摻M g與接枝RGD的HAnps載體系統(tǒng)對(duì)MG63細(xì)胞胞吞功能的影響

陳 恬，陳良建，賀惠莉，彭 靜，郭筱慧，鄭雅亦，邵春生

摻M g與接枝RGD的HAnps載體系統(tǒng)對(duì)MG63細(xì)胞胞吞功能的影響

陳 恬1,2，陳良建1,3，賀惠莉1，彭 靜2，郭筱慧2，鄭雅亦1，邵春生1

(1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙，410013；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙，410013；3.中南大學(xué)粉末冶金國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙，410083)

采用水熱合成法制備HAnps和摻鎂HAnps(Mg-HAnps)，通過硅烷化聯(lián)合碳二亞胺法處理HAnps和Mg-HAnps后接枝黏附肽(RGD)，以香豆素6(coumarin-6)為熒光探針標(biāo)記HAnps，Mg-HAnps，RGD-HAnps和RGD-M g-HAnps，并將其與人成骨肉瘤MG63細(xì)胞株(MG63)細(xì)胞共培養(yǎng)，研究摻Mg與接枝RGD的HAnps對(duì)MG63細(xì)胞胞吞作用的影響。研究結(jié)果表明：RGD-Mg-HAnps無(wú)細(xì)胞毒性，摻Mg與接枝RGD有利于MG63細(xì)胞胞吞HAnps顆粒，并有協(xié)同作用，RGD-Mg-HAnps具有介導(dǎo)胞吞的作用。

基因載體；摻Mg羥基磷灰石納米顆粒(Mg-HAnps)；黏附肽(RGD)；靶向性；胞吞作用

基因治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是尋找一種合適的載體將目的基因運(yùn)輸至靶細(xì)胞。以羥基磷灰石納米顆粒(Hydroxyapatite nanoparticles，HAnps)為代表的無(wú)機(jī)(納米)顆?；蜉d體具有良好的生物可降解性、制作簡(jiǎn)單、易表面改性等優(yōu)點(diǎn)，但HAnps仍存在轉(zhuǎn)染效率不高和缺乏靶向性等不足。有研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒粒徑為20～50 nm，轉(zhuǎn)染效率較高[1]；摻雜鎂離子的HAnps(Mg-HAnps)表面帶正電荷，有利于結(jié)合基因[2]。有研究發(fā)現(xiàn)受體?配體介導(dǎo)的方式可提高靶細(xì)胞的內(nèi)吞納米顆粒和顆粒內(nèi)生化處理能力[3]。黏附肽(RGD)是由精氨酸?甘氨酸?天冬氨酸組成的一段短肽序列，是許多細(xì)胞表面的整合素(integrins)的特異性配體[4]，已有研究發(fā)現(xiàn)在生物材料表面接枝RGD有利于細(xì)胞的黏附、鋪展和增殖[5?7]。在Mg-HAnps表面接枝RGD，能否提高HAnps的膜靶向性和轉(zhuǎn)染效率，有待于進(jìn)一步研究。本文作者采用水熱合成法制備HAnps和Mg-HAnps，通過硅烷化聯(lián)合碳二亞胺法處理HAnps和Mg-HAnps后接枝RGD，以香豆素6(coumarin-6)為標(biāo)記HAnps，Mg-HAnps，RGD-HAnps和RGD-Mg-HAnps，并將其與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)，研究摻Mg與接枝RGD對(duì)HAnps的膜靶向性和胞吞作用的影響。

