珙桐CAC基因的克隆及其作為內(nèi)參基因的評價

任銳 戴鵬輝 曹福祥 董旭杰 李萌

（中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院，長沙 410004）

珙桐CAC基因的克隆及其作為內(nèi)參基因的評價

任銳 戴鵬輝 曹福祥 董旭杰 李萌

（中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院，長沙 410004）

從珙桐（Davidia involucrata Baill.）中克隆到一個編碼網(wǎng)格蛋白銜接蛋白復合物（Clathrin adaptor complexes，CAC）的基因，命名為DiCAC（GenBank登錄號為KX268525）。該基因開放閱讀框全長1 317 bp，編碼438個氨基酸。同源序列比對與聚類分析表明，該基因與其它15種植物的CAC氨基酸序列的相似度達到94%以上，其中與葡萄CAC的氨基酸序列同源性最高。為評價該基因作為珙桐內(nèi)參基因的可行性，結合5個珙桐管家基因（ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA），采用半定量PCR和實時熒光定量PCR對DiCAC基因在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中的表達穩(wěn)定性進行分析，并與常見管家基因的穩(wěn)定性進行比較，結果表明，該基因在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中均為穩(wěn)定表達，且表達穩(wěn)定性優(yōu)于常見管家基因，可以作為相關基因表達研究中的內(nèi)參基因。首次克隆到珙桐CAC基因，并且明確了其作為內(nèi)參基因的可行性，為深入研究珙桐相關基因的表達分析提供了候選內(nèi)參基因資源。

DiCAC；內(nèi)參基因；苞片；珙桐

隨著分子生物學的發(fā)展，基因表達分析在發(fā)現(xiàn)和預測新基因及其功能、探究基因表達調控的復雜網(wǎng)絡等研究中日趨重要。實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是在傳統(tǒng)PCR技術基礎上發(fā)展起來的一種新的核酸定量技術，具有重復性好、靈敏度高、特異性強、高通量等特點，已成為分子生物學研究中檢測基因表達水平的一種重要方法［1］。在qPCR分析過程中，RNA的質量、cDNA的質量與起始濃度、擴增效率等都會對結果的準確性產(chǎn)生影響，因此，必須選擇合適的內(nèi)參基因進行校正和標準化［2］。理想內(nèi)參基因應該在特定試驗條件下的所有細胞或組織中均相對穩(wěn)定地表達，不會受到任何內(nèi)源性或外源性因素的影響。常用的內(nèi)參基因主要有肌動蛋白基因（ACT）、轉錄延伸因子基因（EF1α）、α/β微管蛋白基因（TUA/ TUB）、18S/25S核糖體RNA基因（18S/25S rRNA）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）等管家基因。近年來隨著基因芯片技術和轉錄組測序等研究的深入，新的內(nèi)參基因也不斷被挖掘，如網(wǎng)格蛋白銜接蛋白復合物基因（CAC）、SAND蛋白家族基因（SAND）、PPR蛋白家族基因（PPR）、F-box蛋白家族基因（F-box）、ABC轉運因子基因等［3-5］。但是，大量研究表明，隨著研究對象的不同或者試驗條件的變化，沒有任何一種內(nèi)參基因的表達是始終穩(wěn)定的，即內(nèi)參基因的選擇不存在通用性［6］。因此，在研究目標基因的表達情況時，研究者必須首先在具體試驗條件下對內(nèi)參基因進行篩選與驗證，然后再選擇合適的內(nèi)參基因用于校準，這是保證qPCR分析結果準確性的重要前提。

珙桐（Davidia involucrata Baill.），又名鴿子樹，為珙桐科珙桐屬落葉喬木，是我國特有的單型屬珍稀孑遺植物，屬于國家Ⅰ級保護植物［7］。在我國，珙桐主要分布于四川、重慶、湖北、貴州、湖南、云南、甘肅等省市。珙桐是著名觀賞樹種，具有一些獨特的生物學性狀，如圓形的頭狀花序、對生的白色葉狀苞片等。對珙桐獨特的生物學表型展開研究，從分子生物學水平上闡述其特異器官發(fā)育的調控規(guī)律，尋找關鍵調控基因，是珙桐分子生物學研究的重要方向。目前，有關珙桐中關鍵基因的克隆，基因的表達模式分析及功能研究等相對較少，而在已有的少量報道中，均選擇常見管家基因（如ACT、18S rRNA等）作為內(nèi)參基因，但所選用基因是否適合作為該研究中的內(nèi)參基因，尚缺乏一定理論依據(jù)［8，9］。因此，在珙桐分子生物學研究中，需要發(fā)掘更多具有較高表達穩(wěn)定性的內(nèi)參基因，這對于提高珙桐基因表達研究的準確性至關重要。

