不同添加水平的芽孢桿菌制劑對育雛期蛋雞腸道微生物區(qū)系及部分生理指標的影響

王 政，張大偉，齊長海，袁 江，王 嬌

（青島根源生物技術(shù)集團有限公司，山東青島 266000）

不同添加水平的芽孢桿菌制劑對育雛期蛋雞腸道微生物區(qū)系及部分生理指標的影響

王 政*，張大偉，齊長海，袁 江，王 嬌

（青島根源生物技術(shù)集團有限公司，山東青島 266000）

本試驗旨在研究在蛋雞日糧中添加不同水平芽孢桿菌制劑對育雛期蛋雞腸道微生物區(qū)系和部分生理指標的影響。試驗選用180只1日齡海蘭褐蛋雞，隨機分為4組，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組在基礎(chǔ)日糧中分別添加50、100、200 g/t芽孢桿菌制劑，飼喂至22日齡時采樣分析。結(jié)果表明：試驗組雞腸道食糜中乳酸桿菌數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），試驗組空腸食糜的pH顯著低于對照組（P＜0.05），200 g試驗組乳糖酶酶活和空腸絨毛高度都顯著高于其他各組（P＜0.05），100 g和200 g試驗組體增重顯著高于對照組和50 g試驗組（P＜0.05）；微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，日糧中添加芽孢桿菌制劑后腸道食糜中微生物多樣性呈增加趨勢。本試驗表明，芽孢桿菌制劑可改善育雛期蛋雞的腸道微生物區(qū)系，促進育雛期蛋雞的消化吸收并提高活體重。

芽孢桿菌制劑；育雛期蛋雞；微生物區(qū)系；生理指標

微生態(tài)制劑是近年發(fā)展起來的一種新型飼料添加劑，具有提高動物生產(chǎn)性能、對動物無毒無害、無殘留等特點。目前市場上應用較多的微生態(tài)制劑產(chǎn)品主要是芽孢桿菌、酵母菌、乳球菌和乳酸桿菌。從動物生產(chǎn)和飼料加工的角度分析，芽孢桿菌比其他有益菌具有更多優(yōu)勢。芽孢桿菌是廣泛分布于自然界的需氧性細菌，在機體腸道內(nèi)通過生物奪氧作用，促進厭氧的有益微生物的生長；在芽孢桿菌生長繁殖過程中，能產(chǎn)生抑制某些有害微生物的代謝產(chǎn)物，有助于恢復腸道微生態(tài)平衡，因而其研究和應用受到廣泛重視。本試驗在蛋雞日糧中添加根源集團芽孢桿菌制劑（蛋禽產(chǎn)品，下同），考察不同添加水平的芽孢桿菌制劑對育雛期蛋雞腸道微生物區(qū)系和部分生理指標的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 選取180只1日齡海蘭褐蛋雞，隨機分為4組，每組3個重復（即3個欄位），每個重復15只雞，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，飲水中不添加微生態(tài)制劑，3個試驗組在基礎(chǔ)日糧中分別添加50、100、200 g/t芽孢桿菌制劑（試驗1、2、3組）。預試期7 d，22日齡取樣分析。試驗用的芽孢桿菌制劑為青島根源生物技術(shù)集團提供，成分為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酪酸菌和凝結(jié)芽孢桿菌，活菌數(shù)≥2.4×1010cfu/g。各處理組均采用階梯式籠養(yǎng)，飼喂次數(shù)、舍內(nèi)溫度、濕度、光照、通風等飼養(yǎng)管理條件均保持一致，自由采食、飲水，并按同一正常免疫程序進行免疫接種。試驗所用飼料是根據(jù)白羽肉雞不同時期營養(yǎng)需求制作的配合飼料，試驗基礎(chǔ)日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。

1.2 樣品采集及測定指標 各處理組飼喂至22日齡，從每個處理組隨機取出3只雞禁食12 h后屠宰，取盲腸食糜分析大腸菌群和乳酸桿菌數(shù)量、微生物多樣性、空腸食糜pH、空腸絨毛高度以及空腸絨毛膜刷狀緣雙糖酶酶活，同時記錄各組蛋雞體增重。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎(chǔ)）

