源硅濃度對(duì)鹽脅迫下甘草幼苗的生長(zhǎng)有一定的緩解作用[21]，若培養(yǎng)基中銨鹽濃度過(guò)大會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)[22]。即營(yíng)養(yǎng)元素種類及濃度在細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生代謝過(guò)程中有著重要的作用，而且細(xì)胞的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的合成是多種營(yíng)養(yǎng)元素共同作用的結(jié)果，黃亞萍等[23]只從植物水平研究了氮磷鉀配施對(duì)甘草育苗質(zhì)量的影響，但有關(guān)MS培養(yǎng)基(Murashige and Skoog)中不同無(wú)機(jī)鹽的濃度對(duì)甘草愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物影響的研究國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以甘草無(wú)菌苗的下胚軸為外植體材料，通過(guò)研究MS培養(yǎng)基中5種不同濃度的無(wú)機(jī)鹽對(duì)甘草愈傷組織的生物積累量、POD活性、可溶性糖及總黃酮含量等因素的影響，來(lái)探究營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)甘草愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響；通過(guò)優(yōu)化5種無(wú)機(jī)鹽濃度水平及多因素多水平正交試驗(yàn)，確立最優(yōu)的營(yíng)養(yǎng)元素培養(yǎng)組合，以期提高甘草愈傷組織生長(zhǎng)率及次生代謝產(chǎn)物含量，通過(guò)快速繁殖來(lái)緩解甘草市場(chǎng)需求，對(duì)保護(hù)甘草資源提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)處理

1.1.1 試驗(yàn)時(shí)間 本試驗(yàn)始于2014年12月25日，終于2015年12月25日。

1.1.2 試驗(yàn)材料 以甘草種子無(wú)菌苗的下胚軸為供試材料。

1.1.3 無(wú)菌材料的獲得 挑選優(yōu)質(zhì)的甘草種子，用98%濃硫酸處理30～40 min[24]，無(wú)菌水沖洗3～5次，75%乙醇浸泡1 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，0.1%升汞消毒8 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，用無(wú)菌濾紙吸取種子表面的水分。于超凈工作臺(tái)上將處理過(guò)的甘草種子接種到經(jīng)滅菌、不含任何激素的MS培養(yǎng)基中[25]。每瓶接入6粒無(wú)菌甘草種子，置培養(yǎng)架上，在溫度為(25±1) ℃、光照時(shí)間為12～16 h/d、濕度為50%～70%的培養(yǎng)室條件下，使三角瓶中的種子發(fā)芽，生長(zhǎng)15 d左右可獲得甘草無(wú)菌苗。

1.1.4 愈傷組織的誘導(dǎo) 將已培養(yǎng)了15 d左右的無(wú)菌苗下胚軸作為外植體，切成0.3 cm左右的小段，在無(wú)菌條件下接種于已優(yōu)化的MS+6-BA(6-芐氨基嘌呤)0.5 mg/L+2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)0.5 mg/L+NAA(萘乙酸)0.5 mg/L+KT(6-糠氨基嘌呤)0.4 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(pH=5.8)，暗培養(yǎng)4 d后，開(kāi)始光照培養(yǎng)20 d可誘導(dǎo)出甘草愈傷組織。

