內(nèi)參基因在昆蟲(chóng)qRT—PCR中的研究進(jìn)展

史彩華+胡靜榮+李傳仁+王文凱

摘要：實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是昆蟲(chóng)目標(biāo)基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄分析最常用的技術(shù)手段之一。然而，為了消除樣本在RNA產(chǎn)量、質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄效率上存在的差異，在進(jìn)行qRT-PCR分析目標(biāo)基因表達(dá)量時(shí)必須選擇合適的“管家基因”作為內(nèi)參基因。近年來(lái)，大量研究表明不同昆蟲(chóng)和不同試驗(yàn)條件選擇的內(nèi)參基因也不盡相同。因此，選擇合適的內(nèi)參基因是正確判斷qRT-PCR結(jié)果分析的關(guān)鍵。從內(nèi)參基因的選擇、昆蟲(chóng)內(nèi)參基因的研究和內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述，以期為研究者在將來(lái)的昆蟲(chóng)試驗(yàn)中選擇合適的內(nèi)參基因提供理論參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)參基因；昆蟲(chóng)；qRT-PCR；進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào)： S436.33文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）07-0001-07

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司發(fā)明，隨后經(jīng)過(guò)進(jìn)一步技術(shù)升華，實(shí)現(xiàn)了基因表達(dá)檢測(cè)從定性到定量的飛躍[1]。該技術(shù)具有高效快速、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、靈敏度高和高通量等優(yōu)點(diǎn)，尤其可對(duì)樣本量少、無(wú)法用Northern-blot等手段檢測(cè)的樣本進(jìn)行精確檢測(cè)[2]。因此該技術(shù)是昆蟲(chóng)目標(biāo)基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄分析最常用的技術(shù)手段之一。

qRT-PCR分為絕對(duì)定量和相對(duì)定量2種。絕對(duì)定量具有高度特異性、重復(fù)性好，可進(jìn)行多重定量，每次試驗(yàn)時(shí)必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)分析未知樣品中目標(biāo)核酸序列的絕對(duì)拷貝數(shù)[3]。由于標(biāo)記成本太高，通常應(yīng)用在臨床診斷上[4]。針對(duì)基因的差異表達(dá)分析，科研工作者們最常用的檢測(cè)手段是采用相對(duì)定量法，其優(yōu)點(diǎn)在于成本低、操作方便[5]。相對(duì)定量檢測(cè)時(shí)，需要不同的樣本在起始細(xì)胞數(shù)目、RNA提取效率、質(zhì)量及逆轉(zhuǎn)錄水平等均相同，否則會(huì)影響目的基因的真實(shí)表達(dá)水平。然而，這些條件不可能同時(shí)滿足，因此，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)水平時(shí)，需要選擇穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化[6]。

理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在不同試驗(yàn)條件下均能穩(wěn)定表達(dá)[7]。但是大量的研究表明，隨著試驗(yàn)條件的變化，沒(méi)有哪一種內(nèi)參基因在不同細(xì)胞類(lèi)型和不同生理狀態(tài)下的表達(dá)是始終恒定不變的[8]。倘若盲目地選擇內(nèi)參基因，可能難以發(fā)現(xiàn)某些目的基因表達(dá)的微小差異，或者出現(xiàn)錯(cuò)誤甚至相反的結(jié)論[9]，導(dǎo)致目的基因表達(dá)水平出現(xiàn)100倍的偏差[10]。因此，選擇合適的內(nèi)參基因是正確判斷qRT-PCR結(jié)果分析的關(guān)鍵[11]。

近年來(lái)，隨著qRT-PCR和基因芯片的廣泛應(yīng)用，內(nèi)參基因的研究報(bào)道日益增多[12]。本研究從內(nèi)參基因的選擇、昆蟲(chóng)內(nèi)參基因的研究和內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述，以期為研究者在將來(lái)的昆蟲(chóng)試驗(yàn)中選擇合適的內(nèi)參基因提供理論參考依據(jù)。