CAC（Clathrin adaptor complexes）， 即 AP2M（Adaptor protein-2 Mu-adaptin），是細胞中的一類銜接蛋白（Adaptor protein，AP）。銜接蛋白指在細胞內(nèi)信號傳遞過程中，在蛋白質間起連接作用的一類蛋白質，進化上比較保守。植物中共有5種類型的AP復合體，即AP-1、AP-2、AP-3、AP-4、AP-5，每個AP復合體均由2個大亞基（α和β）、一個中亞基（μ）和一個小亞基（σ）組成。其中，AP-2復合體存在于質膜上，在網(wǎng)格蛋白介導的質膜內(nèi)吞過程中發(fā)揮重要作用［10，11］。植物中對CAC基因的研究還不夠深入，有關其具體生物學功能的報道也較少。但近年來有研究表明，在一些植物中，CAC可作為特定條件下的內(nèi)參基因應用于基因表達分析中。例如，Czechowski等［3］利用擬南芥Affymetrix ATH1全基因組基因芯片數(shù)據(jù)，篩選出了在擬南芥不同組織以及非生物脅迫下均能穩(wěn)定表達的22個基因，并結合5個管家基因（ACT2、EF-1α、GAPDH、UBQ10、UBC），對它們的表達穩(wěn)定性進行評價，結果發(fā)現(xiàn)，篩選出的新內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性普遍優(yōu)于管家基因，并且新內(nèi)參基因CAC（AT5G46630）具有較高的表達穩(wěn)定性。隨后，在番茄、蕎麥、竹子、鷹嘴豆、西瓜等植物中的相關研究也表明，CAC可作為內(nèi)參基因使用［12-16］。

目前，很多植物的基因表達分析中都選用了CAC作為內(nèi)參基因，而有關珙桐CAC基因的研究尚未見報道。為此，本研究克隆珙桐CAC基因，并對其進行相關生物信息學分析。同時，結合5個管家基因（ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA），利用半定量PCR、qPCR以及內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件探討DiCAC在珙桐不同組織的表達穩(wěn)定性。同時，白色苞片是珙桐代表性狀，苞片的發(fā)育機制研究是本課題組今后的研究重點，因此也對DiCAC在不同發(fā)育階段苞片中的表達穩(wěn)定性進行分析，旨在為珙桐分子生物學研究提供新的、穩(wěn)定的內(nèi)參基因資源，為進一步研究珙桐的基因表達模式，揭示珙桐苞片發(fā)育的分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究供試材料為珙桐，采集地位于湖南省張家界市桑植縣八大公山國家級自然保護區(qū)，采集時間為2016年4月中旬至7月下旬。廖春林對采集樣品進行了鑒定，確定采集材料均為珙桐樣品，所有采集的珙桐樣品均保存于本實驗室。本研究中，主要選擇保護區(qū)內(nèi)樹齡20年左右，能穩(wěn)定開花的珙桐植株作為采集對象，分別采集以下兩組樣品，第一組，不同組織樣品，共8種：根、莖、芽、葉片、苞片（中期）、雄蕊、果肉、種子；第二組，不同發(fā)育階段苞片樣品，參照Vekemans等［8］的分類方法具體分為：幼期苞片（綠色）、前期苞片（淺綠色）、中期苞片（純白色）、后期苞片（淺黃色）、晚期苞片（黃色待脫落）。每份樣品包括3個生物學重復，所有樣品采集后立即置于液氮中速凍保存，然后置于-70℃超低溫冰箱中貯藏備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 分別稱取適量凍存珙桐樣品，于盛有液氮的研缽中迅速研磨至粉末，按照E.Z.N.A.TM Plant RNA ProtocolⅡ（Omega）法提取各樣品的總RNA，并采用RQ1 RNase-Free DNase（Promega）去除基因組DNA。隨后，按照5×PrimeScriptRTMaster Mix（PerfeCt Real Time）試劑盒（TaKaRa）操作說明反轉錄合成cDNA第一鏈，紫外分光光度計檢測所得cDNA的濃度，并將各樣品的cDNA濃度統(tǒng)一至100 ng/μL，分別用于目標基因克隆、半定量PCR和qPCR的表達分析。