1.2.1 盲腸微生物計數(shù) 于無菌操作臺無菌稱取盲腸食糜1 g，加入9 mL滅菌生理鹽水，充分搖勻后進行逐級10倍稀釋，選擇3個較為合適的稀釋梯度進行接種培養(yǎng)，每個稀釋濃度設3個重復。取所選定的梯度100 μL細菌稀釋液接種到相應的培養(yǎng)基上，大腸桿菌37℃培養(yǎng)24 h，乳酸桿菌37℃培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)完后選擇同一稀釋度3個重復菌落數(shù)相差不大的平板進行計數(shù)，平板上的菌落數(shù)要求在30～300。

1.2.2 微生物多樣性分析 參照Muyzer等[1]的方法，對細菌16S rDNA的V6-V8可變區(qū)的擴增產(chǎn)物進行微生物多樣性分析。使用8%聚丙烯酰胺凝膠（含丙酰胺、雙丙酰胺、尿素、甲酰胺和甘油），其中尿素濃度梯度為35%～55%，電泳采用D code DGGE系統(tǒng)，先在200 V電壓電泳5～10 min，隨后在75 V固定電壓下電泳18 h。電泳后，硝酸銀染色，凝膠經(jīng)密度校正儀掃描。DGGE凝膠用Molecular Analyst 1.12進行多樣性分析。由已知細菌克隆組成的參考樣品形成的DGGE圖譜作為位置校正的標準圖譜，校正后每個樣品的圖譜經(jīng)軟件轉(zhuǎn)化后均能產(chǎn)生一條密度曲線，根據(jù)密度曲線對DGGE譜帶進行多樣性指數(shù)分析。

1.2.3 空腸食糜pH分析 使用pH B-8型筆式pH計（上?？祪x儀器有限公司）測定空腸食糜pH。

1.2.4 空腸絨毛高度測定 將空腸腸段樣品置于4%多聚甲醛固定液中固定24 h，流水沖洗48 h，經(jīng)逐級遞增梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋，制成石蠟切片，切片脫蠟、入水，蘇木精-伊紅染色、封片，觀察各腸段組織形態(tài)。用高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)做定量分析，測定空腸絨毛高度。

1.2.5 空腸絨毛膜刷狀緣雙糖酶酶活測定 參照張曉利[2]的方法，用載玻片收集空腸黏膜0.5 g左右于離心管中，在管中加入4.0 mL 0.1 mol/L的馬來酸緩沖液（PH 6.8），冰浴勻漿后，3 000 r/min離心10 min，取上清液用于測定空腸黏膜雙糖酶活性。取0.1 mL黏膜上清液加入0.1 mL 0.056 mol/L麥芽糖、蔗糖或乳糖，在37℃水浴中準確反應30 min，立即在沸水浴中終止反應，冷卻后于SBA生物傳感儀測雙糖酶含量。

1.3 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Excel 初步處理后，利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，如果方差分析結(jié)果顯著，則采用LSD法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌制劑對育雛期海蘭褐蛋雞腸道微生物區(qū)系及空腸pH的影響 如表2所示，試驗組腸道食糜中乳酸桿菌數(shù)顯著高于對照組（P＜0.05），而試驗組大腸桿菌數(shù)與對照組相比沒有顯著差異（P＞0.05），表明芽孢桿菌制劑能夠促進育雛期蛋雞腸道內(nèi)乳酸桿菌的生長。試驗1組的乳酸桿菌/大腸桿菌平均值最高（1.35），但與其他各組沒有顯著性差異（P＞0.05）。各試驗組空腸食糜pH顯著低于對照組（P＜0.05），表明芽孢桿菌制劑能降低空腸食糜的pH。

