黔西南地區(qū)超廣普β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌耐藥研究

王興林，李 瑩，文德學(xué)

（貴州省黔西南州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 黔西南 562400）

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黔西南地區(qū)超廣普β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌耐藥研究

王興林，李 瑩，文德學(xué)

（貴州省黔西南州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 黔西南 562400）

目的研究本院肺炎克雷伯菌產(chǎn)超廣普β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的流行情況及其基因類型和耐藥情況，為臨床上治療肺炎克雷伯菌相關(guān)疾病提供合理用藥方案。方法隨機(jī)選取本院200株肺炎克雷伯菌，采用雙紙片確證法確定產(chǎn)超廣普β-內(nèi)酰胺酶的流行情況，通過PCR基因擴(kuò)增技術(shù)確定ESBLs的基因類型，通過自動微生物鑒定系統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)觀察ESBLs的耐藥性。結(jié)果① 本院ESBLs的檢出率為32．5%，在200株中65株被檢出；②65株ESBLs中，37例（56．9%）為CTX-M基因型，6株（9．2%）為SHV基因型，7株（10．8%）為TEM型，兩種基因型9株（13．8%），三種基因型共6株（9．2%）；③產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶組和非產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶組中，耐藥性分布是不同的，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶組對頭孢唑林和頭孢噻肟的耐藥率為100%，而對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美洛配能的耐藥率最低。結(jié)論本院以CTX-M基因型ESBLs為主，此外也可以看到SHV基因型和TEM基因型，通過本研究ESBLs基因型的檢測，可以更好的指導(dǎo)臨床上治療肺炎克雷伯菌的抗菌素的使用。

肺炎克雷伯菌，β-內(nèi)酰胺酶，基因，耐藥

肺炎克雷伯菌在臨床上屬于常見的菌屬，產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶是細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因之一[1]，此外第三代頭孢類藥物在臨床上的廣泛使用，細(xì)菌逐漸能產(chǎn)生能水解第三代頭孢類藥物的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。目前對于產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌的臨床報(bào)告越來越多。因?yàn)樵趪鴥?nèi)外均有由產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌引發(fā)的全院內(nèi)的爆發(fā)性感染[2]。因此此類菌種也被視為醫(yī)院內(nèi)重點(diǎn)監(jiān)控菌種，此類菌種在臨床上往往表現(xiàn)為多藥耐藥性，為了能有效的控制此類菌種在當(dāng)?shù)氐膫鞑?，更加?zhǔn)確的指導(dǎo)臨床上抗菌藥的使用，準(zhǔn)確檢驗(yàn)此類菌種是十分必要的，本院是黔西南地區(qū)的三級醫(yī)院，收入的患者來至黔西南地區(qū)不同區(qū)域，從而可以間接的反應(yīng)黔西南地區(qū)的肺炎克雷伯菌的基因及耐藥情況。對我院2013年1月到2014年5月我院分離出的200株肺炎克雷伯菌進(jìn)行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行檢驗(yàn)，并且對肺炎克雷伯菌的基因型進(jìn)行分析。

1 研究樣本及方法

1.1 研究樣本

本研究所有的分離200株肺炎克雷伯菌均來自本院2013年1月到2014年5月我院住院部的患者。

1.2 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢驗(yàn)

本研究采用的是雙紙片確證法，所用試劑如表一。對兩個紙片在加了克拉維酸后，測量抑菌環(huán)的直徑，如果直徑大于5cm,便視為產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶。

表1 標(biāo)準(zhǔn)紙片確證法藥敏紙片

1.4 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因檢驗(yàn)

采用平板劃分離分經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)紙片確證法檢驗(yàn)為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的所有菌種，然后進(jìn)行培養(yǎng)，溫度設(shè)定為35度，培養(yǎng)時間為16～20 h。將細(xì)菌加入100 uL的TE緩沖液中，在100℃下進(jìn)行細(xì)菌裂解，裂解時間為10 min。在經(jīng)20000rpm離心5分鐘后，去上清液5 mL作為本研究的模版。100 mL反應(yīng)體系中，含有dNTP200nM,模版5 mL，Taq聚合酶1U，Mg1.5nM。反應(yīng)條件為：預(yù)變性溫度設(shè)置為94攝氏度，反應(yīng)時間為1分鐘，變性溫度設(shè)定為94℃，時間為1 min。退火45秒。25個循環(huán)，在72℃下延伸5 min。最后采用1%的瓊脂糖凝膠電泳，并且在紫外燈下觀察研究的結(jié)果。

表2 引物序列及退火溫度

1.5 肺炎克雷伯菌藥敏試驗(yàn)

