白補藥總多酚測定方法及其相關活性的研究

曹 暉,常 飛,2,茍體忠,2,3

1.凱里學院 化學與材料工程學院,貴州 凱里 556011

2.凱里學院 植物資源綜合利用研究所,貴州 凱里 556011

3.凱里學院 富硒中草藥研究中心,貴州 凱里 556011

白補藥總多酚測定方法及其相關活性的研究

曹 暉1,常 飛1,2,茍體忠1,2,3

1.凱里學院 化學與材料工程學院,貴州 凱里 556011

2.凱里學院 植物資源綜合利用研究所,貴州 凱里 556011

3.凱里學院 富硒中草藥研究中心,貴州 凱里 556011

本文以沒食子酸為對照品，探索白補藥多酚Folin-Ciocalteu比色法的測定條件。研究結果表明，F(xiàn)olin-Ciocalteu比色法測定白補藥多酚含量的適宜條件為：Folin-Ciocalteu試劑1.5 mL、10%Na2CO3溶液6 mL、溫度40℃、反應30 min，該法操作簡單、精密度高、穩(wěn)定性好、回收率高。并考察了白補藥多酚和陽性對照VC、BHT的抗氧化活性，結果顯示，白補藥多酚對DPPH清除率、總抗氧化能力、還原力均大于同濃度的VC和BHT。

白補藥;多酚;抗氧化活性

白補藥（Salvia scapiformis Hance var.Hirsute Stib）又名地埂鼠尾草、翻天雷公，為唇形科植物花徑狀丹參的全草，生于海撥120～1250 m的山地、路旁，主產(chǎn)于貴州、廣西等地。在民間用于強筋壯骨，補虛益[1,2]。通過對白補藥75%乙醇提取浸膏進行顯色反應，鹽酸-鎂粉實驗、碘化鉍鉀實驗、三氯化鐵實驗、醋酐-濃硫酸試驗和TLC檢測顯示白補藥的乙醇提取物含酚酸類等化合物[3]。

多酚具有抗病作用、抗衰老、抗氧化、抗癌防癌等多種生物活性[4]。目前，白補藥的研究不多，尤其是對白補藥中多酚含量測定方法及抗氧化活性還未見資料報道。植物多酚含量測定的方法通常有：高錳酸鉀滴定法[5]、酒石酸亞鐵比色法[6]、Folin-Ciocalteu法等[7,8]，比較而言，F(xiàn)olin-Ciocalteu法（FC）操作簡單、價格便宜、效率高、重現(xiàn)性好[9]。但由于不同植物來源的多酚成分的不同，其比色條件也不盡相同[10-12]，故需對其顯色條件進行優(yōu)化，建立白補藥的多酚測定方法。同時隨著科學的進步，合成抗氧化劑的危害漸漸凸現(xiàn)[13]。植物多酚作為一類貯存厚實、可再生的綠色資源，越來越受到人們的關注。因此，本文采用貴州雷公山豐富的白補藥資源為研究對象，貴州雷公山，位于貴州省東南部，海拔2178.8 m，被聯(lián)合國教科文衛(wèi)組織稱為“現(xiàn)今人類留存最好的一塊未受污染的生態(tài)文明凈地”，其多酚含量及抗氧化活性應有一定的本土性。通過建立高效，準確的測定白補藥中多酚含量的方法，及對清除DPPH、總抗氧化能力、還原力的測定，為雷公山豐富的白補藥資源開發(fā)應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

野生白補藥（2015年7月采于貴州雷公山）。取白補藥全草洗凈、曬干，粉碎、過60目篩；取一定量白補藥粉末以1:10置于索氏提取器中，用石油醚回流處理（60℃）15 h，脫脂、脫色，備用。儀器：UV-2550紫外可見分光光度計（日本島津銷售公司）；FA1004電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；WH-300超聲波清洗機（濟寧萬和電子設備有限公司）；RE 52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）等。

1.2 試 劑

沒食子酸標準品(純度≥98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH·)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、FoIin-CiocaIteu(FC)試劑均購于上海晶純生化科技股份有限公司產(chǎn)品；抗壞血酸(Vc)、無水乙醇、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、碳酸鈉、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、鉬酸銨、硫酸、三氯化鐵、石油醚等均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方 法