表2 芽孢桿菌制劑對育雛期海蘭褐蛋雞腸道微生物區(qū)系及空腸pH的影響

圖1 芽孢桿菌制劑對育雛期蛋禽腸道食糜微生物多樣性的影響

2.2 芽孢桿菌制劑對育雛期海蘭褐蛋雞腸道食糜微生物多樣性的影響 如圖1所示，圖譜上的條帶反映了腸道內(nèi)容物中的優(yōu)勢菌群，條帶的數(shù)量和位置的復雜性說明了菌群的多樣性。多樣性分析結(jié)果表明，日糧中添加芽孢桿菌制劑后腸道食糜中微生物多樣性呈增加趨勢，但與對照組相比沒有達到顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 芽孢桿菌制劑對育雛期海蘭褐蛋雞部分生理指標的影響 如表3所示，各試驗組的蔗糖酶酶活與對照組之間沒有達到顯著性差異（P＞0.05），表明芽孢桿菌制劑對蔗糖酶的酶活沒有顯著性影響；各試驗組空腸絨毛膜刷狀緣的乳糖酶酶活隨芽孢桿菌制劑添加量升高呈現(xiàn)出增加的趨勢，表明芽孢桿菌制劑可以提高乳糖酶的酶活；試驗2組的麥芽糖酶酶活顯著低于其他各組（P＜0.05）。

表3 芽孢桿菌制劑對育雛期空腸絨毛膜刷狀緣雙糖酶酶活的影響 mol/L

2.4 芽孢桿菌制劑對育雛期海蘭褐蛋雞空腸絨毛高度的影響 如表4所示，200 g/t芽孢桿菌制劑顯著增加了空腸絨毛高度（P＜0.05），表明芽孢桿菌制劑有助于育雛期蛋雞對營養(yǎng)的吸收。

2.5 芽孢桿菌制劑對育雛期蛋禽活體重的影響 由表5可知，試驗組2、3組海蘭褐蛋雞活體重顯著高于對照組和試驗1組（P＜0.05），表明芽孢桿菌制劑可促進育雛期蛋雞的體增重。

表4 芽孢桿菌制劑對育雛期蛋禽空腸絨毛高度的影響 μm

表5 芽孢桿菌制劑對育雛期海蘭褐蛋雞活體重的影響 kg/只

3 討 論

某些芽孢桿菌菌株可刺激有益菌生長，并抑制有害菌，從而改善腸道微生物區(qū)系。Maruta等[3]報道，在雞的日糧中添加枯草芽孢桿菌C-3102可降低空腸彎曲桿菌的數(shù)量，并減少感染雞群的發(fā)病率。Kamata等[4]發(fā)現(xiàn)，東洋芽孢桿菌促進了乳酸桿菌的繁殖，顯著減少感染了鼠傷寒沙門氏菌雞腸道中沙門氏菌的數(shù)量，促進了營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。本試驗研究結(jié)果表明，芽孢桿菌制劑促進了育雛期海蘭褐蛋雞腸道內(nèi)乳酸桿菌的生長，降低了空腸食糜的pH，并且日糧中添加芽孢桿菌制劑后腸道食糜中微生物多樣性呈現(xiàn)出增加的趨勢，說明芽孢桿菌制劑有助于改善海蘭褐蛋雞腸道微生物區(qū)系。

關(guān)于微生態(tài)制劑對動物消化吸收的影響已有報道。Dunham等[5]給雞飼喂羅伊氏乳酸桿菌，發(fā)現(xiàn)試驗組回腸的絨毛更長，隱窩更深，表明羅伊氏乳酸桿菌可改善腸道健康，增強腸道功能，從而有利于營養(yǎng)吸收。Schneitz等[6]報道，用益生素處理促進了有機物的消化吸收。本試驗中，200 g試驗組的乳糖酶酶活和空腸絨毛高度都顯著高于其他各組，表明芽孢桿菌制劑促進了育雛期海蘭褐蛋雞的消化吸收。

芽孢桿菌提高動物生長性能的機理可能包括幾個方面：改善腸道功能[7]、具有抗菌活性[8-9]、刺激固有或/和體液免疫系統(tǒng)[10-11]。Fritts等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在肉仔雞日糧中添加枯草芽孢桿菌C-3102促進了生長后期雞的體增重和飼料轉(zhuǎn)化率。Santoso等[13]在肉仔雞的日糧中加入干燥的枯草芽孢桿菌增加了飼料轉(zhuǎn)化率并減少了腹部脂肪。Jin等[14]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比枯草芽孢桿菌促進了體增重。本試驗中100 g和200 g試驗組體增重顯著高于對照組和50 g試驗組，表明芽孢桿菌制劑增加了育雛期海蘭褐蛋雞的體增重。