1.1.5 愈傷組織的生長(zhǎng) 篩選質(zhì)地疏松、生長(zhǎng)旺盛的甘草愈傷組織，在無(wú)菌條件下切成大小0.3 cm的愈傷組織小塊，經(jīng)MS+6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.4 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L進(jìn)行繼代增值培養(yǎng)后，用作供試材料。試驗(yàn)以添加6-BA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+KT 0.4 mg/L+瓊脂8 g/L+蔗糖30 g/L為基礎(chǔ)，將MS培養(yǎng)基中的KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O 5種無(wú)機(jī)鹽設(shè)計(jì)成濃度梯度。單因素試驗(yàn)以MS[n/3MS(KNO3)]，n=1, 2, 3, 4, 5。其他MS培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)元素的濃度均不變，無(wú)機(jī)鹽濃度單位是mg/L，上述同樣的方法對(duì)其他5種無(wú)機(jī)鹽分別進(jìn)行試驗(yàn)，即 KNO3的考察濃度為：633，1266，1900，2533，3166；KH2PO4的考察濃度為：56，113，170，226，283；CaCl2·2H2O的考察濃度為：146，293，440， 586，733；MgSO4·7H2O的考察濃度為：123，246，370，493，616；MnSO4·4H2O的考察濃度為：7，14， 22，29，37。試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接入4塊大小相近的愈傷組織，接種的愈傷組織鮮重控制在0.10～0.20 g之間。愈傷組織生長(zhǎng)條件與無(wú)菌苗獲得條件相同。經(jīng)25 d后，計(jì)算5個(gè)處理的增長(zhǎng)量(g/flask)、可溶性糖含量(%)、總黃酮含量(%)、POD活性[U/(g·min)]，優(yōu)化培養(yǎng)基，進(jìn)行多因素多水平的正交試驗(yàn)，找到最優(yōu)營(yíng)養(yǎng)元素組合。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 增長(zhǎng)量的計(jì)算 將培養(yǎng) 25 d的愈傷組織分別取出 (不同無(wú)機(jī)鹽及同一無(wú)機(jī)鹽不同濃度培養(yǎng)的愈傷組織每批取樣 20個(gè)),用濾紙將其表面附著的培養(yǎng)基吸去，置于萬(wàn)分之一的分析天平上進(jìn)行稱重，然后取其平均值即得組織的鮮重。將稱過(guò)鮮重的組織，置于烘箱中，首先在 105 ℃下烘 30 min，使其酶系滅活；再在 60 ℃下烘 3～4 h，使其干燥至恒重。算其相應(yīng)處理的增長(zhǎng)量，愈傷組織增長(zhǎng)量=收獲量/瓶-接種量/瓶。

1.2.2 可溶性糖含量的測(cè)定 甘草愈傷組織中的可溶性糖主要是指溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖，可利用沸水浴提取和苯酚法測(cè)定其含量[26]。公式如下：

可溶性糖含量(%)=(CVT/106WVs)×100

式中：C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖量(μg)；VT為樣品提取液總體積(mL)；Vs為顯色時(shí)取樣品液量(mL)；W為樣品重(g)。

1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 精密稱取已研磨的甘草愈傷組織0.200 g，以75%乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶50，浸泡樣品30 min后超聲提取40 min，過(guò)濾。濾渣以1∶30料液比超聲提取30 min，過(guò)濾。合并2次的濾液，用75%乙醇定容至25 mL。精密吸取提取液5 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以不加提取液而加其他相應(yīng)試劑為空白，在500 nm處測(cè)吸光度，平行測(cè)定3次。公式如下：

P={[(A+0.00193)×5×V]/0.01075×m×106}×100%

式中：P為總黃酮含量；A為吸光度值；5為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積(mL)；m為愈傷組織的干重(g)。

1.2.4 過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定 精密稱取2 g新鮮甘草愈傷組織，剪碎置于研缽中，然后加5 mL 0.1 mol/L Tris-HCl(pH=8.5)緩沖液,冰浴研磨，以4000 r/min離心15 min，取上清液，殘?jiān)捎? mL緩沖液提取一次，合并兩次上清液,置冷處備用。過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定按愈創(chuàng)木酚氧化法，反應(yīng)液用紫外分光光度法于波長(zhǎng)470 nm比色測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)處理的不同濃度每次測(cè)定重復(fù)3次，用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性(P<0.05)、極顯著(P<0.01)及標(biāo)準(zhǔn)差分析，使用Excel 2007軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 KNO3濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響

MS培養(yǎng)基中KNO3的濃度范圍在633～3166 mg/L內(nèi)，甘草愈傷組織的生長(zhǎng)受到了促進(jìn)，愈傷組織鮮重隨KNO3濃度的增加而極顯著性增加，因KNO3各個(gè)濃度愈傷組織鮮重含水量不同，在633～1266 mg/L和2533～3166 mg/L范圍內(nèi)干重增長(zhǎng)差異不明顯(表1)?？傸S酮含量隨KNO3濃度的增加而明顯下降，可溶性糖含量和POD活性的最適濃度分別為1900和2533 mg/L，最高含量分別為(0.7866±0.004)%和(56.5543±0.358) U/(g·min) (表1)。不同濃度KNO3的愈傷組織生長(zhǎng)狀況與次生代謝產(chǎn)物含量不呈正相關(guān)，這說(shuō)明愈傷組織生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的積累對(duì)無(wú)機(jī)鹽濃度的要求不同(表1)。

表1 不同濃度KNO3對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物含量的影響Table 1 Effects of different concentrations of KNO3 on callus growth and secondary metabolites

注：數(shù)值用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同列標(biāo)有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

Notes:Values are Means±standard deviation, followed by different lowercase letters within column differ significantly (P<0.05); followed by different uppercase letters within column differ significantly (P<0.01), the same below.

