新型Rho激酶抑制劑WAR5抑制APP/PS1小鼠炎性反應(yīng)的作用研究

吳 昊，辛延樂(lè)，谷青芳，于婧文，姜維佳，柴 智，肖保國(guó),4，尉杰忠*，馬存根,*

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，山西 太原 030001；2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009；3.山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西 太原 030024；4.復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025）

新型Rho激酶抑制劑WAR5抑制APP/PS1小鼠炎性反應(yīng)的作用研究

吳 昊1,2，辛延樂(lè)1,2，谷青芳2，于婧文2，姜維佳3，柴 智3，肖保國(guó)2,4，尉杰忠2*，馬存根1,2,3*

（1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科，山西 太原 030001；2.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009；3.山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西 太原 030024；4.復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025）

目的探討新型Rho激酶抑制劑WAR5對(duì)阿爾茨海默?。?Alzheimer disease，AD）的治療效果及其作用機(jī)制。方法雌性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠（鼠齡8月），隨機(jī)分為AD組和WAR5治療組。WAR5組腹腔注射WAR5化合物，AD組腹腔注射生理鹽水，持續(xù)2個(gè)月。水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠的認(rèn)知功能；免疫熒光，Western blot技術(shù)檢測(cè)AD相關(guān)病理及炎癥信號(hào)通路的變化，包括Aβ，p-tau，TLR4和p-NF-κB。結(jié)果與AD組比較，WAR5治療能有效改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能，減少AD標(biāo)志性病理產(chǎn)物Aβ，p-tau的產(chǎn)生（P＜0.05）。同時(shí)能夠下調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)TLR4（P＜0.05），p-NF-κB的表達(dá)水平（P＜0.05）。結(jié)論WAR5對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能改善有效。WAR5可能成為治療AD的一個(gè)候選藥。

WAR5化合物；阿爾茨海默?。籖ho激酶抑制劑；磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子-κB

在進(jìn)入老齡化社會(huì)后，阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）越來(lái)越受關(guān)注。β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）是老年斑（Senile plaques，SP）的核心成分，與胞內(nèi)過(guò)度磷酸化Tau蛋白聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）共同為AD關(guān)鍵病理產(chǎn)物。有研究表明，Toll樣受體／核因子-κB信號(hào)通路激活參與AD腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，已發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)與病理產(chǎn)物Aβ的聚集呈正相關(guān)[1,2]。Rho/Rho激酶（Rho kinase，ROCK）作為機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種信號(hào)傳遞通路，參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等生命活動(dòng)。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在AD時(shí)有ROCK的激活和表達(dá)，而應(yīng)用ROCK抑制劑進(jìn)行干預(yù)后均可改善臨床癥狀和病理狀況[3]。WAR5是本實(shí)驗(yàn)室使用的一種新型的Rho激酶抑制劑[4]，本實(shí)驗(yàn)主要探討了WAR5對(duì)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的治療效果及對(duì)TLR4與磷酸化NF-κB的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水迷宮軟件SMART V3.0及硬件購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)買于Thermo公司；凝膠成像分析儀購(gòu)自Bio-Rad；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗Aβ，p-tau，TLR4，p-NF-κB和β-actin等抗體購(gòu)自cell signaling，Western blot二抗購(gòu)自cell signaling，免疫組化二抗購(gòu)自cell signaling；冰凍切片機(jī)購(gòu)自Leica；WAR5化合物由天津紅日藥業(yè)股份有限公司提供。

研究對(duì)象：8月齡，體重26～28 g，雌性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠

1.2 主要方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥處理

雌性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠在潔凈級(jí)動(dòng)物室正常喂養(yǎng)，隨機(jī)分為AD組和WAR5組，每組8只，WAR5組腹腔注射WAR5化合物2個(gè)月（40 mg/kg/天），AD組腹腔注射相同劑量生理鹽水。

1.2.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)

水迷宮硬件設(shè)備是由直徑為80 cm的圓形水池及直徑為9 cm的站臺(tái)組成，水溫（25.0±0.5）℃，液面高出平臺(tái)區(qū)（即SW區(qū)）2 cm。整個(gè)水迷宮硬件設(shè)備分為4個(gè)象限（NW，NE，SW，SE）和八個(gè)區(qū)域（Border NW zone，Internal NW zone，Border NE zone，Internal NE zone，Border Internal SW zone，Border SE zone，Internal SE zone），平臺(tái)在SW區(qū)。

學(xué)習(xí)訓(xùn)練：周期為5天，每天上下午各一次，將小鼠從東西南北四個(gè)方向隨機(jī)放入水池，訓(xùn)練小鼠從起點(diǎn)到達(dá)平臺(tái)，時(shí)長(zhǎng)60 s/次；如果在60 s期間小鼠不能成功到達(dá)平臺(tái)，則進(jìn)行引導(dǎo)，小鼠在平臺(tái)停留60 s。