1.2.2 目標基因克隆及序列分析 將TAIR（The Arabidopsis Information Resource）數(shù)據(jù)庫中擬南芥CAC基因（登錄號為AT5G46630）的核酸序列與本研究小組前期構建的珙桐轉錄組數(shù)據(jù)庫［17］中的基因序列進行本地BLAST比對，獲得一條同源性較高的片段c44712.graph_c0。根據(jù)其ORF序列信息設計基因特異性擴增引物DiCAC-F1（5'-GGAAAGATGCCGGTGGCTGCT-3'）和DiCAC-R1（5'-CTAGGACCTAATCTCATAT GAACCA-3'）。以珙桐苞片cDNA為模板，PCR擴增程序如下：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，51℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收純化，與pMD18-T載體（TaKaRa）連接，轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆送往鉑尚生物技術有限公司測序。

利用ProtParam、ProtScale、Psort等在線軟件對該基因編碼的氨基酸序列進行組成成分、理化性質、亞細胞定位預測等初步分析；利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列的比對及同源性分析；利用MEGA 5.0軟件Neighbor joining（NJ）算法進行聚類分析。

1.2.3 目標基因及5種管家基因作為內(nèi)參基因的穩(wěn)定性評價 從珙桐轉錄組數(shù)據(jù)庫中獲得c44712. graph_c0與5個管家基因（ACT7、EF1a、GAPDH、β-TUB、18S rRNA）的序列信息，根據(jù)qPCR引物設計原則，通過網(wǎng)站IDTdna（http://eu.idtdna.com/pri merquest）設計各內(nèi)參基因的qPCR引物（表1），引物序列由上海生工公司合成。qPCR反應體系為10 μL，包括SYBR Green Master Mix（High ROX）（Biotool）5 μL、2 μmol/L Forward Primer 2 μL、2 μmol/L Reverse Primer 2 μL、100 ng/μL cDNA 1 μL；反應程序為：95℃ 5 min，95℃ 15 s，60℃ 40 s，40 cycles。

將所得qPCR數(shù)據(jù)進行整理，利用在線分析軟件ReFinder（http://fulxie.0fees.us/?type=reference&i=1）分別對此6個內(nèi)參基因在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中的表達穩(wěn)定性進行評價。ReFinder整合了4種常用于內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價的方法：即geNorm、Normfinder、BestKeeper和ΔCt值分析法［18-21］。ReFinder程序首先分別用上述 4種方法對所有內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性進行評價并給出排名，然后計算各基因由不同方法所得的排名的幾何平均值，以此作為綜合評價指數(shù)，指數(shù)數(shù)值越小，表明基因表達越穩(wěn)定［22］。

1.2.4 目標基因表達分析 在珙桐不同組織中，以EF1a（ReFinder軟件分析結果中EF1a的表達穩(wěn)定性綜合排名位于最末）作為對照，進行DiCAC的半定量PCR及qPCR表達分析；在不同發(fā)育階段苞片中，以GAPDH（ReFinder軟件分析結果中GAPDH的表達穩(wěn)定性綜合排名位于最末）作為對照，進行DiCAC的半定量PCR及qPCR表達分析。qPCR表達分析計算公式為：Q（相對表達量）=2ΔCt，ΔCt=Ct（葉芽）-Ct（其它組織）或ΔCt=Ct（幼期苞片）-Ct（其它苞片），應用SPSS 17.0軟件對基因的相對表達量進行差異顯著性分析。半定量PCR的基因引物序列及擴增程序，見表2。

表1 內(nèi)參基因的qPCR引物序列及擴增特性

表2 基因的半定量PCR引物序列及擴增程序

圖1 DiCAC基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖

2 結果

2.1 珙桐DiCAC基因全長cDNA克隆與序列分析

以珙桐葉片cDNA為模板，對珙桐CAC基因的ORF序列進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在接近1 500 bp處有一條清晰亮帶（圖1）。經(jīng)測序，該序列長度為1 317 bp，編碼438個氨基酸，編碼產(chǎn)物與擬南芥CAC基因同源性達94%，確認其為一個珙桐的CAC基因，將其命名為DiCAC，已在GenBank上注冊，登錄號為KX268525。