1.3.1 白補藥多酚供試液及對照品的制備 參考趙二勞等的方法[14]，稍作修改。稱取2.0007 g脫脂、脫色白補藥粉末于錐形瓶中，以料液比(g·mL-1)1:10加入60%的乙醇溶液浸泡30 min，超聲提取3次，每次40 min，設定超聲功率270 w，60℃，合并提取液并濃縮至40 mL。取5.0 mL提取液于50 mL容量瓶，定容，得白補藥多酚供試液，備用。

稱取150 mg干燥至恒重的沒食子酸，用去離子水溶解，定容于100 mL的容量瓶中，精密移取5.00 mL于50 mL的容量瓶中，用去離子水定容，得150 μg·mL-1的沒食子酸標準溶液。

1.3.2 多酚測定波長的選擇 準確移取對照品和白補藥多酚供試液各1.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，參照何志勇等研究[15]，依次加入12.0 mL去離子水、1.5 mL FC，充分搖勻，靜置8 min，加入濃度為10%Na2CO3溶液6.0 mL，混勻，用去離子水定容，室溫下避光反應2 h，在200～800 nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描確定測定波長。在763 nm處二者均有最大吸收，故確定763 nm為多酚測定波長。

1.3.3 白補藥多酚測定方法的研究 以吸光度為考察指標，分別考察FC試劑與10%Na2CO3溶液用量、反應時間和反應溫度對吸光度的影響，得出適宜白補藥多酚測定的顯色條件。

1.3.4 福林酚比色法評價

(a)穩(wěn)定性實驗：精密移取1.3.1供試液l.0 mL于25 mL容量瓶內(nèi)，按最佳顯色條件顯色，于40℃條件下避光分別放置 0.5、1.0、1.5、2、2.5、3 h，測定吸光度，計算RSD評價該分析方法在3 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

(b)精密度實驗：精密移取1.3.1供試液1.0 mL于25 mL容量瓶內(nèi)，按最佳顯色條件顯色，測定吸光度，重復測定5次，計算RSD。評價試驗方法的精密度。

(c)加標回收實驗：精密移取1.3.1供試液1.0 mL于5個25 mL容量瓶中，分別加入不同體積的沒食子酸標準溶液，在最佳顯色條件下避光顯色，測定吸光度，計算平均回收率及RSD，以評價該分析方法的準確性和可靠性。

1.3.5 標準曲線的建立 分別準確移取150 μg·mL-1的沒食子酸標準溶液0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL于6個25 mL容量瓶中，加入12.0 mL去離子水，在2.1最佳顯色條件下顯色，測定吸光度，將其結果進行線性回歸，得回歸方程y=0.0919 x+0.0381，相關系數(shù)是R=0.9996，沒食子酸濃度在1.8～9.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好。

1.3.6 白補藥多酚抗氧化活性測定 將白補藥多酚提取液濃縮后稀釋成6個不同濃度，采用DPPH·法、磷鉬絡合物法、還原力法測定白補藥多酚的抗氧化活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理。試驗均為3次重復。

2 結果與討論

2.1 白補藥多酚測定方法的確定

2.1.1 10%Na2CO3溶液用量的確定 取供試液和對照品各1.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，依次加入12.0 mL去離子水，1.5 mL FC，搖勻，靜置反應8 min，再加入不同體積（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL)10%Na2CO3溶液，搖勻，定容，避光顯色反應2 h，測定吸光度，實驗結果見表1。

表1 10%Na2CO3用量對吸光度的影響Table 1 The effect of 10%Na2CO3on the absorbance

a、b、c、d分別代表5%水平下的顯著性差異。a:將全部平均數(shù)從大到小順序排列，然后在最大的平均數(shù)上標上字母a；b:將該平均數(shù)依次與其以下各平均數(shù)相比，凡差異不顯著的都標字母a，直至某一個與之相差顯著的平均數(shù)則標以字母b；c:再以標有b的最大平均數(shù)為標準，與以下各未標記的平均數(shù)比，凡不顯著的繼續(xù)標以字母b，直至某一個與之相差顯著的平均數(shù)則標以字母c。如此重復下去，直至最小的一個平均數(shù)有了標記字母為止。

