藏藥藍(lán)側(cè)金盞花的揮發(fā)油成分分析及其抑菌活性研究

錢 帥，包婷雯，南杰東智，盧永昌，李海麗

（1青海民族大學(xué)藥學(xué)院，西寧 810007；2青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007；3青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007）

藏藥藍(lán)側(cè)金盞花的揮發(fā)油成分分析及其抑菌活性研究

錢 帥1，2，3，包婷雯1，3，南杰東智1，2，盧永昌1，2，3，李海麗1，2，3

（1青海民族大學(xué)藥學(xué)院，西寧 810007；2青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007；3青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007）

采用水蒸氣蒸餾法獲得藏藥藍(lán)側(cè)金盞花的揮發(fā)油，對其進(jìn)行GC-MS分析，并運(yùn)用濾紙片擴(kuò)散法初步研究了該揮發(fā)油的抑菌活性。結(jié)果表明：對藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油GC-MS分析得到34種匹配度均在85%以上的化學(xué)成分，占總離子峰相對含量的64.17%，其主要成分包括蒈烯（9.70%）、α蒎烯（5.70%）和紅沒藥醇（482%）。紙片擴(kuò)散法測試藏藥藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油對7種革蘭氏陰性菌和1種革蘭氏陽性菌有較好的抑制活性，對3種供試真菌無抑制作用。

藍(lán)側(cè)金盞花；揮發(fā)油；GC-MS；抑菌活性

藍(lán)側(cè)金盞花（Adonis coerulea Maxim）為毛茛科側(cè)金盞花屬多年生草本植物，莖高3—15 cm，4—7月份開花，分布于我國四川、青海、西藏和甘肅等海拔3 350—5 200 m的高山灌叢或草地［1］。據(jù)《晶珠本草》記載，藍(lán)側(cè)金盞花味苦，性糙，氣味毒臭，食后致人欲死；外敷治瘡癤、肉瘤、癬疥、麻風(fēng)、皮膚?。?］?！恫厮幘хR本草》記載，藍(lán)側(cè)金盞花生長在沙礫、溝槽、樹林之間；味苦、性糙、氣毒大，食后致人瀕臨死，外涂治療瘡、疣，癬疥麻風(fēng)腫核瘡，黃水瘡等皮膚病，單藥一涂即痊愈［3］。尚小飛等［4］在藏獸藥藍(lán)側(cè)金盞花對兔螨的抑殺作用研究中認(rèn)為，藍(lán)側(cè)金盞花乙酸乙酯提取物具有良好的殺兔螨活性。安再強(qiáng)等［5］研究認(rèn)為，與常用的抗真菌類中西藥相比，藍(lán)側(cè)金盞花具有良好的抑制石膏樣毛癬病效果。戴源等［6］在藍(lán)側(cè)金盞花的化學(xué)成分中分離得到8個化合物?；诠诺浣?jīng)驗(yàn)記載和現(xiàn)代藥理研究，藍(lán)側(cè)金盞花可能在治療皮膚病方面有著獨(dú)特的療效。

目前，關(guān)于側(cè)金盞花屬植物揮發(fā)油化學(xué)成分及藥理研究尚屬空白。本試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法［7］提取藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油，并結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用手段對藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分分離和鑒定；用紙片擴(kuò)散法和MIC法研究藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油的體外抗菌效果，以期探明藍(lán)側(cè)金盞花對各個菌種抗菌能力的強(qiáng)弱，為藍(lán)側(cè)金盞花的深層次研究及應(yīng)用開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藍(lán)側(cè)金盞花于2015年7月采自青海省平安縣寺臺鄉(xiāng)，經(jīng)青海民族大學(xué)盧永昌教授鑒定為藏藥材藍(lán)側(cè)金盞花。藍(lán)側(cè)金盞花全草粉碎過40目篩備用。

1.2 儀器與試劑

7890/5975C-GC/MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；NIST MS search 2.0質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫（美國安捷倫公司）；MSD Chemstation D.03.00.611色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國安捷倫公司）；SW-CJ-2FD型凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；AS-1060L型高壓滅菌鍋（鄺杏生物技術(shù)有限公司）。

混合正構(gòu)烷烴對照品（C7-C30）（上海安譜科學(xué)儀器公司）；丙酮、乙醚等試劑均為國產(chǎn)分析純。供試菌種見表1。

表1 供試菌種匯總Table 1 Summary of test strains

1.3 方法

1.3.1 水蒸氣蒸餾法萃取

準(zhǔn)確稱量100 g藍(lán)側(cè)金盞花藥材粉末于圓底燒瓶中，加入300 m L蒸餾水浸泡12 h，用水蒸氣蒸餾法熱回流萃取揮發(fā)油。將餾出液用乙醚反復(fù)萃取3次，同時用無水硫酸鈉干燥，按下式計(jì)算揮發(fā)油提取率：Y＝V/m；式中：V為揮發(fā)油體積（mL）；m為藥材質(zhì)量（g）。