對DiCAC編碼的氨基酸序列進行初步的理化性質分析。該氨基酸的相對分子量大小約為49.20 kD，理論等電點為9.34。氨基酸組成中，含量最多的3種氨基酸依次為纈氨酸（10.3%）、亮氨酸（8.2%）、賴氨酸（8.0%），且堿性氨基酸（賴氨酸8.0%，精氨酸5.3%、組氨酸0.2%）含量略多于酸性氨基酸（天冬氨酸3.9%、谷氨酸6.2%）。總平均親水系數(shù)為-0.039，其中，第23位的酪氨酸親水性最強，第70位的異亮氨酸疏水性最強。亞細胞定位預測其有56.5%的幾率定位于細胞質內(nèi)。

2.2 珙桐DiCAC基因的同源性分析與聚類分析

將DiCAC基因序列在NCBI網(wǎng)站上進行Blast X同源性比對分析，結果表明，DiCAC氨基酸序列與葡萄（Vitis vinifera）、棗（Ziziphus jujuba Mill.）、甜橙（Citrus sinensis）、可可（Theobroma cacao）、蓖麻（Ricinus communis）、 蓮（Nelumbo nucifera） 的CAC氨基酸序列相似度較高，同源性達到97%，其次，與胡楊（Populus euphratica）、無油樟（Amborella trichopoda）、 蘋 果（Malus x domestica）、 煙 草（Nicotiana tabacum Linn.）、大豆（Glycine max）的同源性達到96%，與巨桉（Eucalyptus grandis）、番茄（Solanum lycopersicum）的同源性達到96%，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）的同源性達到94%。說明本研究中克隆到的基因為珙桐中CAC基因，且該基因在木本植物中較為保守。

將DiCAC氨基酸序列與篩選出的同源性較高的10種植物CAC氨基酸序列進行多重比較，結果（圖2）表明，不同植物的CAC氨基酸序列只在個別位置有突變發(fā)生，其中，珙桐DiCAC基因與其它10種植物CAC基因編碼的氨基酸共有8個位點的差異，分別是37位的M（甲硫氨酸）/I（異亮氨酸）、38位的H（組氨酸）/N（天冬酰胺）、80位的C（半胱氨酸）/S（絲氨酸）、308位的V（纈氨酸）/I（異亮氨酸）、388位的T（蘇氨酸）/N（天冬酰胺）0、389位的R（精氨酸）/K（賴氨酸）、431位的A（丙氨酸）/G（甘氨酸）、438位的C（半胱氨酸）/S（絲氨酸）。

為了進一步探討珙桐DiCAC基因與其它植物CAC基因之間的進化關系，選取一致性較高的16種植物的CAC基因的編碼產(chǎn)物氨基酸序列進行聚類分析，結果（圖3）表明，DiCAC與葡萄（Vitis vinifera）CAC蛋白的親緣關系最近，其次與可可（Theobroma cacao）CAC蛋白具有相對較近的親緣關系，而與巨桉（Eucalyptus grandis）、煙草（Nicotiana tabacum Linn.）、 番 茄（Solanum lycopersicum） 等其它植物CAC蛋白組成的小進化群體則親緣關系較遠。

2.3 珙桐DiCAC基因及5種管家基因的相對表達豐度分析

表1中各基因引物的擴增效率大于94%，相關系數(shù)R2＞0.98，可知各基因引物的擴增效率良好，能用于qPCR分析。基因的Ct值與表達豐度成反比，Ct值越小，基因的表達豐度越高，反之亦然。首先通過qPCR檢測6個內(nèi)參基因在珙桐樣品中的的Ct值，然后對它們的表達豐度進行比較。結果表明，在不同組織中，6個基因當中18S rRNA的Ct值在12-24之間，表達豐度最高，CAC的Ct值在26-30之間，表達豐度最低（圖4-A）；在不同發(fā)育階段的苞片中，6個基因當中18S rRNA的Ct值在12-18之間，表達豐度最高，β-TUB的Ct值在28-32之間，表達豐度最低，CAC的Ct值在27-29之間，表達豐度僅略高于β-TUB（圖4-B）。