1 材料和方法

1.1 HAnps和M g-HAnps的制備

通過水熱合成法制備HAnps和Mg-HAnps，使(Ca+Mg)與P摩爾比為1.67、Mg與(Ca+Mg)摩爾分?jǐn)?shù)分別為0和7.5%。稱取適量的Ca(NO3)2·4H2O，Mg(NO3)2·6H2O和(NH4)2HPO4分別溶于雙蒸水中，配制濃度均為1mol/L的溶液，并將適量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的表面活性劑PEG2000加入Ca(NO3)2·4H2O和Mg(NO3)2·6H2O的溶液中。將(NH4)2HPO4以0.12 m L/min的速率滴入混合液中，使用SB?5200DTDN超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn))震蕩反應(yīng)前驅(qū)物1 h。用氨水調(diào)節(jié)混懸液至pH=10后，將混懸液轉(zhuǎn)移至水熱合成反應(yīng)釜中，于電熱鼓風(fēng)干燥箱(廣盈儀器有限公司生產(chǎn)，上海，中國(guó))170℃下反應(yīng)3 h，自然冷卻至室溫，試樣用無(wú)水乙醇和雙蒸水交替離心洗滌3次，1 000 r/min，每次5min，棄上清液，保存于無(wú)水乙醇中。

1.2 HAnps和M g-HAnps的表征

用X線衍射(XRD)技術(shù)對(duì)納米顆粒進(jìn)行物相分析，衍射角為20°＜2θ＜80°，采用Cu Kα射線進(jìn)行X線衍射分析，工作電壓和電流分別保持在40 kV和250 mA。采用JEM?2100F型場(chǎng)發(fā)射高分辨透射電鏡(JEOL，東京，日本)檢測(cè)HAnps和Mg-HAnps的形貌、粒徑。

1.3 HAnps和Mg-HAnps接枝RGD

采用硅烷化聯(lián)合碳二亞胺法接枝RGD時(shí)，配制EDC-MES(質(zhì)量濃度為5 g/L)，pH=5.5)和RGD-PBS (500μg/m L,pH=7.2)緩沖溶液，將形貌和分散性較佳的HAnps和Mg-HAnps試樣置于以體積比為1:20的APTES的無(wú)水乙醇溶液中，超聲振蕩1 h后取出冷卻至室溫。用雙蒸水、無(wú)水乙醇交替離心洗滌3～4次，棄上清，浸入EDC-MES緩沖液中超聲振蕩2 h，分別用雙蒸水和MES緩沖液交替離心洗滌3～4次后，浸入RGD-PBS緩沖溶液中反應(yīng)4 h后取出。用雙蒸水離心洗滌2遍后，置于真空冷凍干燥箱中冷凍干燥24 h，得到RGD-HAnps和RGD-Mg-HAnps粉末。

采用靜電吸附法制備接枝RGD時(shí)，稱取一定量的Mg-HAnps粉末于離心管中，加入RGD-PBS(500 μg/m L，pH=7.2)緩沖溶液，保持Mg-HAnps濃度與上述操作一致。室溫下超聲振蕩1 h，靜置4 h后，用雙蒸水離心洗滌2次，置于真空冷凍干燥箱中冷凍干燥24 h。

1.4 RGD-HAnps的XPS檢測(cè)

表面接枝RGD可引入Mg-HAnps本身不含的N元素，故采用ESCALAB 250XiXPS光電子能譜儀檢測(cè)各原子數(shù)分?jǐn)?shù)和化學(xué)鍵，通過擬合C元素峰，檢測(cè)C元素化學(xué)鍵存在形式，以此判斷RGD是否成功接枝。

1.5 香豆素6(Coum arin-6)標(biāo)記RGD-M g-HAnps及

檢測(cè)

配制質(zhì)量濃度為0.30mg/m L的Coumarin-6的無(wú)水乙醇溶液，配制成質(zhì)量濃度為0.05 g/m L的RGD-Mg-HAnps混懸液，在超聲清洗機(jī)中超聲振蕩40 min(功率為100W)后靜置12 h。以1 000 r/min離心5 min，去上清，用無(wú)水乙醇、雙蒸水分別離心洗滌3次，儲(chǔ)存于雙蒸水中。用巴氏管吸取少量混懸液，滴于24孔板中，于倒置熒光顯微鏡下觀察其熒光特性。

1.6 M TT法檢測(cè)RGD-M g-HAnps的細(xì)胞毒性

1.6.1 RGD-Mg-HAnps混懸液的制備

將稱量好的RGD-Mg-HAnps在等離子消毒機(jī)中消毒后，于超凈工作臺(tái)下用培養(yǎng)液(已滅活小牛血清與1640培養(yǎng)液體積比為1:9)配制成混懸液，質(zhì)量濃度分別為0.10，0.25，0.50，0.75，1.00，1.50和2.00mg/m L，共7組，置于EP管中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中放置浸提72 h，于4℃保存。

