丙戊酸對HL—60/HT細胞P27Kip1、P170表達水平的影響

胡建鋒+尹松梅+謝雙鋒

[摘要] 目的 了解丙戊酸對HL-60/HT細胞P27Kip1的影響。方法 建立白血病耐藥細胞株HL-60/HT，MTT法檢查丙戊酸作用前后細胞增殖情況及對Ara-c耐藥性的改變，流式細胞儀檢測HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1、P170的表達。結(jié)果VPA能增加HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1的表達水平（P<0.05），而不影響P170的表達（P>0.05）；Ara-c不能影響HL-60、HL-60/HT細胞的P27Kip1、P170的表達（P>0.05）；VPA與Ara-C聯(lián)用能增加HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1的表達水平（P<0.05），不影響P170的表達（P>0.05）。結(jié)論 HL-60/HT細胞P27Kip1低于HL-60，丙戊酸能增加HL-60/HT細胞P27Kip1的表達。

[關鍵詞] 白血?。槐焖?；HL-60/HT細胞；耐藥性

[中圖分類號] R733.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2017）06-151-04

[Abstract] Objective To understand the impact of valproic acid to expression level of P27Kip1 and P170 of HL-60/HT cells. Methods Leukemia resistant cell line HL-60/HT was established. MIT method was used to deteccell proliferation before and after valproic acid and its changes to drug resistance of Ara-c. Flow cytometry was used to detect the expression of P27Kip1 and P170 of HL-60 and HL-60/HT cells. Results VPA could increase the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. It did affect the expression of P170（P>0.05）. Ara-c could not affect the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. VPA combined with Ara-C can increase the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. It did affect the expression of P170（P>0.05）. Conclusion P27Kip1 of HL-60/HT cells is lower than HL-60 cells. Valproic acid can the expression of P27Kip1 of HL-60/HT cells.

[Key words] Leukemia； Valproic aci； HL-60/HT cell； Drug resistance

近年白血病發(fā)病率有所上升，其治療方法多采用聯(lián)合化療[1]，60%～70%患者經(jīng)治療后癥狀緩解后復發(fā)。白血病細胞固有或獲得的多藥耐藥性是在治療過程中出現(xiàn)失敗的重要原因[2-5]。多耐藥基因mdr-1表達產(chǎn)物P170起著重要作用。P27Kip1能調(diào)控mdr-1基因的轉(zhuǎn)錄，減少P170表達，逆轉(zhuǎn)多耐藥細胞的耐藥性[6-7]。丙戊酸（VPA）是常用的抗癲癇藥物，治療癲癇具有很好的效果，是一種組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)構(gòu)象和轉(zhuǎn)錄活性，進而影響基因表的的活性藥物。近來研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸能降低HL-60/HT細胞對Ara-c的耐藥性[8]，而丙戊酸是否通過P27Kip1、P170途徑起作用呢？本研究進一步分析了丙戊酸對HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1、P170表達的影響。

1 材料與試劑

本研究所需試劑與材料有RPMI1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜、四氮唑藍、VPA、淋巴細胞分離液、HEPES、羥乙基哌嗪乙磺酸、VCR、HT、Ara-C、HL-60細胞，均由正規(guī)公司及企業(yè)購買。

2 方法

2.1 正常人單個核細胞的分離

選擇10名健康的體檢者，取空腹血置肝素抗凝管，加入D-HankS液平鋪于液面上，混勻后離心約20min，離心后試管內(nèi)分為3層，吸取單個核細胞層，置另一試管中，加入5倍以上容量的D-HankS液，洗滌細胞，最后一次離心后去上清液，然后加入PBS緩沖液，重懸細胞后留用。

2.2 細胞培養(yǎng)及建立耐藥株

將HL-60細胞接種于RPMI-1640完全培養(yǎng)基上，37℃、5%CO2培養(yǎng)增菌，換液1次/2d，4～5d傳代一次。

采用極限稀釋法篩選耐藥的細胞克隆。具體方法為：將對數(shù)期HL-60細胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，建立HL-60/HT耐藥細胞株。HT濃度為0.005μg/mL，2d后換培養(yǎng)液，清洗，去除藥物，繼續(xù)培養(yǎng)2d。經(jīng)3次初始濃度的培養(yǎng)后，藥物濃度增為原來的2倍。5個月后測定HL-60/HT耐藥細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），對多藥耐藥細胞進行確認。

2.3 藥物對兩種細胞的增殖抑制率

通過MTT法檢測Ara-c抑制HL-60/HT、HL-60細胞的增殖情況。取重懸的細胞接種于96孔平板，每孔200μL，約20 000個細胞，5%CO2、37℃條件下孵育24h，然后加入Ara-C。兩組均有無培養(yǎng)液和無藥對照組。48h后每孔加入20μL濃度為5g/L MTT，繼續(xù)孵育4h后除去培養(yǎng)液，每孔加150μL DMSO，置震蕩儀上振蕩10min，采用酶標儀，以無細胞組調(diào)零，測595nm和492nm處的吸光度。細胞生長抑制率=（無藥對照組吸光度均值-實驗組吸光度均值）/無藥對照組吸光度均值×100%[9]。計算各種藥物的IC50。

2.4 耐藥的穩(wěn)定性測定

用無藥RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HL-60/HT子代細胞兩個月，并檢測對HT的IC50值，具體方法參照2.3，確定HL-60/HT細胞耐藥穩(wěn)定性。