2.2 KH2PO4濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響

KH2PO4在56～283 mg/L的范圍內(nèi)愈傷組織的增長(zhǎng)量極顯著的呈先上升后下降的趨勢(shì)，但以MS培養(yǎng)基中 KH2PO4的原濃度170 mg/L生長(zhǎng)最適(表2)；而總黃酮和可溶性糖含量隨著處理濃度的增加而極顯著升高，在濃度達(dá)到226 mg/L時(shí)含量達(dá)最大(表2)。POD是活性較高的一種與呼吸作用、光合作用及生長(zhǎng)素的氧化等有關(guān)的酶，在170～226 mg/L的濃度內(nèi)含量相對(duì)較高，這也表明在這個(gè)濃度范圍內(nèi)愈傷組織易老化，顏色翠綠且質(zhì)地硬，這是因?yàn)镻OD能使組織中所含碳水化合物轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，即POD的活性可作為組織老化的一種生理指標(biāo)(表2)。

表2 不同濃度KH2PO4對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物含量的影響Table 2 Effects of different concentrations of KH2PO4 on callus growth and secondary metabolites

2.3 MgSO4·7H2O濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響

在123～370 mg/L范圍內(nèi)，隨MgSO4·7H2O濃度的變大，甘草愈傷組織生長(zhǎng)受到極顯著的促進(jìn)作用(P<0.01)(表3)，說(shuō)明濃度低于370 mg/L的MgSO4·7H2O不會(huì)對(duì)愈傷組織有脅迫作用，濃度在370～493 mg/L范圍時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)最好，但MS培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O原濃度有利于黃酮和可溶性糖含量的積累，增加或減少M(fèi)S培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O的濃度都極顯著地抑制了總黃酮和可溶性糖的形成，最高含量分別為(0.3530±0.009)% 和(0.8135±0.008)%；POD的活性在246～493 mg/L內(nèi)差異較小。

2.4 CaCl2·2H2O濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響

在146～733 mg/L范圍內(nèi)，增加CaCl2·2H2O的濃度，明顯地抑制了愈傷組織的增長(zhǎng)量，生長(zhǎng)狀況下降，但總黃酮含量和可溶性糖含量變化明顯且在試驗(yàn)最大濃度733 mg/L時(shí)兩種產(chǎn)物含量最高；而相同外植體愈傷組織的POD活性隨 CaCl2·2H2O濃度水平的變動(dòng)格局存在差異，在培養(yǎng)基原濃度時(shí)POD活性最強(qiáng)(表4)。

2.5 MnSO4·4H2O濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響

MnSO4·4H2O是MS培養(yǎng)基中為甘草愈傷組織提供微量元素的無(wú)機(jī)鹽，當(dāng)濃度小于29 mg/L，愈傷組織的生物積累量極顯著的呈先減小后增加的趨勢(shì)，超過(guò)29 mg/L時(shí)，破壞了養(yǎng)分平衡，愈傷組織生長(zhǎng)不明顯，而MnSO4·4H2O的濃度大于7 mg/L會(huì)極顯著脅迫甘草愈傷組織中可溶性糖的合成，在試驗(yàn)濃度內(nèi)POD活性和總黃酮含量差異極顯著，而在培養(yǎng)基原濃度22 mg/L時(shí)含量積累最高(表5)。

表3 不同濃度MgSO4·7H2O對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物含量的影響Table 3 Effects of different concentrations of MgSO4·7H2O on callus growth and secondary metabolites

表5 不同濃度MnSO4·4H2O對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物含量的影響Table 5 Effects of different concentrations of MnSO4·4H2O on callus growth and secondary metabolites

2.6 不同營(yíng)養(yǎng)元素優(yōu)化組合對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響

經(jīng)過(guò)優(yōu)選的5種無(wú)機(jī)鹽濃度3個(gè)水平的正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各個(gè)優(yōu)化組合對(duì)甘草愈傷組織的生物量的積累及次生代謝產(chǎn)物的大量合成影響格局較大(表6、7)。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多指標(biāo)的極差分析，5種無(wú)機(jī)鹽離子對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)狀況和所測(cè)次生代謝產(chǎn)物的積累影響力的大小依次為：MgSO4·7H2O>MnSO4· 4H2O>KNO3>KH2PO4>CaCl2·2H2O，最好的培養(yǎng)組合為C3E1A2B2D3，即在MgSO4·7 H2O 493 mg/L、MnSO4· 4H2O 7 mg/L、KNO32533 mg/L、KH2PO4170 mg/L、CaCl2·2H2O 733 mg/L?？梢?jiàn)鎂元素是影響高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的甘草次生代謝產(chǎn)物的主因素，葉綠素的形成需要鎂，鎂是葉綠素的中心金屬元素，愈傷組織細(xì)胞中鎂含量的高低直接影響細(xì)胞對(duì)CO2的同化能力，進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的合成(表8)。