4 結(jié) 論

本試驗顯示，在海蘭褐蛋雞日糧中添加芽孢桿菌制劑可提高育雛期蛋雞腸道食糜中的乳酸桿菌，并可降低空腸食糜的pH，腸道微生物多樣性也呈現(xiàn)出增加的趨勢，表明芽孢桿菌制劑有助于改善育雛期蛋禽的腸道微生物區(qū)系。添加芽孢桿菌制劑還提高了試驗組的乳糖酶酶活和空腸絨毛高度，增加了育雛期蛋雞的活體重。本試驗中在基礎(chǔ)日糧中添加200 g/t的芽孢桿菌制劑為最適添加量。

[1]Muyzer G, de Waal E C, Uitterlinden A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction amplified genes encoding for 16S rRNA[J]. Appl Enviorn Microbiol, 1993, 59: 695-700.

[2]張曉利. 白頭翁復方對腹瀉小鼠腸道粘膜雙糖酶的影響[D]. 保定: 河北農(nóng)業(yè)大學, 2010.

[3]Maruta K, Miyazaki H, Masuda S,et al. Exclusion of intestinal pathogens by continuous feeding withBacillus subtilisC-3102 and its influence on the intestinal microflora in broilers[J]. Feed Anim Sci Tech, 1996, 67: 273-280.

[4]Kamata S I, Kakiichi N, Uchida K. Effect of continuous Toyocerin administration in the feed of chicken experimentally infected withSalmonella Typhimurium[J]. Anim Husb, 1990, 44: 385-388.

[5]Dunham H J, Wiliams C, Edens F W,et al. Lactobacillus reuteri immunomodulation of stressor associated diseases in newly hatched chickens and turkeys[J]. Poult Sci, 1993, 72 (S2): 103.

[6]Schneitz C, Khskinen T, Toivonen V,et al. Effect of Broilact on the physicochemical conditions and nutrient digestibility in the gastrointestinal tract of broilers[J]. Poult Sci, 1998, 77: 426-432.

[7]Samanya M, Yamauchi K. Histological alternations of intestinal villi in chickens fed dried Bacillus subtilis var. natto[J]. Comp Biochem Physiol, 2002, 133 (Part A): 95-104.

[8]La Ragione R M, Casula G, Cutting S M,et al.Bacillus subtilisspores competitively exclude Escherichia coli O78:K80 in poultry[J]. Vet Microbiol, 2001, 79: 133-142.

[9]Pinchuk I V, Bressollier P, Verneuil B,et al. In vitro anti-Helicobacter pyloriactivity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics[J]. Antimicrob Agents Ch, 2001, 45: 3156-3161.

[10]Molnár A K, Podmaniczky B, Kürti P,et al. Influence ofBacillus subtilison broiler performance[C]. Hungary: World poultry science association, 15th European Symposium on Poultry Nutrition, 2005.

[11]Haghighi H R, Gong J, Gyles C L,et al. Probiotics stimulate production of natural antibodies in chickens[J]. Clin Vaccine Immunol, 2006, 13: 975-980.

[12]Fritts C A, Kersey J H, Motl M A,et al.Bacillus subtilisC-3102 (Calsporin) improves live performance and microbiological status of broiler chickens[J]. J App Poult Res, 2000, 9: 149-155.

[13]Santoso U, Tanaka K, Ohtani S. Effect of trialBacillus subtilisculture on growth, body composition, and hepatic lipogenic enzyme activity in female broiler chicks[J]. Br J Nutr, 1995, 74: 523-529.

[14]Jin L Z, Ho Y W, Abdullah N,et al. Influence of driedBacillus subtilisand lactobacilli cultures on intestinal microflora and performance in broilers[J]. Asian Austral J Anim Sci, 1996, 9: 397-403.

S816.7

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-156

2017-04-11；

2017-04-24

王政（1977-），男，河南人，博士，研究方向為動物消化道微生物，E-mail：wangzheng1977@126.com

*通訊作者