由表1知，隨著10%Na2CO3溶液體積的增大，供試液、對照品吸光度均增大，當10%Na2CO3溶液體積增至4.0 mL時，吸光度增至最大，隨后吸光度緩慢下降。根據(jù)FC試劑與多酚物質(zhì)在堿性環(huán)境下顯色的原理，Na2CO3溶液的用量對多酚與FC的顯色反應有較大的影響[16]，Na2CO3溶液用量不足多酚物質(zhì)的顯色不完全，吸光度偏低。對供試液、對照品顯色反應進行顯著性差異分析，10%Na2CO3溶液用量為4.0 mL（FC體積與10%Na2CO3溶液的體積比為1:4）時與1.0、2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL時的吸光度均存在顯著性差異（P＜0.05），結合分光光度法原理，可認為當FC的體積與10% Na2CO3溶液的體積比為1:4時，顯色較完全，故選擇FC與10%Na2CO3溶液最佳比為1:4。

2.1.2 Folin-Ciocalteu用量的確定 精密移取供試液和對照品各1.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，加入12.0 mL的去離子稀釋，都加入不同體積的FC試劑，混勻后靜置反應8 min，加入體積為FC試劑體積4倍的10%Na2CO3溶液，定容，避光反應2 h測定吸光值，實驗結果見表2。

表2 Folin-Ciocalteu用量對吸光度的影響Table 2 The effect of Folin-Ciocalteu on the absorbance

由表2可知，F(xiàn)C用量從0.5 mL增至1.5 mL時，供試液、對照品吸光度均增大并至最大值，F(xiàn)C用量從1.5 mL增至2.5 mL時吸光度趨于平衡。這是因為隨著FC試劑用量增加，多酚顯色反應逐漸完全，吸光度增大。對供試液、對照品顯色反應進行顯著性差異分析，F(xiàn)C為1.5 mL時與0.5 mL、1.0 mL的吸光度均存在顯著性差異（P＜0.05），與2.0、2.5 mL時的吸光度沒有顯著性差異（P＞0.05）。故選用6.0 mL 10%Na2CO3與1.5 mL FC作為最佳的顯色劑配比。

2.1.3 顯色劑反應溫度與時間的確定 精密移取供試液1.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，加入12.0 mL的去離子水稀釋，加入2.1.2得出最佳顯色劑用量，以溫度（30、40、50、60℃）及時間（10、30、60、90、120、150 min）為變量避光放置，測定其吸光值，實驗結果見表3。

表3 溫度、時間對吸光度的影響Table 3 The effect of the temperature and time on the absorbance

由表3可得溫度、時間對白補藥多酚顯色反應的影響。30℃時，反應時間在10～90 min內(nèi)，隨著時間的增加吸光度增大，溶液變藍并且加深，90 min后吸光值變化趨于平穩(wěn)，表明顯色反應基本完全。40℃時，反應時間在10～30 min內(nèi)，隨著時間的增加吸光度增大，且30 min后，吸光度變化不大，說明顯色反應完全。50～60℃時，隨著反應時間從10 min增至30 min時，吸光度增至最大，30 min后吸光度逐漸減小，這是因為在較高的溫度下多酚氧化速度加快，導致吸光度減小。通過對多酚的穩(wěn)定性及實驗效率的考慮，選擇顯色溫度為40℃，并對40℃下不同反應時間進行差異分析，30、60、90、120、150 min吸光度不存在顯著性差異（P＞0.05），30 min吸光度與10 min時吸光度存在顯著性差異（P＜0.05），故確定顯色溫度為40℃下，避光放置30 min。

2.1.4 精密度、穩(wěn)定性、加標回收率試驗 精密度試驗結果顯示：RSD為1.07%，說明儀器精密度良好。穩(wěn)定性實驗結果顯示：按最佳條件顯色后，待測液在3 h內(nèi)吸光度變化不大，RSD為0.94%，表明該顯色條件在3 h具有較好的穩(wěn)定性。加標回收率平均值為99.40%，RSD為1.75%，說明該方法可靠。

2.1.5 白補藥中多酚含量 稱取5份2 g經(jīng)脫脂、脫色的白補藥粉未，按1.3.1操作得白補藥多酚供試液，根據(jù)最佳顯色條件，即FC試劑用量為1.50 mL，10%Na2CO3用量為6.0 mL，在40℃反應30 min，測得白補藥提取液吸光度，并代入回歸方程計算白補藥中多酚含量。由此計算出白補藥中多酚的平均含量為23.78 mg·g-1。