表6 因素水平 Table 6 Factors and levels mg/L

A: KNO3濃度 Concentration; B: KH2PO4濃度Concentration; C: MgSO4·7H2O 濃度Concentration; D: CaCl2·2H2O 濃度Concentration; E: MnSO4·4H2O 濃度Concentration.下同The same below.

表7 不同營(yíng)養(yǎng)元素優(yōu)化組合對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的影響Table 7 Effects of different medium component optimization on callus growth and secondary metabolites

表8 不同營(yíng)養(yǎng)元素優(yōu)化組合 Table 8 Different medium component optimization

注：表8中的試驗(yàn)序列號(hào)和表7的試驗(yàn)序列號(hào)一樣，代表每一個(gè)試驗(yàn)處理。其中，k1、k2、k3分別代表的是各個(gè)營(yíng)養(yǎng)元素優(yōu)選濃度水平為1、2和3下5個(gè)測(cè)量指標(biāo)的總和，R代表的k1、k2和k3之間的極差，這是綜合考察的方法。

Note: The test sequence numbers in Table 8 are the same as the numbers in Table 7, and represent each test treatment. Where k1, k2, k3 represent respectively the sum of the five measurement indices at the preferred concentration levels 1, 2 and 3 of each nutrient element, and R represents the difference between k1, k2 and k3, which is a comprehensive survey method.

3 討論

培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)元素是愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)及初生代謝過(guò)程中化合物合成的物質(zhì)基礎(chǔ)，但植物種類的不同適合的培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度也不同[27]。對(duì)愈傷組織而言，較高濃度的無(wú)機(jī)鹽有利于愈傷組織的生長(zhǎng)，較低濃度的鹽反而有利于次生代謝產(chǎn)物的大量合成[28]。因有此濃度效應(yīng)，所以增殖細(xì)胞數(shù)量及獲得次生代謝產(chǎn)物應(yīng)選用不同濃度的培養(yǎng)基以滿足所需。本試驗(yàn)研究了MS培養(yǎng)基中的KNO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O五種無(wú)機(jī)鹽的不同濃度對(duì)甘草愈傷組織的生物積累量、POD活性、可溶性糖含量和總黃酮合成的影響。結(jié)果表明，在試驗(yàn)范圍內(nèi)增加培養(yǎng)基中KNO3和MnSO4·4H2O的含量有利于甘草愈傷組織細(xì)胞生物量的積累，而增加CaCl2·2H2O的濃度反而使愈傷組織生長(zhǎng)狀況下降，培養(yǎng)基中KH2PO4和MgSO4·7H2O的原濃度均有利于愈傷組織生長(zhǎng)，黃酮的最佳積累濃度1/3MS(KNO3)、4/3MS(KH2PO4)、3/3MS(MnSO4·4H2O、MgSO4·7H2O)、5/3MS(CaCl2·2H2O)；無(wú)機(jī)鹽濃度為3/3MS(KNO3、MgSO4·7H2O)、5/3MS(CaCl2·2H2O)、4/3MS(KH2PO4)、1/3MS(MnSO4·4H2O)時(shí)愈傷組織中的可溶性糖含量最高；MS培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽原濃度對(duì)POD的合成較適宜。用統(tǒng)計(jì)分析的方法對(duì)培養(yǎng)基中5種無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行水平篩選，通過(guò)優(yōu)化的5種無(wú)機(jī)鹽3個(gè)水平的正交試驗(yàn)和極差分析，探明了各種無(wú)機(jī)鹽成分對(duì)愈傷組織生物量積累與次生代謝產(chǎn)物合成的交互作用，得到了最優(yōu)培養(yǎng)基是C3E1A2B2D3。為進(jìn)一步穩(wěn)定甘草愈傷組織有效生長(zhǎng)速率和有效成分的大量合成，建立了穩(wěn)定、高產(chǎn)的甘草愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)體系。