認(rèn)知功能測(cè)定：訓(xùn)練結(jié)束后，進(jìn)行5天的認(rèn)知功能測(cè)定，將小鼠從東西南北四個(gè)方向隨機(jī)放入水池，自由游動(dòng)60秒，SMART V3.0系統(tǒng)控制的攝像頭跟蹤并記錄以下指標(biāo)：在平SW區(qū)活動(dòng)度占總活動(dòng)度的比例（Global Activity in SW （%））、入水到平臺(tái)時(shí)間（Latency to Target）、到平臺(tái)路徑距離（Mean Distance to Target）、第一次到達(dá)SW區(qū)時(shí)間（Latency 1st Entrance to SW）、在SW區(qū)滯留時(shí)間占總時(shí)間的比例（Time in SW（%））、在SW區(qū)路徑距離占總路徑距離的比例（Distance in SW （%））。

1.3 標(biāo)本采集

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，0.3%戊巴比妥鈉麻醉，生理鹽水心臟灌注，各組4只取腦組織，提取蛋白，BCA定量，用于Western blot；其余小鼠生理鹽水灌注，4%多聚甲醛灌流固定，分離腦，經(jīng)10%、20%和30%蔗糖溶液梯度24小時(shí)脫水，OCT包埋，以10 μm厚度做冠狀位冰凍連續(xù)切片，用于免疫熒光染色。

Western blot 蛋白樣品（30 μg）與等體積的2×Laemnli上樣緩沖液混勻，100 °C水浴5 min，10% SDS-PAGE不連續(xù)凝膠電泳分離。40 V濕式電轉(zhuǎn)移2 h。PVDF 膜于5%脫脂牛奶封閉2 h。用5%脫脂牛奶分別稀釋抗Aβ（1:1000）、抗p-tau（1:1000）、抗TLR4（1:1000）、抗p-NF-κB（1:1000）及抗β-actin（1:10000），分別加至膜上，4℃孵育過(guò)夜。次日1:10000稀釋相應(yīng)熒光偶聯(lián)的二抗，室溫孵育2 h。洗膜5 min，3次，Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測(cè)染色條帶，以檢測(cè)蛋白條帶灰度與內(nèi)參照β-actin 的灰度比值表示。

1.4 免疫熒光染色

冰凍切片經(jīng)1×P B S洗5 m i n，3次；染抗A β（1:1000）、抗p-tau（1:1000）、抗TLR4（1:1000）、抗p-NF-κB（1:1000）；4℃孵育過(guò)夜；次日1×PBS洗5 min，3次；AlexaFlour 555或AlexaFlour 488熒光標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h；1×PBS洗5 min，3次，50%甘油封片鏡檢。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）來(lái)表示，采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 WAR5改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能

通過(guò)分析水迷宮實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)，兩組動(dòng)物在Global Activity in SW （%）（圖1a）沒有變化，說(shuō)明兩組小鼠不存在體能上的差異。但是，WAR5治療后，小鼠的Latency to Target（圖1b）、Mean Distance to Target（圖1c）以及Latency 1st Entrance to SW（圖1d）均明顯減少；Time in SW（%）（圖1e）明顯增加、Distance in SW （%）（圖1f）明顯增加。

圖1 不同組別動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試6項(xiàng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較

2.2 WAR5減少Aβ與p-tau的在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)

如圖2a和2b所示，WAR5治療可明顯抑制Aβ和p-tau的表達(dá) ；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明WAR5治療明顯降低Aβ與p-tau在小鼠腦組織中的表達(dá)（圖2c）。

圖2 不同組Aβ與p-tau免疫熒光染色及統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)和Aβ與p-tau的Western blot結(jié)果

2.3 WAR5抑制TLR4與p-NF-κB的表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光和Western blot技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)WAR5對(duì)該信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示：WAR5治療明顯降低TLR4、p-NF-κB的表達(dá)（圖3）。

圖3 不同組p-NF-κB免疫熒光染色及統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)和TLR4與p-NF-κB的Western blot結(jié)果

3 結(jié) 論

Rho激酶抑制劑可減少Aβ1-42 的產(chǎn)生[5]。作為臨床上常用的ROCK激酶抑制劑，法舒地爾主要用于血管痙攣方面的治療，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)其還具有抑制炎癥、清除自由基及調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)等作用[6]。但卻存在治療的安全窗比較小、不易長(zhǎng)期使用等諸多限制，因此選用一個(gè)副作用小，療效確切的新型藥物成為當(dāng)務(wù)之急，本實(shí)驗(yàn)所選用的WAR5化合物是法舒地爾的異構(gòu)體，有研究表明，WAR5與法舒地爾相比，可減少小鼠CNS內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞的浸潤(rùn)，推測(cè)WAR5可減少炎性細(xì)胞跨內(nèi)皮細(xì)胞遷徙，減少BBB通透性，從而改善小鼠癥狀；并且WAR5擴(kuò)血管作用小且治療安全窗大[7]。因此我們可以推測(cè)，在安全且有效的劑量（40 mg/kg/天）使用范圍內(nèi)，WAR5治療AD模型小鼠也具有安全窗大、給藥后動(dòng)物的存活率高等優(yōu)點(diǎn)[4]