2.2 白補藥多酚抗氧化能力

2.2.1 白補藥多酚對DPPH·自由基清除能力 參照文獻[17]，稍作修改，吸取1.0 mL濃度分別為，10、30、60、90、120、150 μg·mL-1白補藥多酚提取液于6個10 mL容量瓶，分別加入3.0 mL 0.1 mmol·L-1DPPH·乙醇溶液，用無水乙醇定容，搖勻，室溫下避光放置30 min，在517 nm處測定吸光度。取1.00 mL 60%乙醇代替樣品，在517 nm處測定吸光度A0為對照樣，按公式（1）計算清除率。并與樣品同濃度的Vc和BHT溶液作陽性對照。

測定結果見圖1。

圖1 白補藥多酚、Vc和BHT對DPPH自由基清除能力Fig.1 Scavenging of polyphenol,Vc and BHT for DPPH radical

從圖1知，在選定的濃度范圍內(nèi)，白補藥多酚提取液、Vc和BHT溶液均對DPPH·自由基均有一定的清除率且隨著質(zhì)量濃度增加而增大，對DPPH·自由基的清除率順序為：白補藥總多酚＞Vc＞BHT。差異性分析表明，白補藥多酚、Vc和BHT質(zhì)量濃度對DPPH·自由基清除率的影響均有極顯著差異（P＜0.001）。以白補藥多酚質(zhì)量濃度、Vc和BHT質(zhì)量濃度與DPPH·自由基清除率進行線性回歸，白補藥多酚回歸方程分別為：y=0.3013 x+47.904(r=0.9816)、Vc回歸方程分別為：y=0.3209 x+33.616 (r=0.9852)、BHT回歸方程分別為：y=0.1950 x+23.7(r=0.9905)。由此求得DPPH·自由基清除率50%時所需白補藥多酚、Vc和BHT質(zhì)量濃度，即半抑制質(zhì)量濃度EC50分別為6.96 μg/mL，51.06 μg/mL，134.87 μg/mL。說明白補藥多酚對DPPH·自由基有很強的清除能力。

2.2.2 總抗氧化能力的測定結果 參照文獻[18]，稍作修改，分別取不同濃度的白補藥多酚提取液0.1 mL于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL磷鉬試劑（0.6 mol/L硫酸，28 mmol/L磷酸鈉和4 mmol/L鉬酸銨)，再用蒸餾水定容，混合均勻，于95℃水浴中加熱90 min。冷卻至室溫后，在695 nm波長下測定吸光度，吸光度越大，則總抗氧化能力越強。并與樣品同濃度的Vc和BHT溶液作陽性對照。測定結果見圖2。

圖2 白補藥總多酚、Vc和BHT的總抗氧化能力Fig.2 The total antioxidant capacity of polyphenol,Vc and BHT

從圖2知，白補藥多酚、Vc和BHT隨著質(zhì)量濃度的增大，其吸光度值也增大，說明抗氧化能力增大，并且質(zhì)量濃度與總抗氧化能力呈量效關系。在所給定濃度范圍內(nèi)（10～150 μg·mL-1），在150 μg·mL-1時，總抗氧化能力最強，白補藥多酚、Vc和BHT三者的吸光度分別為：1.097、0.663、0.551，白補藥多酚總抗氧化能力是Vc的1.6倍，是BHT的2倍。差異性分析表明，白補藥多酚、Vc和BHT質(zhì)量濃度對總抗氧化能力的影響均有極顯著差異（P＜0.001）。

2.2.3 白補藥多酚還原力的測定結果 根據(jù)陳磊等[19]的研究，稍作修改，分別取1.0 mL不同濃度的白補藥多酚提取液于離心管中，順次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PH=6.6）1.0 mL、1%鐵氰化鉀溶液1.0 mL，置于55℃水浴中保溫20 min后，迅速冷卻，加入10%三氯乙酸溶液1.0 mL，均勻混合后在3500 r·min-1離心10 min，分別取其上層清液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL蒸餾水及0.2 mL 0.1%的FeCl3溶液，均勻混合，靜置10 min后，在700 nm下測定吸光度，吸光度越大，則還原力越強。分別用與樣品溶液相同濃度的Vc和BHT溶液作為陽性對照。測定結果見圖3。