綜上所述，MS培養(yǎng)基中不同濃度的無(wú)機(jī)鹽對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)狀況與次生代謝產(chǎn)物含量無(wú)相關(guān)性，而且不同的次生代謝產(chǎn)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的種類、數(shù)量和比例有不同的要求。這也證實(shí)了愈傷組織生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的形成對(duì)培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽濃度要求差異很大。造成這種格局主要因?yàn)椋?)細(xì)胞的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物的合成需要營(yíng)養(yǎng)元素的參與，不同濃度的營(yíng)養(yǎng)元素會(huì)影響培養(yǎng)基的滲透勢(shì)，過(guò)高的滲透勢(shì)使細(xì)胞失水，造成生理干旱，影響細(xì)胞的正常代謝，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢[29]。在高鹽的培養(yǎng)基中，細(xì)胞為了平衡滲透脅迫，體內(nèi)會(huì)大量積累可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，使細(xì)胞保持較低的滲透勢(shì)，提高了愈傷組織的滲透調(diào)節(jié)能力，可改善水分關(guān)系[30]；細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，破壞細(xì)胞膜、使生物大分子變性、許多代謝酶失活，進(jìn)而使細(xì)胞的新陳代謝紊亂，但是細(xì)胞自身抗氧化系統(tǒng)中的過(guò)氧化物酶，它是一種保護(hù)劑，可以清除活性氧自由基，提高愈傷組織的抗逆性，而且黃酮類物質(zhì)也可以提高細(xì)胞的抗氧化能力[31-32]。2)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素的吸收情況與愈傷組織吸收養(yǎng)分基因型的差異、細(xì)胞膜系統(tǒng)的離子交換量、酶活性、植物激素和植物毒素等有關(guān)，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)代謝活動(dòng)的需要而進(jìn)行選擇性吸收。植物體內(nèi)的硝酸還原酶的活性強(qiáng)烈影響植物對(duì)硝酸鹽的吸收與利用，而植物體內(nèi)酶的合成受某些基因的調(diào)控，進(jìn)而影響了甘草愈傷組織細(xì)胞的生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物合成中一些關(guān)鍵酶的合成[33]。營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)細(xì)胞內(nèi)某些化合物的生物合成有調(diào)控作用，馬生軍等[34]以一年生甘草移栽苗為供試材料，研究表明適量濃度的錳對(duì)甘草SQS1(鯊烯合成酶1)基因的表達(dá)和甘草酸的積累具有一定的促進(jìn)作用。所以植物對(duì)養(yǎng)分的吸收與積累動(dòng)態(tài)主要受控于植物本身的遺傳特性，但對(duì)植物營(yíng)養(yǎng)基因的研究正處于方興未艾的時(shí)刻，目前關(guān)于一個(gè)基因控制某種元素的吸收與利用的研究已被一些植物營(yíng)養(yǎng)和遺傳學(xué)者所關(guān)注。

References：

[1] Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China[S]. Beijing: Chemical Industry Press, 2015: 59-63. 藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[S]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2015: 59-63.

[2] Li X B, Chen L, Li G Q,etal. Ecological distribution and propagative technique research ofGlycyrrhizauralensisresources in China. Journal of Ecological Environment, 2013, 22(4): 718-722. 李學(xué)斌, 陳林, 李國(guó)旗, 等. 中國(guó)甘草資源的生態(tài)分布及其繁殖技術(shù)研究. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2013, 22(4): 718-722.

[3] Liang B, Yang A F, Huang F L,etal. Research advances on chemical constituents and pharmacological activities inGlycyrrhiza. Journal of Northeast Agricultural University, 2006, 37(1): 115-119. 梁冰, 楊愛(ài)馥, 黃鳳蘭, 等. 甘草屬(Glycyrrhiza)化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 37(1): 115-119.

[4] Sun Y, Ai Y N R, Yan X H,etal. Research progress on the extraction methods and pharmacological effects of flavonoids from licorice. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine, 2009, 27(1): 72-75. 孫蕓, 阿依努爾·吾買爾, 燕雪花, 等. 甘草黃酮的提取方法及藥理作用研究進(jìn)展. 新疆中醫(yī)藥, 2009, 27(1): 72-75.

[5] Gao X Y, Wang W Q, Wei S L,etal. Review of pharmacological effects ofGlycyrrhizaradixand its bioactive compounds. Chinese Journal of traditional Chinese Medicine, 2009, 34(21): 2695-2700. 高雪巖, 王文全, 魏勝利, 等. 甘草及其活性成分的藥理活性研究進(jìn)展. 中國(guó)中藥雜志, 2009, 34(21): 2695-2700.