1昆蟲(chóng)常用內(nèi)參基因的選擇及具備的條件

內(nèi)參基因通常選擇受環(huán)境因素影響較小、表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定的“管家基因”[13]。在細(xì)胞中，內(nèi)參基因的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)幾乎恒定。內(nèi)參基因在不同類(lèi)型的細(xì)胞、組織及不同試驗(yàn)條件下表達(dá)水平存在差異，因此，不同試驗(yàn)需要選擇不同的內(nèi)參基因[14]。理想的內(nèi)參基因不存在假基因，避免基因組DNA的擴(kuò)增[15]；同時(shí)，理想的內(nèi)參基因具有高度或中度表達(dá)特性，Ct值應(yīng)介于15～30之間[16]，能夠在昆蟲(chóng)不同類(lèi)型細(xì)胞和組織中穩(wěn)定表達(dá)，不受生理周期的影響，不受任何內(nèi)外因素的干擾[17]；另外，理想的內(nèi)參基因還需要具有與目的基因相似的表達(dá)量[18]。但是，這樣的內(nèi)參基因并不存在，沒(méi)有任何一種基因在不同的試驗(yàn)條件下始終恒定表達(dá)。因此，選擇合適的內(nèi)參基因是qRT-PCR進(jìn)行基因表達(dá)分析的重要前提。

由于內(nèi)參基因在不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)并非恒定不變，qRT-PCR試驗(yàn)時(shí)使用1個(gè)內(nèi)參基因往往不能得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。因此，同時(shí)使用2個(gè)或多個(gè)內(nèi)參基因有助于調(diào)整系統(tǒng)偏差，更有利于得到準(zhǔn)確的基因表達(dá)定量結(jié)果，尤其針對(duì)表達(dá)量只有細(xì)微差異的基因非常重要[19]。

目前，昆蟲(chóng)研究中常見(jiàn)的內(nèi)參基因包括β-肌動(dòng)蛋白基因（beta actin，β-actin）、延伸因子1（elongation factor-1 alpha，EF1-a）、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）和琥珀酸脫氫酶復(fù)合體A亞基（succinate dehydrogenase complex subunit A，SDHA）基因等[20]（表1），這些基因存在于細(xì)胞的正常生命代謝中，維持生命活動(dòng)所需的細(xì)胞器骨架的基本組合，參與生命體的基本生化代謝過(guò)程。

2特定試驗(yàn)條件下昆蟲(chóng)內(nèi)參基因的研究

雖然上述常用內(nèi)參基因一直被作為目的基因的標(biāo)準(zhǔn)化基因，但是，最近大量研究表明，任何一種“管家基因”的所謂恒定表達(dá)只是在一定類(lèi)型的細(xì)胞或試驗(yàn)因素作用下“有范圍”的恒定[21]。在一種試驗(yàn)條件下穩(wěn)定表達(dá)的基因并非適合另一種試驗(yàn)條件，同種試驗(yàn)條件下不同的昆蟲(chóng)種類(lèi)選擇的內(nèi)參基因也不盡相同。因此，針對(duì)特定試驗(yàn)條件選擇合適的內(nèi)參基因是準(zhǔn)確分析目的基因表達(dá)的基礎(chǔ)[22]。

2.1不同蟲(chóng)態(tài)或發(fā)育時(shí)期內(nèi)參基因的選擇研究

陳立華等研究表明，β-actin基因在蓖麻蠶幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)、卵各發(fā)育時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定，適合作為不同蟲(chóng)態(tài)的內(nèi)參基因[23]。袁淼研究表明，RPS15、RPS11、α-TUB和EF1-α基因適合作為褐飛虱不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[24]。Sun等研究表明，RPS18和α-TUB基因適合作為朱砂葉螨卵、幼螨、若螨和成螨4個(gè)不同歷期的內(nèi)參基因[25]。王佳等研究表明，UBQ、GAPDH和GST基因適合作為柑橘大實(shí)蠅不同蟲(chóng)態(tài)的內(nèi)參基因[26]；Lü等研究表明，RPL32基因適合作為柑橘大實(shí)蠅不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[27]；王劉豪研究表明，α-TUB、RPL32和EF1-α基因適合作為柑橘大實(shí)蠅不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[28]。