本研究使用美國BD Phoenix100全自動微生物鑒定及藥敏分析儀，其配套陰性藥敏分析板條含氨芐西林、阿米卡星、氯素霉、環(huán)丙沙星、頭孢唑林、慶大霉素、左旋氧氟沙星、哌拉西林、復(fù)方新諾明、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克攔維酸、氨曲南、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、美洛配能、氨芐西林/舒巴坦、四環(huán)素，頭孢哌酮/舒巴坦采用紙片法。藥敏實(shí)驗(yàn)使用肺炎克雷伯菌ATCC10031作為質(zhì)量控制菌株。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用卡方檢驗(yàn)比較產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶組和非產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶組耐藥性分布的情況。效驗(yàn)值取0.05。

2 結(jié) 果

2.1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢驗(yàn)結(jié)果

200株肺炎克雷伯菌中檢出超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌65株（32.5%），產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌種中，對頭孢他啶耐藥的有54株（83.1%）,對頭孢噻肟/頭孢他啶耐藥15株（23.1%）。非產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌種中，對頭孢他啶耐藥的有6株（13.3%）,對頭孢噻肟/頭孢他啶耐藥7株（15.6%）。

2.2 基因型檢驗(yàn)結(jié)果

本研究用5中基因引物65株超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌進(jìn)行基因檢驗(yàn)，結(jié)果顯示有37例（56.9%）為CTX-M基因型，6株（9.2%）為SHV基因型，7株（10.8%）為TEM型，兩種基因型9株（13.8%），三種基因型共6株（9.2%）。在本研究中，未見PER，VEB基因型。詳見表三、圖1到3。

表3 65株超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌基因型分布

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

200株肺炎克雷伯菌對肺炎克雷伯菌的耐藥情況如表四。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)比較產(chǎn)和非產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥情況顯示，兩組間的在耐藥率上的分布是不一致的，有顯著性差異（x2=41.473，P＜0.05），其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶組對頭孢唑林和頭孢噻肟的耐藥率為100%，而對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美洛配能的耐藥率最低，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶組內(nèi)可見三種基因型對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美洛配能不產(chǎn)生耐藥性，但檢出CTX-M+TEM+SHV的菌種對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美洛配能有耐藥性，分別為37.5%、25%、25%。同時兩種基因型對哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、美洛配能也均產(chǎn)生耐藥性。

3 討 論

肺炎克雷伯菌從細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上劃分為革蘭陰性桿菌，按照異化作用進(jìn)行區(qū)分為兼性厭氧型。肺炎克雷伯菌因?yàn)槎玖?qiáng)，致死率高等特點(diǎn)，一直以來都是臨床上重點(diǎn)觀察的病原菌之一[3]。由于第三代頭孢類藥物的不合理使用，使得產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌的檢出率在逐年的增高，ESBLs能通過質(zhì)粒介導(dǎo)能水解第三代頭孢類藥物藥物，但是這樣的質(zhì)粒介導(dǎo)可通過克拉維酸進(jìn)行抑制[4]。本研究納入的黔西南地區(qū)200株菌種中ESBLs的檢出率為32.5%，與貴州省ESBLs的檢出率相近，貴州省的為30.26%[5]，同時在全國范圍內(nèi)比較，本院ESBLs的檢出率高于全國的ESBLs的檢出率28.1%[6]。

圖1 肺炎克雷伯菌SHV基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 肺炎克雷伯菌TEM基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖3 肺炎克雷伯菌CTX-M基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

基因型分析

本研究結(jié)果顯示，基因結(jié)果顯示在本地區(qū)以CTX-M基因型為主，檢出率為83.5%，其中單純CTX-M基因型56.9%，CTX-M+SHV和有CTX-M+TEM總計(jì)13.3%，CTXM+TEM+SHV為9.2%。研究顯示，CTX-M型是非TEM和SHV型，其來源上并非遺傳，可能是通過一些腸桿菌科細(xì)菌染色體上的天然的β-內(nèi)酰胺酶獲得[7]。CTX-M基因型在我國為主要的類型，同時在廣州也是以CTX-M型為主[8]。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌中SHV基因型檢出率為29.2%，單純SHV基因型為9.2%，而CTX-M+SHV為7.7%，CTX-M+TEM+SHV為9.2%。此外TEM基因型檢出率為29.3%，單純TEM基因型為10.8%，而CTX-M+TEM為 6.2%，CTX-M+TEM+SHV為9.2%。SHV基因型和TEM基因型，在我國并不是主要的肺炎克雷伯菌基因類型[9]，相反在美國、法國等國家是主要的主要流行的基因型[10]。在國內(nèi)不同區(qū)域也是不一致的，在山西則是以TEM基因型為主[11]。