[6] Zhang B, Guan Y P, Tian Q L,etal. Advances in the study on the chemical constituents of flavonoids in Ural. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2006, 28(9): 1362-1365. 張波, 官月平, 田慶來(lái), 等. 烏拉爾甘草中黃酮類化學(xué)成分的研究進(jìn)展. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2006, 28(9): 1362-1365.

[7] Chen H. An overview of the pharmacological effects of licorice. Strait Pharmaceutical Journal, 2005, 17(4): 37-41. 陳紅. 甘草藥理作用概述. 海峽藥學(xué), 2005, 17(4): 37-41.

[8] Wang Z L, Du J C, Yu L Q,etal. Utilization value, research status and existing problems of licorice. Grassland in China, 2002, 24(1): 73-76. 王照蘭, 杜建材, 于林清, 等. 甘草的利用價(jià)值、研究現(xiàn)狀及存在問(wèn)題. 中國(guó)草地, 2002, 24(1): 73-76.

[9] Zhao Z H, Cao J G, Wang W J,etal. Comparative study on the photosynthetic characteristics between the cultivatedGlycyrrhizauralensiswith different age limits and the wildG.uralensis. Acta Prataculturae Sinica, 2005, 14(3): 111-116. 趙則海, 曹建國(guó), 王文杰, 等. 不同生長(zhǎng)年限栽培甘草與野生甘草光合特性對(duì)比研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2005, 14(3): 111-116.

[10] Li M, Jiang Q, Zhang Q Y,etal. Study on the artificial cultivation technology of the arid zone in the middle of Ningxia Province. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2005, 21(1): 144-148. 李明, 蔣齊, 張青云, 等. 寧夏中部干旱帶甘草人工種植技術(shù)研究. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2005, 21(1): 144-148.

[11] Liu X, Wang Q, Yu B. Effects of different hormone combinations on callus induction and browning ofGlycyrrhizainflateBata. Journal of Gansu Agricultural University, 2010, 45(6): 88-93. 劉昕, 王清, 余斌. 不同外源激素對(duì)脹果甘草愈傷組織誘導(dǎo)及褐化的影響. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 45(6): 88-93.

[12] Hu H Y, Wu X L, Liang X H. Induced cultivation ofGlycyrrhizainflataBatal callus. Pharmaceutical Biotechnology, 2004, 11(3): 170-172. 胡海英, 吳曉玲, 梁新華. 脹果甘草愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng). 藥物生物技術(shù), 2004, 11(3): 170-172.

[13] Lei C, Li P. Study on embryogenic callus induction ofGlycyrrhizainflateBat. Academic Journal of Second Military Medical University, 2010, 31(8): 909-911. 雷呈, 李斐. 脹果甘草胚性愈傷組織的誘導(dǎo)研究. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 31(8): 909-911.

[14] Ge S J, Li G M, Ma Z Y,etal. Establishment of micropropagation system ofGlycyrrhizauralensis. Acta Prataculturae Sinica, 2007, 16(6): 107-112. 葛淑俊, 李廣敏, 馬峙英, 等. 烏拉爾甘草組培再生體系的研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2007, 16(6): 107-112.

[15] Ma W F, Huang H Y, Wang Q. Effect of exogenous hormone on callus induction and chromosome doubling ofGlycyrrhizauralensis. Acta Prataculturae Sinica, 2008, 17(3): 142-145. 馬文芳, 黃惠英, 王清. 外源激素對(duì)甘草愈傷組織誘導(dǎo)及染色體加倍的影響(簡(jiǎn)報(bào)). 草業(yè)學(xué)報(bào), 2008, 17(3): 142-145.

[16] Yang S H, Liu X F, Guo D A,etal. Effects of medium and culture conditions on callus growth and flavonoids synthesis in licorice. Journal of Jilin Agricultural University, 2005, 27(3): 289-292. 楊世海, 劉曉峰, 果德安, 等. 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)甘草愈傷組織生長(zhǎng)和黃酮類化合物合成的影響. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 27(3): 289-292.

[17] Yang S H, Tao J, Liu X F,etal. Effects of carbon source and nitrogen source on callus growth and flavonoid content inGlycyrrhizauralensis. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2006, 31(22): 1857-1859. 楊世海, 陶靜, 劉曉峰, 等. 培養(yǎng)基中碳源和氮源對(duì)甘草愈傷組織生長(zhǎng)和黃酮類化合物合成的影響. 中國(guó)中藥雜志, 2006, 31(22): 1857-1859.