1.6.2 培養(yǎng)及檢測(cè)

式中：R為相對(duì)增殖率；Atest為試驗(yàn)組平均吸光度；Af為陰性對(duì)照組平均吸光度。根據(jù)細(xì)胞的相對(duì)增殖率評(píng)定材料的細(xì)胞毒性程度分級(jí)。

表1 細(xì)胞毒性分級(jí)Table1 Cytotoxic grading

1.7 評(píng)價(jià)HAnps對(duì)MG 63細(xì)胞胞吞的影響

1.7.1 MG63細(xì)胞的培養(yǎng)

MG63細(xì)胞成功復(fù)蘇后置于37℃下體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔48 h更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)液由已滅活的小牛血清和RPM I1640培養(yǎng)基按體積比1:9配置而成。于倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞覆蓋超過80%，即用0.25%胰蛋白酶液消化，將其分別接種到2個(gè)培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.7.2 不同處理方法與濃度的HAnps與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)

共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置HAnps,Mg-HAnps,RGDHanps，RGD-Mg-HAnps4組，均已標(biāo)記Coumarin-6，每組再設(shè)100，300和500μg/m L等3種質(zhì)量濃度，對(duì)照組為空白組。將不同方法處理的HAnps與10%胎牛血清的gibco RPM I-1640培養(yǎng)液配置成質(zhì)量濃度為100，300和500μg/m L的混懸液。將MG63細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的gibco RPM I1640培養(yǎng)液終止消化，配置成5×104個(gè)/m L的細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，每孔0.5m L，放置在37℃下5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待完全貼壁后，以HAnps混懸液替代原培養(yǎng)液，1號(hào)板為HAnps組，設(shè)置1～3號(hào)孔，用濃度分別為100，300和500μg/m L的HAnps混懸液100μL替代原培養(yǎng)液，4號(hào)孔更換為新鮮的培養(yǎng)液為空白對(duì)照組，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，完成換液后置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出后用PBS洗滌，在倒置顯微鏡下對(duì)比白光與熒光顯微鏡下圖像，觀察MG63細(xì)胞的胞吞情況。2～4號(hào)板分別為Mg-HAnps組、RGD-HAnps組和RGD-Mg-HAnps組，實(shí)驗(yàn)方法與1號(hào)板的相同。

2 結(jié)果

2.1 XRD及TEM檢測(cè)結(jié)果

圖1所示為HAnps和摻7.5%Mg-HAnps的XRD圖譜。由圖1可看出：HAnps和Mg-HAnps均出現(xiàn)了HAnps晶體的特征衍射峰(JCPDS No.9-0432)；但HAnps和Mg-HAnps的主波峰和次波峰均降低、寬化，在12°，27°，32°和44°處，實(shí)驗(yàn)組樣品均出現(xiàn)了新的波峰，而HAnps在這些位置則無(wú)波峰，結(jié)果表明：Mg2+摻入了HAnps中。

我們本該明白教育應(yīng)做什么：智育是要發(fā)展好奇心和理性思考的能力，而不是灌輸知識(shí)；德育是要鼓勵(lì)崇高的精神追求，而不是鼓吹規(guī)范；美育是要培育豐富的靈魂，而不是傳授技藝。

圖1 HAnps和Mg-HAnps的XRD圖譜Fig.1 XRD patternsof HAnpsand Mg-HAnps

透射電鏡(TEM)下觀察HAnps和Mg-HAnp形貌如圖2所示。從圖2可看出：HAnps的顆粒形貌以桿狀為主，而Mg-HAnps顆粒有桿狀和細(xì)針狀2種形貌，2組顆粒的粒徑均在50～100 nm范圍內(nèi)。

2.2 RGD-Mg-HAnps的XPS檢測(cè)結(jié)果

圖2 HAnps和M g-HAnps的TEM圖Fig.2 TEM imagesof HAnpsand Mg-HAnps

圖3 RGD-Mg-HAnps中C元素峰XPS擬合解析圖Fig.3 Fitting analytic graph of carbon element peak of RGD-Mg-HAnps prepared by XPS