宋旺等研究表明，RPS、GAPDH和α-TUB基因可作為不同存活時(shí)間花絨寄甲的內(nèi)參基因[29]。Bansal等研究表明，TBP基因可作為大豆蚜不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[30]。郭長(zhǎng)寧研究表明，β-TUB和β-actin基因可作為金紋細(xì)蛾不同發(fā)育階段各蟲(chóng)態(tài)間的內(nèi)參基因[31]。徐素平等研究表明，PPI、RPII和DIMT基因可作為不同發(fā)育階段棉蚜的內(nèi)參基因[32]。陳芳等研究表明，α-TUB基因可作為棉花粉蚧2齡若蟲(chóng)和3齡若蟲(chóng)的內(nèi)參基因[33]。楊麗紅研究表明，RPII基因適合作為柑橘全爪螨不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[34]。Lu等研究表明，GAPDH和UCCR基因適合作為斜紋夜蛾不同發(fā)育歷期內(nèi)參基因[35]。van Hiel等研究表明，RP49、EF1α和ACT基因適合作為5齡沙漠飛蝗幼蟲(chóng)的內(nèi)參基因[36]。Toutges等研究表明，rps6、rpL13、rps3和rps18基因適合作為赤擬谷盜不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)參基因[37]。Bagnall等研究表明，18S rRNA、28S rRNA、GST1、β-TUB和RPLPO基因適合作為絲光綠蠅不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[38]。Mamidala等研究表明，RPL18基因適合作為溫帶臭蟲(chóng)不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[39]。Zhang等研究表明，28S rRNA和RPS15基因適合作為棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[40]。Shakeel等研究表明，RPL28和RPS15基因適合作為棉鈴蟲(chóng)不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[41]。Cardoso等研究表明，ACTIN、GAPDH和RP49基因適合作為麗蠅不同發(fā)育歷期的內(nèi)參基因[42]。

綜上所述，不同學(xué)者對(duì)不同昆蟲(chóng)各蟲(chóng)態(tài)和發(fā)育歷期內(nèi)參基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明它們之間并不存在完全的共性，即不同昆蟲(chóng)各蟲(chóng)態(tài)和發(fā)育歷期之間選用的內(nèi)參基因不盡相同，說(shuō)明不同昆蟲(chóng)種類(lèi)同源內(nèi)參基因之間并不存在絕對(duì)的通用性。

2.2不同昆蟲(chóng)組織內(nèi)參基因的選擇研究

李柯等研究表明，黏蟲(chóng)β-actin基因在不同組織間的表達(dá)無(wú)顯著差異，適合作為組織研究的內(nèi)參基因[43]。吳家紅等研究表明，RSPL40和BTF3基因適合作為白紋伊蚊不同組織研究的內(nèi)參基因[44]。彭然研究表明，ACT3、GAPDH和α-TUB基因在家蠶中腸組織中表達(dá)穩(wěn)定；α-TUB、UBC和TBP在家蠶脂肪體中表達(dá)穩(wěn)定；UBC、α-TUB和ACT3基因在家蠶馬氏管中表達(dá)穩(wěn)定，可分別作為不同組織的內(nèi)參基因[45]。陳立華等研究表明，β-actin基因適合作為蓖麻蠶血液、脂肪體、中腸和絲腺等組織研究的內(nèi)參基因[23]。王佳等研究表明柑橘大實(shí)蠅成蟲(chóng)的不同組織適合采用TUB、GAPDH和GST基因作為內(nèi)參基因[26]。袁淼研究表明，RPS11、TUB和RPS15基因適合作為褐飛虱組織研究的內(nèi)參基因[24]。Shen等研究表明，ACTB和α-TUB基因適合作為東方實(shí)蠅組織研究的內(nèi)參基因[46]。吳玉等研究表明，α-TUB和28S rRNA基因在中部絲腺中表達(dá)穩(wěn)定，GAPDH和28S rRNA基因在后部絲腺中表達(dá)穩(wěn)定，α-TUB和UBC基因在脂肪體中表達(dá)穩(wěn)定，適合作為不同組織研究的內(nèi)參基因[47]。