此外，通過比較發(fā)現(xiàn)，在珙桐兩組樣品中，CAC的Ct值在不同樣品間的變化范圍均相對較小，數(shù)據(jù)較為集中，尤其是在不同發(fā)育階段的苞片樣品中，Ct值的波動范圍更??；而5個管家基因的Ct值在不同樣品間變化范圍相對較大，數(shù)據(jù)較為分散。初步判斷可知，珙桐CAC基因在不同組織與不同發(fā)育階段苞片中的的表達均較為穩(wěn)定（圖4）。

2.4 珙桐DiCAC基因及5種管家基因作為內(nèi)參基因

的穩(wěn)定性評價

利用ReFinder軟件，對6個內(nèi)參基因在珙桐不同組織中的表達穩(wěn)定性進行評價，結果顯示（表3），在ΔCt值分析法與NormFinder算法結果中，穩(wěn)定性排名第一的均為ACT7，排名第六的均為EF1a；在BestKeeper與Genorm算法結果中，穩(wěn)定性排名第一的均為CAC，排名第六的分別為18S rRNA和EF1a；不同算法結果中，6個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名并不完全一致，經(jīng)采用幾何平均值法綜合分析后，基因的表達穩(wěn)定性由高到低依次為：CAC＞ACT7＞β-TUB＞18S rRNA＞GAPDH＞EF1a。

利用ReFinder軟件，對6個內(nèi)參基因在珙桐不同發(fā)育階段苞片中的表達穩(wěn)定性進行評價，結果顯示（表4），除在ΔCt值分析法算法結果中穩(wěn)定性排名第一的為ACT7外，在其余的BestKeeper、NormFinder、Genorm 3種算法結果中，穩(wěn)定性排名第一的均為CAC；另外，在ΔCt值分析法、BestKeeper、NormFinder、Genorm 4種算法結果中，穩(wěn)定性排名第六的均為GAPDH；同樣，4種算法結果中，6個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名并完全一致，經(jīng)采用幾何平均值法綜合分析后，基因的表達穩(wěn)定性由高到低依次為：CAC＞ACT7＞18S rRNA＞ EF1a＞β-TUB＞GAPDH。對6個內(nèi)參基因分別在珙桐兩組樣品中的表達穩(wěn)定性綜合排名進行比較，分析可知，在此兩組樣品中，基因表達穩(wěn)定性排名居于首位的均為CAC，而穩(wěn)定性排名最末位的為不同基因，在不同組織中為EF1a，在不同發(fā)育階段苞片中為GAPDH。

圖2 珙桐CAC氨基酸序列與其它植物CAC氨基酸序列的多重比對分析

圖3 珙桐CAC氨基酸序列與其它植物CAC氨基酸序列的聚類分析

圖4 6個內(nèi)參基因在珙桐不同樣品中的Ct值分布

2.5 珙桐DiCAC基因表達分析

CAC和EF1a基因在洪洞不同組織中的半定量PCR電泳結果表明（圖5）：對照基因EF1a在珙桐莖、芽、苞片（中期）、種子中的表達量較高，而在根、葉片、雄蕊、果肉中的表達量較低；不同于EF1a，DiCAC在8個組織中的表達量基本一致。在qPCR中，以芽的表達量為1計算，相對定量結果表明：對照基因EF1a在珙桐莖、苞片、種子中的表達量較高，2.5左右，芽和葉片中次之，而在根、雄蕊、果肉中表達量較低，0.5左右；相比于EF1a，DiCAC在珙桐各組織中的表達量基本一致，均為1左右，差異不顯著。

DiCAC和GAPDH基因在珙桐不同發(fā)育階段苞片中半定量PCR和qPCR表達分析。半定量PCR電泳結果表明（圖6）：對照基因GAPDH在發(fā)育幼期、前期、中期的苞片中表達量較高，而在發(fā)育后期、晚期的苞片中表達量較低；與GAPDH不同，DiCAC在各發(fā)育階段的苞片中表達量無明顯差異。在qPCR中，以芽的表達量為1計算，相對定量結果表明：GAPDH在發(fā)育幼期的苞片中表達量較高，此后，隨著苞片發(fā)育不斷成熟，表達量逐漸降低，晚期苞片中表達量約降至0.1；不同于GAPDH，DiCAC在不同發(fā)育階段苞片中的表達量基本保持一致，均在1左右。綜上可知，DiCAC在珙桐不同組織和不同發(fā)育階段苞片中均呈穩(wěn)定表達模式。