圖3 所示為RGD-Mg-HAnps的C元素峰XPS擬合解析圖?？梢姡翰捎霉柰榛?lián)合碳二亞胺法接枝RGD時(shí)，C元素以C—C鍵、C—H鍵、C—N鍵和N—C=O鍵等的形式存在；采用靜電吸附法接枝RGD時(shí)，C元素以C—C鍵、C—H鍵、C—N鍵和O—C=O鍵等形式存在。O—C=O鍵為RGD多肽內(nèi)固有的化學(xué)鍵，說明RGD與Mg-HAnps之間未形成新的化學(xué)鍵，而硅烷化聯(lián)合碳二亞胺法接枝的RGD-Mg-HAnps中出現(xiàn)了N—C=O鍵，說明RGD與硅烷化聯(lián)合碳二亞胺法處理后的Mg-HAnps表面形成化學(xué)鍵的結(jié)合，RGD已成功地接枝Mg-HAnps表面。

2.3 RGD-Mg-HAnps的細(xì)胞毒性試驗(yàn)

用MTT法檢測(cè)不同濃度的RGD-Mg-HAnps的細(xì)胞毒性，圖4所示為RGD-Mg-HAnps與L929細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡照片，(a)～(d)組為實(shí)驗(yàn)組，(e)為陰性對(duì)照組，(f)為陽(yáng)性對(duì)照組。從圖4可看出：(a)～(e)組細(xì)胞呈星形鋪展，形態(tài)和貼壁良好，實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組比較，在細(xì)胞數(shù)目和形態(tài)方面無(wú)明顯差異，而(f)組已完全裂解，失去正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，呈殘?jiān)退槠瑯颖憩F(xiàn)。

表2所示為RGD-Mg-HAnps在0.10～2.00mg/m L對(duì)L929小鼠成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果。由表2可知：實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)增殖率與陽(yáng)性對(duì)照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，各組細(xì)胞毒性分級(jí)均為0～1級(jí)，表明RGD-Mg-HAnps在0.10～2.00mg/m L范圍內(nèi)對(duì)L929細(xì)胞均無(wú)毒性，滿足GB/T 16886.5—2003“醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)”中對(duì)生物材料的細(xì)胞毒性要求。

表2 RGD-Mg-HAnps的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)Table2 Cytotoxic evaluation of RGD-Mg-HAnps

2.4 不同處理方法與濃度的HAnps對(duì)MG 63細(xì)胞胞吞作用的影響

圖4 RGD-Mg-HAnps與L929細(xì)胞共培養(yǎng)48 h的倒置顯微鏡照片F(xiàn)ig.4 Imagesof inverted m icroscope of L929 cells co-cultured w ith RGD-M g-HAnps for 48 h

Coumarin-6標(biāo)記的HAnps,Mg-HAnps,RGDHAnps和RGD-Mg-HAnps分別與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察胞內(nèi)熒光強(qiáng)弱，比較不同濃度的納米顆粒、摻Mg和接枝RGD對(duì)MG63細(xì)胞胞吞HAnps的影響。圖5所示為Coumarin-6標(biāo)記的HAnps與MG63共培養(yǎng)24 h的倒置熒光顯微鏡照片。從圖5可以看出：不同濃度的HAnps與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)，在同一時(shí)間點(diǎn)觀察MG63細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度不同，納米顆粒濃度增加，胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度也有所增加，但增加不明顯。圖6所示為Coumarin-6標(biāo)記的Mg-HAnps與MG63共培養(yǎng)24 h的倒置熒光顯微鏡照片?？梢姡弘S著Mg-HAnps的濃度增加，MG63細(xì)胞內(nèi)的熒光濃度增加，在相同納米顆粒濃度和共培養(yǎng)時(shí)間條件下，比較圖6與圖5中MG63細(xì)胞胞內(nèi)熒光強(qiáng)度可發(fā)現(xiàn)，Mg-HAnps組對(duì)細(xì)胞胞吞的促進(jìn)作用優(yōu)于HAnps組對(duì)細(xì)胞胞吞的促進(jìn)作用。圖7所示為Coumarin-6標(biāo)記的RGD-HAnps與MG63共培養(yǎng)24 h的倒置熒光顯微鏡照片?？梢姡航又GD的HAnps與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后觀察，MG63細(xì)胞胞內(nèi)有熒光的細(xì)胞數(shù)量和胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨納米顆粒的濃度增加而增加。圖8所示為Coumarin-6標(biāo)記的RGD-Mg-HAnps與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)24 h的倒置熒光顯微鏡照片。從圖8可看出：不同濃度RGD-Mg-HAnps與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)，在同一時(shí)間點(diǎn)觀察，視野內(nèi)的MG63細(xì)胞的胞漿內(nèi)均有綠色熒光存在，納米顆粒濃度增加，MG63細(xì)胞的胞漿內(nèi)熒光強(qiáng)度增加不明顯。