郭長(zhǎng)寧研究表明，β-actin和18S rRNA基因適合作為金紋細(xì)蛾成蟲(chóng)不同組織研究的內(nèi)參基因[31]。徐素平研究表明，PPI和DIMT基因是棉蚜不同組織最優(yōu)內(nèi)參基因[32]。Lu等研究表明，RPL10、AK和EF-1α基因適合作為斜紋夜蛾不同組織研究的內(nèi)參基因[35]。Paim等研究表明，18S rRNA、GAPDH和α-TUB基因適合作為長(zhǎng)紅錐蝽唾液腺和體腔內(nèi)研究的內(nèi)參基因[48]。申光茂等研究表明，α-TUB和ACT5基因組合適合作為橘小實(shí)蠅雌蟲(chóng)不同組織的內(nèi)參基因；α-TUB和ACT3基因組合適合作為橘小實(shí)蠅雄蟲(chóng)不同組織的內(nèi)參基因；α-TUB和ACT2基因組合最適合作為橘小實(shí)蠅雄蟲(chóng)和雌蟲(chóng)中腸和馬氏管的內(nèi)參基因；α-TUB和ACT1基因組合適合作為橘小實(shí)蠅脂肪體的內(nèi)參基因[49]。Majerowicz等研究表明，18S rRNA和EF-1α基因適合作為長(zhǎng)紅錐蝽不同組織器官研究的內(nèi)參基因[50]。Hornkova等研究表明，AK和PLA2基因適合作為黃蜂唇腺和脂肪體研究的內(nèi)參基因；EF-1α和PLA2基因適合作為熊蜂唇腺和脂肪體研究的內(nèi)參基因[51]。Mamidala等研究表明，RPL18基因適合作為溫帶臭蟲(chóng)不同組織研究的內(nèi)參基因[39]。Rajarapu等研究表明，EF-1α基因適合作為白蠟窄吉丁蟲(chóng)組織的內(nèi)參基因[52]。Zhang等研究表明，RPS15和RPL13基因適合作為棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)組織的內(nèi)參基因；EF-1α和RPL27基因適合作為棉鈴蟲(chóng)成蟲(chóng)組織的內(nèi)參基因[40]。

根據(jù)上述不同學(xué)者對(duì)不同昆蟲(chóng)組織的內(nèi)參基因進(jìn)行研究，結(jié)果表明不同昆蟲(chóng)組織之間合適的內(nèi)參基因不同；另外，同種昆蟲(chóng)不同組織之間選用的合適內(nèi)參基因也不盡相同。因此，進(jìn)一步說(shuō)明特定試驗(yàn)條件下需要選擇特定的內(nèi)參基因，不能盲目借鑒。

2.3不同溫度處理后內(nèi)參基因的選擇研究

孟閃閃等研究表明，光滑鱉甲β-actin基因在不同季節(jié)、不同溫度處理后表達(dá)無(wú)顯著差異，可作為溫度脅迫研究的內(nèi)參基因；而小胸鱉甲隨季節(jié)和溫度的變化，β-actin基因表達(dá)呈現(xiàn)顯著差異，不適合作為溫度脅迫研究的內(nèi)參基因[53]。