表4 200株肺炎克雷伯菌耐藥情況

不同基因型耐藥性分析

CTX-M基因型的肺炎克雷伯菌的水解底物為青霉素類的抗生素，包括了第一代和第二代青霉素類抗生素，有研究顯示對于第三代青霉素類抗生素具有選擇性，其對于頭孢噻肟的選擇性高于頭孢吡肟，會優(yōu)先水解頭孢噻肟，有部分的CTX-M基因型的肺炎克雷伯菌可水解頭孢吡肟，這可能是與CTX-M基因型的不同類型有關(guān)[12]。從本研究的中CTX-M基因型的藥敏實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)這個觀點(diǎn)，37株CTX-M基因型中，全部菌株對頭孢噻肟耐藥，而頭孢吡肟的耐藥率為34株（91.9%）。但是從頭孢吡肟藥敏結(jié)果來看，頭孢吡肟的耐藥性較高，可能是CTX-M基因上的一些氨基酸位點(diǎn)發(fā)生改變導(dǎo)致對頭孢吡肟的水解能力增強(qiáng)。同時在CTX-M基因還存在交叉耐藥性，除青霉素類外，也具有耐藥性，這可能是CTX-M基因肺炎克雷伯菌通過轉(zhuǎn)化、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)能方式，獲得相關(guān)的耐藥基因。此外藥敏研究顯示單純CTX-M基因肺炎克雷伯對亞胺培南和美洛配能沒有產(chǎn)生耐藥性。

同時SHV基因型和TEM基因型在本研究中，對于頭孢噻肟的耐藥性是高于頭孢吡肟，[13]。有研究顯示SHV基因型對頭孢噻肟的耐藥性是高于頭孢吡肟，本研究從側(cè)面也反應(yīng)這點(diǎn)[14]。對于TEM基因型有研究顯示，其對于頭孢他啶的水解能力要高與頭孢噻肟，但是在本研究中頭孢他啶的耐藥性是低于頭孢噻肟[15]。這可能是與本地區(qū)頭孢他啶的使用相關(guān)。本研究中SHV基因型和TEM基因型的肺炎克雷伯菌對于亞胺培南和美洛配能顯示出高的敏感性。

隨著第三代頭孢菌素類藥物的使用，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌的的檢出增加。對其流行狀況、基因類型和耐藥性進(jìn)行監(jiān)測，可切斷產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌的相關(guān)的耐藥質(zhì)粒傳播途徑，指導(dǎo)臨床上抗肺炎克雷伯菌的使用，減少肺炎克雷伯菌在院內(nèi)的感染。

[1] 陳 鍵.老年呼吸科患者感染產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌耐藥分析[J]. 臨床肺科雜志,2016(1):51-53.

[2] 黃文輝,陳媛.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的檢測及院內(nèi)感染的分布[J].醫(yī)學(xué)爭鳴, 2009(22):2646-2646.

[3] 李艷萌.肺炎克雷伯分離株耐藥性和毒力基因的相關(guān)性研究[D].蘇州大學(xué),2015.

[4] 史寶玉,譚曉武,姜 艷.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐藥性調(diào)查分析[J].中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2015(5):765-769.

[5] 陳 敏,朱張國,高 奇,等.76株肺炎克雷伯菌感染及耐藥性的分析[J]. 醫(yī)學(xué)綜述,2010,16(3):474-476.

[6] 李 耘,李家泰.ESBLs在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和陰溝腸桿菌中的檢出率及耐藥情況比較[J].中國抗生素雜志,2005,30(3):151-158.

[7] 黃義山,蔡 燕,易成鳳,等.四川北部地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)ESBLsCTX-M亞型研究[J].中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育,2015(13):20-21.

[8] 肖慶忠,蘇丹虹,江潔華,等.廣州地區(qū)革蘭陰性桿菌CTX-M和OXA型廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2005,15(12):1321-1326.

[9] 姚 杰,徐元宏,賈建安,等.產(chǎn)CTX-M酶腸桿菌科細(xì)菌耐藥性及其相關(guān)耐藥基因研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2011,21(14):2874-2877.

[10] 胡龍華,余方友,熊建球,等.肺炎克雷伯菌臨床分離株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因型研究[C]// 中華醫(yī)學(xué)會第七次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議資料匯編.2008.

[11] 蔡朝民,程明剛,劉香萍,等.產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯桿菌SHV型β-內(nèi)酰胺酶臨床研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2013,13(12):1528-1529.

[12] 周 翼,魏 威.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸桿菌耐藥性分析及耐藥基因檢測[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2015(13):1935-1937.

[13] 劉 丁,陳 萍,王 政,等.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌耐藥性和基因分型研究[J].中國病原生物學(xué)雜志,2008,3(11):810-811.

[14] 史偉峰,王玉月,李美忠,等.產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌相關(guān)耐藥基因研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2009,24(3):215-218.

[15] 王喜仁.大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對頭孢菌素的耐藥性與ESBLs基因分型研究[D].青島大學(xué),2013.

本文編輯：李 豆

R563．1

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ISSN．2095-8242．2017．13．2395．04

課題名稱：產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌耐藥性分析（課題編號：2013-44）