由此可知：在相同濃度和培養(yǎng)時(shí)間下，HAnps，Mg-HAnps，RGD-HAnps和RGD-Mg-HAnps組分別與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后觀察胞漿內(nèi)有熒光的細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度明顯不同，表明MG63細(xì)胞胞吞納米顆粒的數(shù)量不同。RGD-Mg-HAnps組中MG63細(xì)胞胞漿內(nèi)有熒光的細(xì)胞數(shù)量最多，熒光強(qiáng)度也明顯優(yōu)于其他3組，RGD-HAnps組對(duì)細(xì)胞胞吞的促進(jìn)作用優(yōu)于Mg-HAnps組和HAnps組對(duì)細(xì)胞胞吞的促進(jìn)作用。結(jié)果表明，對(duì)HAnps進(jìn)行摻Mg與表面接枝RGD處理均能促進(jìn)MG63細(xì)胞胞吞HAnps，摻Mg后再接枝RGD的HAnps更有利于MG63細(xì)胞胞吞作用。

圖5 Coumarin-6標(biāo)記的HAnps與MG63共培養(yǎng)24 h的倒置熒光顯微鏡照片F(xiàn)ig.5 Inverted fluorescencemicroscope of HAnpswith Coumarin-6 co-culturedw ith MG63 for24 h

圖6 Coumarin-6標(biāo)記的Mg-HAnps與MG63共培養(yǎng)24 h的倒置熒光顯微鏡照片F(xiàn)ig.6 Inverted fluorescencem icroscope of Mg-HAnpsw ith Coumarin-6 co-cultured w ith MG63 for 24 h

3 討論

基因載體主要有病毒載體和非病毒載體兩大類，其中病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但存在致癌、免疫原性、細(xì)胞毒性等潛在風(fēng)險(xiǎn)[8]，所以臨床應(yīng)用受限。與病毒載體相比，非病毒載體轉(zhuǎn)染效率低，但其優(yōu)勢(shì)如下：毒性低、免疫反應(yīng)低；所攜帶的基因不整合至宿主細(xì)胞基因組；材料來源廣泛，化學(xué)結(jié)構(gòu)可控制，便于大量制備；沒有載體容量限制等。非病毒基因載體主要有陽(yáng)離子多聚物、無(wú)機(jī)納米顆粒、脂質(zhì)體，樹狀聚合物等。其中陽(yáng)離子多聚物(如PEI和PLL)表面富含正電荷，轉(zhuǎn)染效率與相對(duì)分子質(zhì)量成正比，但細(xì)胞毒性會(huì)隨多聚物相對(duì)分子質(zhì)量增加而增加[9]。脂質(zhì)體為類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，易與血漿蛋白結(jié)合，易被自身免疫系統(tǒng)識(shí)別并清除，且具有一定的細(xì)胞毒性[10]。無(wú)機(jī)納米顆粒是由無(wú)機(jī)材料制成的納米結(jié)構(gòu)顆粒，如HAnps、金納米顆粒、磁性納米顆粒、二氧化硅納米顆粒、氧化鐵納米顆粒、量子點(diǎn)納米顆粒、碳納米管等。HAnps已被證明是基因轉(zhuǎn)染的有效的非病毒載體[11?13]，HA是牙齒和骨骼中天然的無(wú)機(jī)成分，具有優(yōu)異的生物相容性和獨(dú)特的生物功能；在pH為7.4的生理環(huán)境中不降解，而在pH低于6.5的胞吞小泡和溶酶體內(nèi)降解，沒有細(xì)胞毒性及免疫原性[14?17]。但HAnps還存在著轉(zhuǎn)染效率不高和缺乏靶向性等不足，因而提高HAnps載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率和靶向性是研究熱點(diǎn)。