唐婷等研究表明，β-actin基因適合作為荒漠昆蟲(chóng)謝氏寬漠王溫度脅迫研究的內(nèi)參基因[54]。袁淼研究表明，RPS15、TUB和EF-1α基因適合作為褐飛虱溫度脅迫研究的內(nèi)參基因[24]。楊麗紅研究表明，α-TUB和RPII基因適合作為柑橘全爪螨溫度脅迫研究的內(nèi)參基因[34]。Lu等研究表明，GAPDH 和EF-1α基因適合作為斜紋夜蛾溫度脅迫研究的內(nèi)參基因[35]。Ponton等研究表明，Actin、Mnf和TUB基因適合作為黑腹果蠅溫度脅迫研究的內(nèi)參基因[55]。Zhang等研究表明，RPS15和RPL27基因適合作為棉鈴蟲(chóng)溫度脅迫研究的內(nèi)參基因[40]；Shakeel等研究表明，RPL28和RPS15基因適合作為棉鈴蟲(chóng)溫度脅迫研究的內(nèi)參基因[41]。

綜合上述研究結(jié)果表明，溫度脅迫對(duì)不同昆蟲(chóng)體內(nèi)同種“管家基因”表達(dá)水平的影響不盡相同。同一種“管家基因”在不同昆蟲(chóng)體內(nèi)反應(yīng)并非一致，有的經(jīng)溫度脅迫后表達(dá)穩(wěn)定，有的高豐度表達(dá)。因此，再次說(shuō)明不同物種在相同試驗(yàn)條件下也需要篩選特有的內(nèi)參基因，不能盲目借用。

2.4菌或病毒脅迫后內(nèi)參基因的選擇研究

Scharlaken等研究表明，意大利蜂經(jīng)細(xì)菌脅迫前后ACT、RPS18和GAPDH基因表達(dá)穩(wěn)定，適合作為內(nèi)參基因[56]。Maroniche等研究表明，UBI、18S rRNA和ACT基因適合作為飛虱感染病毒后的內(nèi)參基因[57]。Xue等研究表明，28S rRNA基因適合作為昆蟲(chóng)細(xì)胞感染病毒后的內(nèi)參基因[58]。Lord等研究表明，RPS3、RPS18和RPL13基因適合作為赤擬谷盜感染真菌后的內(nèi)參基因[59]。Niu等研究表明，PPAI、RPL23和UBI基因適合作為歐洲熊蜂感染IAPV病毒后的內(nèi)參基因[60]。Zhang等研究表明，GAPDH、RPL27和TUB基因適合作為棉鈴蟲(chóng)感染核型多角體病毒后的內(nèi)參基因[40]。

上述研究結(jié)果表明，菌或病毒感染昆蟲(chóng)也是一種脅迫，能夠影響昆蟲(chóng)體內(nèi)不同“管家基因”的表達(dá)水平。因此，研究菌或病毒感染昆蟲(chóng)后目標(biāo)基因的表達(dá)，需要根據(jù)不同的昆蟲(chóng)或不同的病毒進(jìn)行特定內(nèi)參基因篩選，不能直接照搬或盲目借鑒其他昆蟲(chóng)的內(nèi)參基因。

2.5昆蟲(chóng)不同品系或地理種群內(nèi)參基因的選擇研究

袁淼對(duì)褐飛虱內(nèi)參基因篩選研究表明，TUB、RPS11、EF-1α基因在不同地理種群中表達(dá)穩(wěn)定[24]。Lu等對(duì)斜紋夜蛾內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析，結(jié)果表明不同種群中RPL10和 EF-1α基因適合作為不同品系或地理種群的內(nèi)參基因[35]。由此說(shuō)明，同種昆蟲(chóng)特定基因表達(dá)分析時(shí)，也需要考慮其地理種群或品系之間的差異，合理選擇內(nèi)參基因。