表3 ReFinder軟件分析珙桐不同組織中6個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性

表4 ReFinder軟件分析珙桐不同發(fā)育階段苞片中6個內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性

圖5 CAC和EF1a在珙桐不同組織中的表達模式

圖6 DiCAC和GAPDH在珙桐不同發(fā)育階段苞片中的表達模式

3 討論

CAC蛋白參與植物中許多重要的生命活動，其中，最主要的功能即是在網(wǎng)格蛋白介導的質膜內(nèi)吞過程中負責貨物蛋白的分揀、網(wǎng)絡蛋白和其他輔助蛋白的招募等，此外，也參與細胞生長發(fā)育、細胞信號傳導以及應對外界環(huán)境的刺激等生命活動過程［23，24］。近年來的一些研究表明，CAC氨基酸序列高度保守，且表達量在不同細胞或組織中變化較小，可以作為某些植物基因表達分析中的內(nèi)參基因。例如，CAC在擬南芥、西紅柿與蕎麥的各組織器官、竹子的不同發(fā)育時期、西瓜果實發(fā)育的不同階段、鷹嘴豆非生物脅迫處理下表達都很穩(wěn)定，可作為內(nèi)參基因用于對目標基因進行校準［3，12-16］。但目前有關珙桐CAC基因的研究尚未見報道。

本研究從珙桐中克隆到一個CAC基因，利用生物信息學手段分析了該基因氨基酸序列的組成成分以及一些理化性質，將其與擬南芥、葡萄、大豆、桃、芹菜等其它植物的CAC氨基酸序列特征進行比較［25］，結果發(fā)現(xiàn)不同植物來源CAC氨基酸序列的組成成分及各類理化性質較為相似，如氨基酸殘基數(shù)均為438個，相對分子質量為49.20-49.40 kD，等電點為9.20-9.40，堿性氨基酸含量略多于酸性氨基酸，蛋白質疏水性較強等。進一步將珙桐DiCAC基因與葡萄、棗、胡楊、巨桉、擬南芥等其它植物CAC基因進行同源性分析與聚類分析，結果表明，珙桐DiCAC基因編碼的氨基酸序列與其它植物CAC氨基酸序列雖有個別位點的差異，但整體上氨基酸序列相似度達到了94% 以上，可見珙桐DiCAC基因與其它植物，尤其是木本植物CAC基因的同源性較高。其中，與葡萄CAC氨基酸序列相似度為97%，同源性最高，親緣關系最近。綜上所述，基因序列和結構較高的相似性說明本研究中克隆到的珙桐DiCAC基因準確可靠。同時，不同植物的CAC基因編碼的氨基酸序列具有高度同源性，進一步表明植物CAC基因高度保守，這與它參與植物的多種重要生命活動密切相關。

研究表明，不同物種間同源內(nèi)參基因的表達存在差異，即在某物種中表達穩(wěn)定性高的內(nèi)參基因在另一物種中的表達穩(wěn)定性并不一定高，甚至可能較差。例如，CAC基因在擬南芥與番茄的各組織中表達穩(wěn)定，可以作為內(nèi)參基因，但其在側柏、葡萄、柚木各組織中的表達穩(wěn)定性卻較差，不適合作為內(nèi)參基因［3，12，26-28］。因此，雖然不同植物間CAC基因具有較高的同源性，并且有報道表明CAC可作為擬南芥、番茄等植物中的內(nèi)參基因，但是，并不能就此認為DiCAC同樣適合在珙桐中作為內(nèi)參基因使用。為此，本研究通過對DiCAC基因在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中的表達特性進行分析，以判斷DiCAC作為內(nèi)參基因的可行性。在珙桐兩組樣品中，結合5個常用管家基因ACT7、EF1a、GAPDH、 β-TUB、18S rRNA，運用多種方法對包括DiCAC在內(nèi)的6個基因的表達穩(wěn)定性進行評價。經(jīng)分析可知，雖然由于各方法的運算原理和判斷標準不完全相同，導致4種分析方法中內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排名存在一定差異，但是，整體排名結果基本一致，最終，綜合排名結果表明，DiCAC在珙桐不同組織與不同發(fā)育階段苞片中的表達穩(wěn)定性排名均居于首位，這說明相對于其它5個管家基因，DiCAC在珙桐不同樣品間表達更為穩(wěn)定。為了進一步檢驗DiCAC的表達穩(wěn)定性，本研究結合半定量PCR與qPCR兩種方法對DiCAC分別在珙桐兩組樣品中的表達量進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)DiCAC在兩組樣品中的表達量均基本一致，相反，分別作為對照的EF1a與GAPDH的表達量卻波動較大，此結果與ReFinder程序的分析結果基本吻合。因此，推斷DiCAC在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中均呈組成型表達，作為此特定條件下的內(nèi)參基因是可行的。此外，在基因表達分析中，理想的內(nèi)參基因不僅表現(xiàn)為表達水平穩(wěn)定，而且要求其穩(wěn)定的表達量與目標基因的表達量相近［29］。本研究發(fā)現(xiàn)，DiCAC在珙桐不同組織與不同發(fā)育階段苞片中的表達豐度均較低，因此，推斷其更適合用于對表達豐度較低的目標基因進行校準。