1.3.2 GC-MS分析

色譜柱：彈性石英毛細(xì)管柱HP-5型（30 m×250μm，0.25μm）；載氣（流量）為氦氣（1 mL/min）；進(jìn)樣口溫度為250℃；設(shè)定頂空進(jìn)樣的程序升溫條件：初始溫度為45℃，保持0 min，以1.5℃/min升至80℃，保持1 min；以10℃/min升至120℃，保持1 min；以0.8℃/min升至170℃，保持1 min；以8℃/min升至260℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜調(diào)諧；EI離子源；離子源溫度為230℃；電子能量為70 eV；四級桿溫度為150℃；輔助區(qū)溫度為295℃；數(shù)據(jù)采集掃描模式為全掃描；溶劑延遲時間0 min；質(zhì)譜掃描質(zhì)量范圍50—550 u；質(zhì)譜檢索標(biāo)準(zhǔn)庫為NIST08庫［8］。

1.3.3 KI值測定

精確量取20μL正構(gòu)烷烴混合對照品（C7—C30）于10 mL頂空瓶中，按照1.3.2條件頂空進(jìn)樣分析，用于藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油各組分的KI值（相對保留值）計(jì)算；采用線性升溫的公式計(jì)算揮發(fā)油各組分的KI值，KI＝100n＋100（tx－tn）/（tn＋1－tn），其中tx、tn和tn＋1分別為被分析組分和碳原子數(shù)為n和n＋1的正烷烴（tn＜tx＜tn＋1）的流出峰的保留時間［8］。

1.3.4 抑菌試驗(yàn)測定條件

培養(yǎng)基的制備：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方為牛肉膏2.5 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂粉18.0 g，氯化鈉5.0 g，滅菌水1 000 mL，pH 7.2—7.4；改良馬丁氏培養(yǎng)基配方為酵母浸出粉2.0 g，蛋白胨5.0 g，瓊脂粉18.0 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鉀1.0 g，葡萄糖20.0 g，滅菌水1 000 mL，pH 6.8［9］。

菌種的活化：超凈臺紫外滅菌30 min后通風(fēng)，在酒精燈火焰上將接種環(huán)灼燒滅菌，從供試菌斜面上取少量菌苔并接種于培養(yǎng)基。接種藤黃微球菌等10種細(xì)菌于備好的瓊脂培養(yǎng)基中，30—32℃培養(yǎng)24 h；在改良馬丁氏培養(yǎng)基中接種白色念球菌等3種真菌，25—28℃培養(yǎng)2 d。

菌懸液的制備：用3 m L滅菌的0.05%（v/v）聚山梨酯80和80 m L醫(yī)用無菌生理鹽水溶液洗脫孢子，然后用無菌移液槍將孢子懸液轉(zhuǎn)移至無菌試管內(nèi)，用醫(yī)用無菌生理鹽水將上述細(xì)菌制成108cfu/mL。

抑菌圈的測定：移液槍吸取制備好的供試菌懸液200μL，加入到200 mL已滅菌的細(xì)菌或真菌培養(yǎng)基中，混勻。按標(biāo)號順序依次倒入培養(yǎng)皿中，待凝固。將直徑為6 mm的圓形紙片放入潔凈且干燥的平板內(nèi)，121℃高壓滅菌15 min。用濾紙片浸取3個不同濃度的藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油，平放在已凝固的培養(yǎng)基上，平行做3組試驗(yàn)?？瞻讓φ諡闊o菌水，陽性對照為氯霉素。細(xì)菌35—37℃培養(yǎng)24 h，真菌23—28℃培養(yǎng)2 d。

MIC（最小抑菌濃度）測定：用二甲基亞砜作溶劑配制藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油的6個濃度梯度0.500μL/μL、0.333μL/μL、0.167μL/μL、0.125μL/μL、0.083μL/μL、0.042μL/μL，從而確定其最小抑菌濃度?？瞻讓φ諡闊o菌水，陽性對照為氯霉素。

2 結(jié)果與分析

2.1 水蒸氣蒸餾法萃取

在上述萃取條件下，得到黃綠色油液。揮發(fā)油提取率為1.25 mL/（100 g）。

2.2 GC-MS分析結(jié)果

按上述GC-MS條件分析藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油，利用峰面積歸一化法計(jì)算相對含量，鑒定相對峰面積大于0.01%的組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)；并對各峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索，計(jì)算其KI值（表2）。

表2 藍(lán)側(cè)金盞花的揮發(fā)油化學(xué)成分分析結(jié)果Table 2 Analysis results of the volatile oil chem ical constituents of Adonis coerulea M axim

（續(xù)表2）

通過對藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油的GC-MS分析，共分離鑒定出匹配度在85%以上且相對含量大于0.01%的化學(xué)成分34種，以單萜烴化合物（32.46%）和倍半萜類化合物（17.22%）為主。烯類有13種，占3398%，如蒈烯（9.70%）、α蒎烯（5.70%）；酯類10種，占13.50%，如反-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯（395%）；醇類5種，占12.19%，如紅沒藥醇（4.82%）；此外還有烴類、酮類、醚類等化合物。