2.6昆蟲(chóng)不同藥劑處理后內(nèi)參基因的選擇研究

高新菊等研究表明，α-TUB基因適合作為二斑葉螨抗甲氰菊酯品系的內(nèi)參基因研究[61]。Niu等研究表明，EF-1α和GAPDH基因在不同藥劑選擇壓力下的柑橘全爪螨品系中表達(dá)最穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參基因[62]。Sun等研究表明，在朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）敏感和抗甲氰菊酯品系中最理想的內(nèi)參基因是RPS18和5.8S rRNA基因組合[25]。袁淼對(duì)褐飛虱內(nèi)參基因篩選研究表明，RPS11、EF-1α和TUB基因在不同藥劑處理下表達(dá)穩(wěn)定，適合作為藥劑研究的內(nèi)參基因[24]。郭長(zhǎng)寧研究表明，β-actin和β-TUB基因適合作為金紋細(xì)蛾藥劑研究中的內(nèi)參基因[31]。申光茂等研究表明，橘小實(shí)蠅經(jīng)藥劑處理后，幼蟲(chóng)中EF-1α基因表達(dá)穩(wěn)定，脂肪中RPL13基因表達(dá)穩(wěn)定[49]。Jiang等研究表明，18S rRNA基因適合作為書(shū)虱經(jīng)殺蟲(chóng)劑誘導(dǎo)后的內(nèi)參基因[63]。Zhang等研究表明，RPS15和RPL32基因適合作為棉鈴蟲(chóng)經(jīng)殺蟲(chóng)劑處理后的內(nèi)參基因[40]。

綜上研究表明，藥劑處理也會(huì)導(dǎo)致昆蟲(chóng)體內(nèi)部分“管家基因”發(fā)生表達(dá)差異，有些“管家基因”表達(dá)恒定，有些“管家基因”發(fā)生明顯的上下調(diào)。因此，在研究藥劑處理后昆蟲(chóng)目標(biāo)基因的表達(dá)差異時(shí)，也需要根據(jù)昆蟲(chóng)種類(lèi)和藥劑類(lèi)型來(lái)提前篩選合適的內(nèi)參基因。

2.7其他

袁淼對(duì)褐飛虱內(nèi)參基因篩選研究表明，RPS15、TUB、RPS11和EF-1α在不同食物飼喂時(shí)表達(dá)穩(wěn)定；RPS11、TUB、RPS15在饑餓處理下表達(dá)穩(wěn)定[24]。Ponton等研究表明，RPL32和α-TUB適合作為黑腹果蠅食物脅迫下的內(nèi)參基因[64]。Spanier等研究表明，Xbp1、Tbp、CAPON和Stx16適合作為水生蚤類(lèi)被捕食誘導(dǎo)研究的內(nèi)參基因[65]。Chapuis等研究表明，Arm和EF-1α適合作為澳大利亞蝗蟲(chóng)高密度飼養(yǎng)條件下的內(nèi)參基因[66]。Wang等研究表明，UBE3和RPL22適合作為芫菁雌蟲(chóng)內(nèi)參基因；UBE3、TAF5和RPL22適合作為芫菁雄蟲(chóng)內(nèi)參基因[67]。Shakeel等研究表明，棉鈴蟲(chóng)在饑餓狀態(tài)下，RPL28和RPS15適合作為內(nèi)參基因；經(jīng)過(guò)不同光周期脅迫幼蟲(chóng)，HSP90和TUBB表達(dá)最穩(wěn)定；TUBB和GAPDH在機(jī)械損傷中表達(dá)最穩(wěn)定[41]。

總之，綜合國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)不同昆蟲(chóng)、不同試驗(yàn)條件下內(nèi)參基因的篩選研究，結(jié)果表明同一物種同一內(nèi)參基因在不同生理?xiàng)l件下通常并不穩(wěn)定。而不同物種中同源內(nèi)參基因也沒(méi)有絕對(duì)的通用性，它們的穩(wěn)定性不盡相同。因此，在所有條件下都穩(wěn)定表達(dá)的理想內(nèi)參基因并不存在，在研究目標(biāo)基因表達(dá)水平時(shí)，應(yīng)根據(jù)具體條件選擇合適的內(nèi)參基因。