2.5 流式細胞術測定P27Kip1、P170的表達

設HL-60和HL-60/HT細胞組，又各分正常人單個核細胞組、藥物（Ara-c、VPA單獨或聯(lián)合）作用前和作用后。將重懸細胞的密度調(diào)整為l×l06/mL，取100μL破膜液A加入到50μL細胞懸液中，并放置于避光的溫室內(nèi)，用2mL PBS緩沖液以1000×g轉(zhuǎn)速離心5min洗滌，棄上清，于細胞懸液中加入破膜液B 100μL和5μL抗P27Kip1也可以是P170抗體，PBS緩沖液洗滌。加入FITC標記二抗5μL，靜置15min后離心洗滌。取1%濃度的多聚甲醛450μL，固定30min，然后用流式細胞儀進行檢測。將P27Kip1或P170抗體換成PBS即可進行空白對照。

2.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS12.0統(tǒng)計軟件處理，計量數(shù)據(jù)的描述用（）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 Ara-c對HL-60、HL-60/HT細胞的IC50

Ara-C對HL-60細胞的中位抑制濃度是0.20μg/mL，對HL-60/HT細胞的中位抑制濃度是0.73μg/mL，耐藥倍數(shù)3.65倍。

3.2 HL-60細胞耐藥穩(wěn)定性檢測

HL-60/HT耐藥株傳代后，用無藥的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)其子代細胞，測定其對HT的IC50，結(jié)果無明顯改變，細胞株的耐藥性能穩(wěn)定。

3.3 細胞表達P27Kip1、P170水平

正常細胞、HL-60細胞及HL-60/HT細胞中P27Kip1表達水平依次降低，兩組間差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；HL-60/HT細胞的P170表達水平明顯高于正常細胞及HL-60細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

3.4 VPA與Ara-c對不同細胞P27Kip1、P170表達水平的影響

HL-60細胞予1mmol/L VPA、0.2μg/mL Ara-c，HL-60/HT細胞予1mmol/L VPA、0.7μg/mL Ara-c各培養(yǎng)48h，流式細胞儀測定P27Kip1、P170的表達水平。結(jié)果提示VPA能增加HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1的表達水平（P<0.05），但對P170表達水平無顯著影響（P>0.05）；Ara-c對P27Kip1、P170的表達水平均無顯著影響（P>0.05），見表1。

3.5 比較VPA與Ara-c聯(lián)用對不同細胞的P27Kip1、P170表達水平影響

HL-60細胞用0.20μg/mL Ara-C，1mmol/L VPA共同培養(yǎng)48h，HL-60/HT細胞用0.70μg/mL Ara-C，1mmol/L VPA共同培養(yǎng)48h，流式細胞儀測定P27Kip1、P170的表達水平。結(jié)果顯示VPA與Ara-C聯(lián)用，能增加敏感HL-60細胞、耐藥HL-60/HT細胞P27Kip1的表達水平（P<0.05），不影響P170的表達（P>0.05），見表2。進一步分析VPA、Ara-c在聯(lián)用用藥中各自對對HL-60、HL-60/HT細胞P27Kip1的影響，結(jié)果提示無論在HL-60細胞還是HL-60/HT細胞，Ara-C對P27Kip1的表達水平無影響（均有P>0.05），VPA單用或聯(lián)用Ara-c均增加P27Kip1的表達水平（均P<0.05），見表3。

4 討論

白血病是血液病中較為常見的疾病，主要是由于造血干細胞異?？寺⌒约膊。陙?，隨著免疫學、細胞學、遺傳學、分子生物學的進步與發(fā)展，加強了對白血病患者的診斷，對白血病的本質(zhì)有了更加深刻的認識。白血病患者的白細胞形態(tài)學具有特異性，可以依靠白細胞的形態(tài)學直接診斷，非典型白血病發(fā)病原因多樣，癥狀復雜，很難及時診斷。據(jù)相關文獻報道，白血病的漏診率為20%～36%，為此加強細胞學、免疫學、遺傳學、分子生物學具有重要的診斷意義。

本研究進一步分析VPA與P27Kip1、P170的關系，了解VPA發(fā)揮作用的可能機制。研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤惡性度增加，P27Kip1的表達逐漸減低[10-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)在正常細胞、HL-60細胞、HL-60/HT細胞中，P27Kip1的表達逐漸減低，提示P27Kip1表達與細胞惡性程度、耐藥情況呈負相關[13-14]，可以監(jiān)測P27Kip1的表達，判斷疾病惡性程度，了解耐藥細胞的產(chǎn)生，預測疾病預后。結(jié)果提示VPA對HL-60，HL-60/HT細胞的P170表達無影響，與其他研究的實驗結(jié)果一致[15]，可能和VPA與丁酸鈉、TSA的具體作用機制不同有關。VPA不增加白血病細胞P170的表達，相比于丁酸鈉、TSA更有希望成為應用于臨床的化療增敏劑。

耐藥白血病HL-60/HT、HL-60、P170細胞P27Kip 1的表達敏感度存在差異，敏感性最強的為P170，HL-60敏感性最弱，丙戊酸鈉可影響P27Kip 1的表達，增加G1期細胞含量，發(fā)揮抗腫瘤活性；同時，VPA可增強HL-60/HT細胞對Ara-C的敏感性，減輕其耐藥性，起到化療增敏的作用。丙戊酸鈉口服、攜帶方便，對正常細胞毒性低，具有抗腫瘤活性和增加化療敏感性的作用，可作為治療耐藥白血病輔助藥物。其作用機制尚不明確，有待進一步研究。

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（收稿日期：2017-01-02）