2.3 抗菌試驗(yàn)結(jié)果

如表3所示，藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油除了對蠟樣芽孢桿菌和3種受試真菌無抑制作用外，對7種革蘭氏陰性菌和1種革蘭氏陽性菌都表現(xiàn)出了抑制作用；對藤黃微球菌、乙型副傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌等均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用；藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油對真菌無抑制作用，對革蘭氏陰性菌抑制效果較革蘭氏陽性菌強(qiáng)。

表3 不同濃度藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油抑菌圈結(jié)果Table 3 Inhibition zone results of different concentrations of volatile oil of Adonis coerulea M axim mm

通過測定最低抑菌濃度MIC得知，藍(lán)側(cè)金盞花的揮發(fā)油在一定的濃度范圍內(nèi)才具有較好的抑菌作用，對不同的待測菌種有不同的最低抑制濃度；藤黃微球菌和肺炎克雷伯菌的最低抑制濃度為0.125μL/μL、大腸埃希菌的最低抑制濃度為0.333μL/μL，其他5個菌種的最低抑制濃度為0.167μL/μL（表4）。

表4 藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油最低抑菌濃度M IC結(jié)果Table 4 M inim um inhibitory concentration results of volatile oil of Adonis coerulea M axim mm

3 結(jié)論與討論

3.1 通過對揮發(fā)油的GC-MS分析，共分離鑒定出34種成分，以單萜烴和倍半萜類為主。烯類有13種，酯類有10種，醇類有5種，此外還有烴類、酮類、醚類等化合物。

3.2 藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油對7種革蘭氏陰性菌和1種革蘭氏陽性菌都表現(xiàn)出了抑制作用；對藤黃微球菌、乙型副傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌等均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用；藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油對真菌無抑制作用，對革蘭氏陰性菌抑制效果較革蘭氏陽性菌強(qiáng)。

3.3 藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油中，萜烯類物質(zhì)和醇酯類物質(zhì)是主要的抑菌有效成分。另外，酮類、醚類和烴類物質(zhì)也具有一定的抑菌活性。因此，藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油的抑菌活性可能是各成分抑菌效果的疊加。蒈烯（9.7%）對藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油抑菌作用有貢獻(xiàn)；α蒎烯（5.7%）對本試驗(yàn)篩選出的8種供試菌種均有較好的抑制作用［10］。紅沒藥醇（4.82%）具有抗炎、抑菌活性；桉油烯醇（1.59%）對大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、產(chǎn)氣腸桿菌有較好的抑制作用；乙酸龍腦酯（0.76%）有鎮(zhèn)痛抗炎作用［11］；吉馬烯（2.39%）還有一定的抗腫瘤作用［12］。

3.4 本試驗(yàn)通過分析鑒定藏藥藍(lán)側(cè)金盞花揮發(fā)油的主要化學(xué)成分，以及研究其抑菌活性，為藏藥藍(lán)側(cè)金盞花的進(jìn)一步研究及開發(fā)利用提供了依據(jù)，并為該植物的成分研究和藍(lán)側(cè)金盞花指紋圖譜的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Analysis of the volatile oil constituents and their antibacterial activity of Adonis coerulea M axim

QIAN Shuai1，2，3，BAO Ting-wen1，3，NAN Jie-dong-zhi1，2，LU Yong-chang1，2，3，LIHai-li1，2，3
（1College of Pharmacy，Qinghai Nationalities University，Xining 810007，China；2Qinghai Tibetan Plateau Key Laboratory of Plant Resource Chemistry，Xining 810007，China；3Qinghai Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis，Xining 810007，China）

The volatile oil of Adonis coerulea Maxim was extracted by steam distillation and analyzed by GC-MS.The antibacterial activity of the volatile oilwas studied by filter paper diffusion method.The results showed that there were 34 chemical constituents with over 85%matching degree of Adonis coerulea Maxim by GC-MS，which accounted for 64.17%of relative content of total ion peak，and the main compositions included carene（970%），alpha-pinene（5.70%）and alpha-bisabolol（4.82%）.The volatile oil of Adonis coerulea Maxim had good inhibitory activity on 7 kinds of gram-negative bacteria and 1 gram-positive bacteria，and had no inhibitory effect on the 3 tested fungi.

Adonis coerulea Maxim；Volatile oil；GC-MS；Antibacterial activity

S567

：A

1000-3924（2017）02-109-05

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.20

2016-06-23

錢帥（1991—），男，在讀碩士，研究方向?yàn)橹胁厮幬锓治?。E-mail：1073636068＠qq.com，Tel：18997296365

盧永昌（1965—），男，本科，教授，主要從事藏藥的研究與開發(fā)。E-mail：qhlyc＠126.com