3內(nèi)參基因穩(wěn)定性評(píng)價(jià)及數(shù)據(jù)分析方法

內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)之前，首先需要通過(guò) qRT-PCR分析內(nèi)參基因引物的擴(kuò)增效率。只有擴(kuò)增效率在一定范圍內(nèi)（90%～105%）；熔解曲線以單峰最佳，且Tm值（擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度）至少要大于75 ℃，才符合進(jìn)行基因表達(dá)穩(wěn)定性評(píng)價(jià)的要求[68]。

目前，評(píng)價(jià)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析方法有多種，主要包括GeNorm[69]、NormFinder[70]和BestKeeper[71]等程序。Xie等將這3種分析方法整合成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)分析工具——RefFinder，能夠綜合評(píng)價(jià)和篩選合適的內(nèi)參基因[72]。

GeNorm是Jo Vandesompele于2002年編寫(xiě)的一款軟件，專(zhuān)門(mén)用于qRT-PCR方法分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。其原理是不管在何種試驗(yàn)下，2個(gè)理想內(nèi)參基因表達(dá)水平的比值均保持一致，不受基因表達(dá)豐度差異的影響，表達(dá)水平比值變異度的增加意味著二者中其一或全部基因表達(dá)穩(wěn)定性的降低[73]。該程序?qū)⒛骋弧肮芗一颉迸c其他“管家基因”表達(dá)水平進(jìn)行兩兩比值，轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)后將其平均標(biāo)準(zhǔn)差作為基因表達(dá)穩(wěn)定性的平均值M。對(duì)所有候選“管家基因”的表達(dá)穩(wěn)定度排序，M值越大，穩(wěn)定性越低；M值越小，穩(wěn)定性越高。GeNorm程序可以篩選不同試驗(yàn)條件下最適內(nèi)參基因的數(shù)量，選擇出2個(gè)以上最優(yōu)組合的內(nèi)參基因，并非傳統(tǒng)的單一內(nèi)參基因，有利于減少系統(tǒng)偏差，得到更加可靠的相對(duì)定量結(jié)果[74]。另外，GeNorm程序可以對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)變異V值進(jìn)行分析，以確定所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目。將Vn/Vn+1比值與默認(rèn)的V值（0.15）進(jìn)行比較，如果Vn/Vn+1大于0.15，則有必要引入第n+1個(gè)基因；反之，則不必引入新的內(nèi)參基因[75]。GeNorm軟件下載地址：http：//medgen.ugent.be/～jvdesomp/genorm/index.php。

NormFinde是Claus于2004年編寫(xiě)的一款軟件，建立在一個(gè)固定的統(tǒng)計(jì)學(xué)框架上，通過(guò)測(cè)定每個(gè)基因的穩(wěn)定性來(lái)評(píng)估不同條件下候選內(nèi)參基因和樣本之間的變化[76]，篩選出合適的內(nèi)參基因。其運(yùn)行原理與GeNorm程序類(lèi)似，通過(guò)測(cè)定每個(gè)基因的穩(wěn)定值，再根據(jù)穩(wěn)定值的大小排序，值越大穩(wěn)定性越差；反之，穩(wěn)定性越好，最終將表達(dá)穩(wěn)定值最小的基因作為內(nèi)參基因。不足之處是只能選擇1個(gè)合適的內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)[77]。NormFinder軟件下載地址：http：//www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm。

BestKeeper是Pfaffl等于2004年編寫(xiě)的一款分析軟件，用于分析內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性和目標(biāo)基因的表達(dá)水平，其優(yōu)點(diǎn)在于可以同時(shí)比較100個(gè)樣品中10個(gè)內(nèi)參基因和10個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)水平[71，78]。其運(yùn)行原理是先比較每個(gè)基因之間Ct值產(chǎn)生配對(duì)的相關(guān)系數(shù)（r）、變異系數(shù)（CV）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（s），再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)的大小排序，其中標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小，穩(wěn)定性越好；反之，穩(wěn)定性越差[79]。BestKeeper不僅可以分析內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性，也可以比較目標(biāo)基因的表達(dá)水平。BestKeeper軟件下載地址：http：//www.gene-quantif ication.de/best-keeper.html。