圖3 白補藥總多酚、Vc和BHT的還原力能力Fig.3 The reducing power capacity of polyphenol,Vc and BHT for DPPH

從圖3知，白補藥多酚、Vc和BHT對Fe3+均有較強的還原能力，且還原能力在所給定濃度范圍內(nèi)（10-150 μg·mL-1）隨樣品濃度的增大而增強。三者還原能力大小序為：白補藥總多酚＞Vc＞BHT。在150 μg·mL-1時，還原力最大，白補藥多酚、Vc和BHT三者的吸光度分別為：0.782、0.637、0.497，白補藥多酚還原力是Vc的1.2倍，是BHT的1.6倍。差異性分析表明，白補藥多酚、Vc和BHT質(zhì)量濃度對還原力的影響均有極顯著差異（P＜0.001）。說明白補藥多酚有較強的還原能力。

3 結論

本研究確定了白補藥多酚的FC法顯色的最佳測定條件：FC比色法測定白補藥多酚含量的適宜條件為：FC試劑1.5 mL，10%Na2CO3溶液6mL、溫度40℃、反應30 min，沒食子酸濃度在1.8～9.0 μg·mL-1的范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關系，相關系數(shù)為R=0.9996，平均回收率為99.40%，RSD為1.75%，說明該方法可靠、簡便，可用于白補藥中多酚含量測定。并首次測定了貴州雷公山野生白補藥多酚的平均含量為23.78 mg·g-1。

通過白補藥多酚對DPPH·自由基的清除率、總抗氧化能力、還原能力測定，并與抗氧化劑Vc、BHT作陽性對照，結果顯示白補藥總多酚、Vc、BHT的抗氧化活性順序為：白補藥總多酚＞Vc＞BHT。白補藥多酚對DPPH·自由基半抑制質(zhì)量濃度EC50為6.96 μg·mL-1，清除率順序為：白補藥總多酚＞Vc＞BHT。白補藥多酚還原力是Vc的1.2倍，是BHT的1.6倍，總抗氧化能力是Vc的1.6倍，是BHT的2倍。研究結果顯示雷公山白補藥多酚具有較強的清除自由基和抗氧化活性，是一種很好的天然抗氧化劑。

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Study on the Determination for Total Polyphenol in Salvia scapiformis HanceandItsRelativeActivities

CAO Hui1,CHANG Fei1,2,GOU Ti-zhong1,2,3
1.College of Chemistry and Material Engineering/Kaili University,Kaili 556011,China
2.Institute of Comprehensive Utilization for Plants/Kaili University,Kaili 556011,China
3.Research Center of Selenium-rich Chinese Herbal Medicine/Kaili University,Kaili 5560111,China

The determination conditions of Folin-Ciocalteu colorimetry with the polyphenol of Salvia scapiformis Hance was researched.The results showed that Folin-Ciocalteu appropriate conditions were 1.5 mL Folin-Ciocalteu,6.0 mL 10% Na2CO3,40oC temperature,30 min reaction time.The method was simple,good stability,high precision and recovery rate. Moreover,antioxidant activity of polyphenol in S.Scapiformis and Vc,BHT was studied,the results showed that the DPPH clearance rate,total antioxidant capacity,and reducing power of polyphenol in S.Scapiformis were higher than Vc and BHT at the same concentration.

Salvia scapiformis Hance;polyphenol;antioxidant activity

R284.2

:A

:1000-2324(2017)02-0273-06

10.3969/j.issn.1000-2324.2017.02.023

2016-12-15

:2017-01-06

貴州省科技廳自然科學基金(黔科合J字[2013]2259號);凱里學院教授專項課題(JS201301);凱里學院博士專項課題(BS201503);凱里學院分析化學重點學科(院科通[2014]157號);貴州省高層次創(chuàng)新人才“千層次”人才計劃項目(黔人領發(fā)[2015]3號);貴州省材料物理與化學特色重點學科資助項目(黔教高發(fā)[2011]208號)凱里學院材料物理與化學重點學科資助項目(院通字[2010]86號)

曹 暉(1963-),女,教授,主要從事天然藥物化學研究.E-mail:CH847190142@163.com