HAnps的基因轉(zhuǎn)染效率受粒徑、表面電荷與界面形貌、Zeta電位和局部微環(huán)境等因素的影響[1]。在HAnps的結(jié)晶中摻雜能改變顆粒的理化特性[18]。有研究發(fā)現(xiàn)：在溶液環(huán)境中原子半徑為0.09～0.13 nm的陽(yáng)離子較容易取代鈣離子(半徑為0.1 nm)，Mg2+的離子半徑恰處于這范圍之中，且具有抑止HAnps顆粒晶粒長(zhǎng)大的作用，有利于控制HAnps的粒度[19?20]；同時(shí)，鎂元素是人體不可缺少的微量元素，摻雜Mg2+的HAnps表面帶有正電荷，與DNA或RNA結(jié)構(gòu)上磷酸基團(tuán)的靜電相互作用，有利于基因結(jié)合[21]。本研究通過控制工藝參數(shù)制備出平均粒徑約為70 nm的分散性良好的Mg-HAnps，符合細(xì)胞胞吞納米顆粒的粒徑要求，摻Mg組與未摻Mg組分別與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)，比較結(jié)果可知：摻Mg組MG63細(xì)胞胞漿內(nèi)的熒光強(qiáng)度優(yōu)于未摻Mg組，從而表明摻Mg的HAnps有利于MG63細(xì)胞的胞吞作用。

表面接枝改性是提高HAnps載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率和靶向性的策略之一。有研究發(fā)現(xiàn)受體?配體介導(dǎo)能提高靶細(xì)胞的內(nèi)吞納米顆粒和顆粒內(nèi)生化處理能力[3]。整合素家族是細(xì)胞表面受體的主要家族，通過募集整合素特異性配體，介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間許多重要的細(xì)胞功能，包括黏附、遷移、侵入等，并介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的雙向信號(hào)傳導(dǎo)[6]。選擇黏附肽(RGD)作為接枝材料，RGD是由精氨酸?甘氨酸?天冬氨酸組成的一段短肽序列，是許多細(xì)胞表面的整合素(integrins)的特異性配體，RGD能與成骨細(xì)胞胞膜上的α1β1和α5β1等整合素受體結(jié)合[22?24]。用硅烷化聯(lián)合碳二亞胺法在HAnps表面接枝RGD后，選用HAnps，Mg-HAnps，RGD-HAnps和RGD-Mg-HAnps組分別與MG63細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)納米顆粒濃度和培養(yǎng)時(shí)間相同時(shí)，MG63細(xì)胞胞漿內(nèi)有熒光的細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度明顯不同，接枝RGD組的胞內(nèi)有熒光的細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度均優(yōu)于未接枝組，提示接枝RGD可促進(jìn)HAnps的胞吞作用。另外，接枝RGD組與摻Mg組也有不同，摻Mg2+和接枝RGD組的MG63細(xì)胞胞漿內(nèi)有熒光的細(xì)胞數(shù)目和熒光強(qiáng)度明顯高于僅摻Mg組或僅接枝RGD組，摻Mg和接枝RGD對(duì)促進(jìn)MG63細(xì)胞胞吞HAnps有協(xié)同作用，其可能的原因如下：RGD是細(xì)胞表面整合素配體，能與細(xì)胞表面黏附分子的受體識(shí)別結(jié)合，在納米顆粒表面接枝RGD，能通過受體?配體介導(dǎo)，提高納米顆粒靶向細(xì)胞膜作用；摻Mg2+的HAnps表面帶正電荷，而細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，兩者間的靜電吸引作用，有利于納米顆粒向細(xì)胞表面遷移，通過靜電吸引和受體?配體介導(dǎo)發(fā)揮協(xié)同作用，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)納米顆粒的胞吞作用。