綜上所述，本研究首次克隆了珙桐CAC基因，并且對其在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中作為內(nèi)參基因的可行性進行了評價。DiCAC的克隆不僅有效填補了珙桐中CAC基因研究的空白，豐富了植物CAC基因核酸數(shù)據(jù)庫，而且為深入研究珙桐相關基因的表達分析提供了參照序列和參考依據(jù)，這將有助于提高基因表達分析結果的精確性。但是，DiCAC作為內(nèi)參基因是否同樣適用于珙桐的其它試驗條件中還有待于進一步研究。

4 結論

本研究從珙桐中克隆到一個編碼網(wǎng)格蛋白銜接蛋白復合物的基因DiCAC（GenBank登錄號為KX268525），該基因開放閱讀框全長1 317 bp，編碼438個氨基酸，與其他植物的CAC氨基酸序列相似度達到94% 以上，其中與葡萄CAC氨基酸序列的同源性最高。半定量PCR與實時熒光定量PCR分析結果表明，DiCAC在珙桐不同組織以及不同發(fā)育階段苞片中表達均相對穩(wěn)定，且表達穩(wěn)定性優(yōu)于常見管家基因，可以作為珙桐相關基因表達研究中的內(nèi)參基因。

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（責任編輯 馬鑫）

Cloning of a CAC Gene in Dove Tree（Davidia involucrata Baill.）and Evaluating its Potential as a Novel Reference Gene

REN Rui DAI Peng-hui CAO Fu-xiang DONG Xu-jie LI Meng
（College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）

In this research，a gene named as DiCAC（GenBank accession number KX268525），encoding the clathrin adaptor complexes（CAC），has been cloned from dove tree（Davidia involucrata Baill.）. The sequence of DiCAC includes a ORF（open reading frame）of 1317 bp，which encodes a protein with 438 amino acids. Homologous alignment and cluster analysis show that DiCAC shared over 94% amino acid sequence identity with CAC genes in other 15 plants，and it has the highest amino acid homology with grape（Vitis vinifera）CAC gene. To evaluate the feasibility of using DiCAC as a reference gene in dove tree，combined with five housekeeping genes of dove tree（ACT7，EF1a，GAPDH，β-TUB and 18S rRNA），we analyzed the expression stability of DiCAC in different tissues and in bracts of different developmental stages. Furthermore，expression analysis of DiCAC detected by semi-quantitative PCR and qPCR showed that the expression levels of DiCAC are stable in both different tissues and bracts of different developmental stages. Remarkably，the expression of DiCAC showed more stability than the expression of common housekeeping genes. Therefore，it could be used as a reference gene of related gene expression research in dove tree. In this study，we have cloned the CAC gene from dove tree firstly and have confirmed the feasibility of its utilization as a reference gene. Our finding provides a novel candidate reference gene resources for the further research gene expression analysis in dove tree.

DiCAC；reference gene；bract；Dove tree（Davidia involucrata Baill.）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.04.015

2016-09-12

中南林業(yè)科技大學博士后科研基金項目（0490016），中南林業(yè)科技大學青年基金項目（QJ201512）

任銳，女，碩士研究生，研究方向：分子生物學與基因工程；E-mail：18734891238@163.com

李萌，男，博士，研究方向：珙桐分子生物學；E-mail：limeng0422@foxmail.com