因此本實(shí)驗(yàn)探討WAR5對(duì)AD的治療效果和機(jī)制具有重要意義。AD臨床上有明顯的記憶和認(rèn)知功能的損傷，并且進(jìn)行性加重。水迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，AD組和WAR5組在到達(dá)平臺(tái)區(qū)域的時(shí)間和距離以及活動(dòng)的頻率存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各項(xiàng)指標(biāo)中WAR5組表現(xiàn)均優(yōu)于AD組，說(shuō)明WAR5可明顯改善AD小鼠的認(rèn)知和記憶能力。

AD病因和發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有研究表明Aβ的沉積可通過(guò)影響Tau蛋白的磷酸化促進(jìn)NFTs的產(chǎn)生[8]。在炎癥的環(huán)境下，神經(jīng)元細(xì)胞也有可能通過(guò)自身代謝產(chǎn)生更多的Aβ，進(jìn)一步擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[9]。TLRs/NF-κB信號(hào)通路激活所引起的炎癥反應(yīng)可能是AD發(fā)病中炎癥損傷的一種重要機(jī)制。在AD病理中，Aβ沉積引起TLR4的表達(dá)增加，并且誘導(dǎo)NF-κB的激活，進(jìn)一步加重組織損傷[10-11]。通過(guò)藥物抑制TLRs/ NF-κB信號(hào)通路激活，降低機(jī)體炎癥損傷已成為治療AD的重要靶點(diǎn)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示W(wǎng)AR5可以明顯降低APP/ PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ和p-tau，TLR4/NF-κB蛋白的表達(dá)，預(yù)示W(wǎng)AR5在治療AD方面具有一定的潛能。

綜上所述，新型Rho激酶抑制劑WAR5對(duì)阿爾茨海默病的免疫炎癥反應(yīng)有明顯的臨床治療和癥狀改善作用，包括改善了小鼠的認(rèn)知和記憶能力，減少了AD的病理產(chǎn)物，對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行了抑制。這可能為進(jìn)一步探索AD損傷CNS后神經(jīng)功能的恢復(fù)及其調(diào)控方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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本文編輯：吳玲麗

Suppressive effect of WAR5,a novel Rho kinase inhibitor,on the infammatory responses of AD mice

WU Hao1,2, XIN Yan-le1,2, GU Qing-fang2, YU Jing-wen2, JIANG Wei-jia3, CHAI Zhi3, XIAO Bao-guo2,4, YU Jie-zhong2, MA Cun-gen1,2,3
(1.Department of Neurology, the First Clinical Medical College of Shanxi Medical University, Shanxi Taiyuan 030001, China; 2.Institute of Brain Science of Shanxi Datong University, Shanxi Datong 037009, China; 3."2011" Collaborative Innovation Center/Research Center of Neurobiology Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Shanxi Taiyuan 030024,China; 4.Institute of Neurology,Fudan University Huashan Hospital, Shanghai 200025, China)

ObjectiveTo explore the therapeutic effect and and mechanism of a novel Rho kinase inhibitor WAR5 on alzheimer disease (AD).MethodsFemale APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into AD group and WAR5 group when mice grow to 8 months.The AD group received intraperitoneal injection by saline for 2 months,while the WAR5 group given the WAR5 compound during the same time.We used the Morris water maze test to measure the cognitive competence of each group.Then we used to immunofluorescence method and Western blot experiment to test changes of the relevant pathological and inflammatory signal pathways,such as Aβ,ptau,TLR4 and p-NF-κB.ResultsThrough the treat of WAR5,there is a better spatial learning and memory,WAR5 reduce the symbolic pathological products of AD,including Aβ,p-tau (P＜0.05),and reduce the expression level of TLR4,p-NF-κB in central nervous system (P＜0.05).ConclusionThe novel Rho kinase inhibitor WAR5 is effectively improve function of spatial learning and memory in APP/PS1 transgenic mice,thus WAR5 may be a candidate drug to treat the AD.

WAR5 compound; Alzheimer disease; Rho kinase inhibitor; P-NF-κB

R320.54

B

ISSN.2095-8242.2017.010.1805.03

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272163、81471412）；山西省回國(guó)留學(xué)人員重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目（2014-重點(diǎn)7）；山西省大同市科技局基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014105-1）

尉杰忠（1975-），男，副教授，碩士生導(dǎo)師

通訊作者：馬存根（1960-），男，博士，教授，博導(dǎo)，E-mail：macungen2001@163.com