圖7 Coumarin-6標(biāo)記的RGD-HAnps與MG63共培養(yǎng)24 h的倒置熒光顯微鏡照片F(xiàn)ig.7 Inverted fluorescencemicroscopeof RGD-HAnpswith Coumarin-6 co-culturedw ith MG63 for24 h

圖8 Coumarin-6標(biāo)記的RGD-Mg-HAnps與MG63共培養(yǎng)24 h的倒置熒光顯微鏡照片F(xiàn)ig.8 Inverted fluorescencem icroscope of RGD-M g-HAnpsw ith Coumarin-6 co-cultured w ith MG63 for 24 h

4 結(jié)論

1)通過控制水熱合成法工藝參數(shù)和摻Mg能控制HAnps的形貌和粒徑，制備桿狀粒徑均在50～100 nm范圍的Mg-HAnps。

2)硅烷化聯(lián)合碳二亞胺法接枝的RGD-Mg-HAnps在0.10～2.00mg/m L范圍內(nèi)無(wú)細(xì)胞毒性。

3)摻Mg與表面接枝RGD均能促進(jìn)MG63細(xì)胞的胞吞HAnps，摻Mg和表面接枝RGD能發(fā)揮協(xié)同作用，更有利MG63細(xì)胞胞吞HAnps。

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(編輯 趙俊)

Influence of HAnps carrier system w ith doping M g and grafting RGD on endocytosisof MG63 cells

CHEN Tian1,2,CHEN Liangjian1,3,HEHuili1,PENG Jing2,GUO Xiaohui2, ZHENG Yayi1,SHAOChunsheng1

(1.Third Xiangya Hospital,Central South University,Changsha 410013,China; 2.X iangya School of Medicine,Central South University,Changsha 410013,China; 3.State Key Laboratory of Pow derM etallurgy,Central South University,Changsha 410083,China)

HAnps and HAnps w ith doped M g(Mg-HAnps)w ere prepared by hydrothermal synthesismethod(HTSM), grafted adhesive peptide(RGD)after silanization combined w ith carbodiim ide method,labeled HAnps,M g-HAnps, RGD-HAnps,RGD-Mg-HAnpswith coumarin-6 asa fluorescent label,and theywere co-culturedw ith human osteosarcoma MG63 cell line(MG63)cells.The effectsof HAnpsw ith doping Mg and grafting RGD on endocytosisof MG63 cellswere investigated.The results show that RGD-M g-HAnps have no cytotoxicity.M g-doped and RGD-grafted HAnps im prove endocytosisofMG63 cells,which have synergistic effects.RGD-Mg-HAnps areable to promote endocytosis.

gene vector;Mg-doped Hydroxyapatite nanoparticles(Mg-HAnps);arginine-glycine-aspartic acid(RGD); targeting specificity;endocytosis

R783.1

A

1672?7207(2017)03?0625?10

10.11817/j.issn.1672-7207.2017.03.010

2016?10?20；

2016?12?12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81571021)；湖南省科技重點(diǎn)項(xiàng)目(2015WK3012)；中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院新湘雅人才項(xiàng)目(20160301)；湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程骨干人才項(xiàng)目(225)；中南大學(xué)本科生自由探索計(jì)劃項(xiàng)目(ZY2016758)；中南大學(xué)粉末冶金國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(621020094)(Project(81571021)supported by the National Natural Science Foundation of China;Project (2015WK3012)supported by the Hunan Provincial Science and Technology Department Program;Project(20160301)supported by the New Xiangya Talent Program of the Third Xiangya Hospital of Central South University;Project(225)supported by the High Level Health Personnel in Hunan Province,China;Project(ZY2016758)supported by the Undergraduate Free Exploration Program in Central South University; Project(621020094)supported by State Key Laboratory of Powder Metallurgy in CentralSouth University)

陳良建，博士，教授，主任醫(yī)師，從事牙種植體修復(fù)、頜骨缺損的贗復(fù)體修復(fù)及新型肽種植體的研究；E-mail:jian007040@sina.com