[18] Yang S H, Liu X F, Guo D A,etal. Effects of different additives on the formation of flavonoids inGlycyrrhizauralensiscallus. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2006, 41(2): 96-99. 楊世海, 劉曉峰, 果德安, 等. 不同附加物對(duì)甘草愈傷組織培養(yǎng)中黃酮類化合物形成的影響. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2006, 41(2): 96-99.

[19] Li Y, Zhang C H, Ma X H. Effect of medium composition on the growth and secondary metabolites of callus. Journal of Wuhan Botanical Research, 2004, 22(4): 359-363. 李琰, 張朝紅, 馬希漢. 培養(yǎng)基成分對(duì)杜仲愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝產(chǎn)物含量的影響. 武漢植物學(xué)研究, 2004, 22(4): 359-363.

[20] Kim S H, Kim S K. Effect of nitrogen source on cell growth and anthocyanin production in callus and cell suspension culture of ‘Sheridan’ grapes. Journal of Plant Biotechnology, 2002, 4(2): 83.

[21] Cui J J, Zhang X H, Li Y T,etal. Effects of exogenous Si on the morphological and physiological indexes of licorice seedlings under salt stress. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(10): 214-220. 崔佳佳, 張新慧, 李月彤, 等. 外源Si對(duì)鹽脅迫下甘草幼苗形態(tài)及生理指標(biāo)的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(10): 214-220.

[22] Chen Y C, Yi F, Cai M,etal. Effect of amino acids, nitrate, and ammonium on the growth and taxol production in cell cultures ofTaxusyunnanensis. Plant Growth Regulation, 2003, 41: 265-2681.

[23] Huang Y P, Chen Y, Guo F X,etal. Effect of N,P,K combination fertilization on the cultivation quality ofGlycyrrhizauralensisseedlings. Acta Prataculturae Sinica, 2012, 21(2): 233-240. 黃亞萍, 陳垣, 郭鳳霞, 等. 氮磷鉀配施對(duì)甘草育苗質(zhì)量的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2012, 21(2): 233-240.

[24] Yang R, Wang L Q, Liu Y. Research progress on tissue culture of licorice. Chinese Herbal Medicine, 2014, 45(12): 1796-1802. 楊瑞, 王禮強(qiáng), 劉穎. 甘草組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展. 中草藥, 2014, 45(12): 1796-1802.

[25] Liu F C, Lv J M, Wu X Z,etal. Significant impact of different induction conditions on metabolic diversity of callus cell lines ofGlycyrrhizasp. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2013, 38(23): 4056-4060. 劉鳳彩, 呂建明, 吳秀禎, 等. 誘導(dǎo)培養(yǎng)條件顯著改變甘草愈傷組織次生代謝產(chǎn)物的多樣性. 中國(guó)中藥雜志, 2013, 38(23): 4056-4060.

[26] Zhao H Q. The Basic Biology Experimental Guide of Plant Physiology[M]. Beijing: China Agricultural University Press, 2008: 80-82. 趙海泉. 基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)植物生理學(xué)分冊(cè)[M]. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2008: 80-82.

[27] Li Y, Feng J T, Wang Y H,etal. Effects of basic media and culture conditions on callus growth and secondary metabolite content ofTripterygiumwilfordii. Forestry Science, 2010, 46(5): 64-69. 李琰, 馮俊濤, 王永宏, 等. 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)雷公藤愈傷組織生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物含量的影響. 林業(yè)科學(xué), 2010, 46(5): 64-69.

[28] Shangguan X C, Guo C L, Jiang Y. A study on effects of media and plant hormones on callus induction ofCyclocaryapaliurus(Bata.l) iljinskaja stems and leavesinvitro. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis, 2006, 28(5): 678-682. 上官新晨, 郭春蘭, 蔣艷. 培養(yǎng)基和植物激素對(duì)青錢柳莖段和葉片愈傷組織誘導(dǎo)的研究. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 28(5): 678-682.

[29] Ge S J, Li X F, Tan B H,etal. Effect of different dispose on seed germination and peroridase (POD) enzymes ofGlycyrrhizauralensisFisch. Seed, 2008, 27(9): 42-45. 葛淑俊, 李秀鳳, 譚冰海, 等. 不同處理對(duì)烏拉爾甘草種子發(fā)芽率及過(guò)氧化物酶活性的影響. 種子, 2008, 27(9): 42-45.

[30] Yang F, Liu Q L, Dai Z Z,etal. Effects of different explants and basic medium on callus induction and differentiation ofAgavesisalana. Journal of Tropical Crops, 2012, 33(3): 475-478. 楊峰, 劉巧蓮, 代真真, 等. 不同基本培養(yǎng)基和外植體對(duì)劍麻愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2012, 33(3): 475-478.