GeNorm、NormFinder和Best-Keeper均是通過(guò)不同的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法篩選合適的內(nèi)參基因，但由于這些軟件具有不同的算法，可能導(dǎo)致彼此之間得出的最佳內(nèi)參基因不盡相同[80]。因此，可以用RefFinder整合上述3種分析方法，并對(duì)每個(gè)基因單獨(dú)用3種分析方法評(píng)價(jià)排名求幾何平均值，得到一個(gè)綜合排名指數(shù)，若指數(shù)越小，說(shuō)明該內(nèi)參基因越穩(wěn)定[81]。

4小結(jié)

目前還沒(méi)有一種理想的內(nèi)參基因可以完全用于同種昆蟲(chóng)的不同細(xì)胞和組織，更沒(méi)有一種理想的內(nèi)參基因可以完全用于不同種昆蟲(chóng)的細(xì)胞和組織，即不同昆蟲(chóng)同一生物因素或非生物因素條件下，選擇的內(nèi)參基因不同；同種昆蟲(chóng)不同生物因素或非生物因素條件下，選擇的內(nèi)參基因也不盡相同。另外，不同學(xué)者在同種昆蟲(chóng)相同試驗(yàn)條件下，篩選出并非完全一致的內(nèi)參基因，這是由不同學(xué)者選擇不同候選“管家基因”所致。

為了獲得真實(shí)可靠的試驗(yàn)結(jié)果，在進(jìn)行基因相對(duì)定量研究時(shí)，由于不同的樣本存在RNA的產(chǎn)量、質(zhì)量和反轉(zhuǎn)錄效果上的差異，需要選擇合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正[82-83]。從目前已有的報(bào)道來(lái)看，不同物種在不同條件下的最佳內(nèi)參基因往往存在較大差異[84-86]。因此，不能盲目地選擇校正目的基因的內(nèi)參基因。任何一種“管家基因”均只在一定類(lèi)型的細(xì)胞或試驗(yàn)因素下表達(dá)恒定，在其他類(lèi)型的細(xì)胞或試驗(yàn)因素下可能發(fā)生較大變化，有時(shí)可以是十幾倍、幾十倍甚至上百倍的差異[87-88]。倘若盲目地選擇內(nèi)參基因，可能導(dǎo)致本應(yīng)微量表達(dá)的基因難以發(fā)現(xiàn)，或者產(chǎn)生錯(cuò)誤甚至相反的結(jié)論。如研究煙粉虱目標(biāo)基因表達(dá)時(shí)往往采用常見(jiàn)的ACT作為內(nèi)參基因[89-90]，而Su等發(fā)現(xiàn)煙粉虱ACT在許多條件下的表達(dá)極不穩(wěn)定[7]。因此，研究目標(biāo)基因的表達(dá)時(shí)，需要根據(jù)樣本的不同，選擇合適而穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。

另外，在基因組測(cè)序和基因芯片分析結(jié)果的推動(dòng)下，新內(nèi)參基因的篩選有了新的途徑[91]。常用內(nèi)參基因由于表達(dá)穩(wěn)定性差可能逐漸被新的內(nèi)參基因取代。目前，基于基因芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出不同試驗(yàn)條件下均能穩(wěn)定表達(dá)的基因，這些基因可作為候選內(nèi)參基因，并通過(guò)qRT-PCR試驗(yàn)驗(yàn)證其表達(dá)穩(wěn)定性，再與傳統(tǒng)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行比較，有助于準(zhǔn)確無(wú)誤地揭示昆蟲(chóng)基因表達(dá)的內(nèi)在規(guī)律。然而，近年來(lái)使用基因芯片數(shù)據(jù)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)篩選新內(nèi)參基因的研究較少，尤其在昆蟲(chóng)研究中更是未見(jiàn)報(bào)道，許多研究者仍然沿用常用基因作為內(nèi)參。因此，在挖掘新內(nèi)參基因的道路上，還需要尋找更加精確有效的方法。

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