[31] Wang B J, Gao J F, Su W,etal. Influence of culture condition on callus growth and flavonoids biosynthesis of buckwheat. Journal of Nuclear Agriculture, 2013, 27(5): 591-597. 王鵬姬, 高金鋒, 蘇旺, 等. 培養(yǎng)條件對(duì)蕎麥愈傷組織生長(zhǎng)及黃酮合成的影響. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2013, 27(5): 591-597.

[32] Meng C N, Liu C, He J M,etal. The effects of increased UV-B radiation,NaCl stress and their combined treatment on the photosynthesis and flavone metabolism in wheat seedlings. Photon Journal, 2005, 34(12): 1868-1871. 孟朝妮, 劉成, 賀軍民, 等. 增強(qiáng)UV-B輻射、NaCl脅迫及其復(fù)合處理對(duì)小麥幼苗光合作用及黃酮代謝的影響. 光子學(xué)報(bào), 2005, 34(12): 1868-1871.

[33] Wang Y, Tang H R. Effects of nitrate on the growth and nitrate reductase activity in phaeocystis globosa. Chinese Bulletin of Botany, 2006, 23(2): 138-144. 王艷, 唐海溶. 硝酸鹽對(duì)球形棕囊藻生長(zhǎng)和硝酸還原酶活性的影響. 植物學(xué)通報(bào), 2006, 23(2): 138-144.

[34] Ma S J, Wang W Q. The expression ofSQS1 gene and the content of glycyrrhizic acid ofGlycyrrhizauralensisFisch.in different concentrations of Mn2+. Acta Pharmaceutica Sinica, 2015, 50(1): 111-117. 馬生軍, 王文全. 不同濃度錳處理對(duì)甘草SQS1基因表達(dá)及其甘草酸含量影響的分析. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 50(1): 111-117.

Effects of inorganic salts on the growth and total flavonoid content ofGlycyrrhizauralensiscallus

LIU Fu-Zhi*， YANG Xiu-Yan

CollegeofAgriculture,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China

In this study, five kinds of inorganic salts were added to Murashige and Skoog (MS) culture medium to determine their effects on the growth rate, physiological indexes, and secondary metabolite contents of licorice (Glycyrrhizauralensis) callus. The hypocotyledonary axis of sterile licorice seedlings was used as the experimental material. The culture medium consisted of MS+6-benyzlaminopurine (0.5 mg/L)+2,4-dichlorophenoxyacetic acid (0.5 mg/L)+naphthalene acetic acid (0.5 mg/L)+kinetin (0.4 mg/L)+agar (8 g/L)+sugar (30 g/L). Tissue culture and ultraviolet spectrophotometry methods were used to study the effects of inorganic salts at various concentrations in the culture medium on the growth and characteristics of licorice callus. Increasing amounts of KNO3and MnSO4·4H2O in the medium increased the biomass of licorice callus. Increasing concentrations of CaCl2·2H2O in the medium led to increased accumulation of soluble sugars and total flavonoids. The highest peroxidase activity was in callus in medium containing 2533 mg/L KNO3. Callus growth and total flavonoid content increased significantly as the KH2PO4concentration increased from 170 mg/L to 226 mg/L. The presence of MgSO4·7H2O in the MS medium promoted licorice callus growth and flavonoid synthesis. However, callus growth and total flavonoid synthesis were affected by the interactions among various inorganic salts. The results of an orthogonal test and range analysis indicated that the optimal combination of salts for growth and secondary product accumulation in licorice callus was as follows: MgSO4·7H2O 493 mg/L; MnSO4·4H2O 7 mg/L; KNO32533 mg/L; KH2PO4170 mg/L; and CaCl2·2H2O 733 mg/L.Key words:Glycyrrhizauralensis; callus; inorganic salt; secondary metabolites

10.11686/cyxb2016239

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-06-12；改回日期：2016-08-05

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金(GSAU-STS-1429)資助。

柳福智(1976-)，男，寧夏隆德人，博士。E-mail：lfz_1976@126.com*通信作者Corresponding author.

柳福智, 楊秀艷. 無(wú)機(jī)鹽對(duì)甘草愈傷組織生長(zhǎng)及總黃酮含量的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(5): 118-126.

LIU Fu-Zhi， YANG Xiu-Yan. Effects of inorganic salts on the growth and total flavonoid content ofGlycyrrhizauralensiscallus. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(5): 118-126.