牛腹瀉病毒檢測(cè)（PCR法）及其影響因素分析

林春麗+張海波+陳紅霞+侯春燕+云雨生

摘要：PCR技術(shù)是一種體外模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的核酸擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)重復(fù)高溫變性、低溫退火、中溫延伸等簡(jiǎn)單的3個(gè)溫度循環(huán)，能將靶DNA擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，獲得極高的檢測(cè)敏感性。通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)新生牛是否帶有牛病毒性腹瀉病毒的血清樣本進(jìn)行檢驗(yàn)，并對(duì)影響其檢測(cè)效果的因素進(jìn)行了分析。

關(guān)鍵詞：牛腹瀉病毒（BVDV）；PCR；引物

中圖分類號(hào)：S858.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2017）04-0005-02

牛病毒性腹瀉（黏膜病）是由牛病毒性腹瀉病毒[1]（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的傳染病，各種年齡的牛均易感染、以幼齡牛易感性最高。

牛病毒性腹瀉（黏膜病）的病原體屬于披膜病毒科瘟病毒屬的成員。病毒粒子呈圓形，有囊膜，直徑50～80 nm。RNA核芯直徑（24±4）nm，分子量3×106，沉降系數(shù)80～90 s。

牛病毒性腹瀉（黏膜病）可以穿過(guò)胎盤感染，特別是懷孕早期。其病毒血清抗體陰性的母牛一旦感染，常常通過(guò)胎盤使胎兒產(chǎn)生免疫抑制，引起持續(xù)性病毒血癥，如果小牛正常產(chǎn)出，病毒血癥能持續(xù)地帶入成年期，這種牛臨床貌似健康，血清中又無(wú)保護(hù)性抗體，但體內(nèi)始終帶毒，是牛群中最危險(xiǎn)的傳染源[2]。

本研究是通過(guò)PCR技術(shù)檢驗(yàn)新生牛是否帶有牛病毒性腹瀉病毒，排除患病牛，制備無(wú)病毒血清，進(jìn)一步用于獸藥的研制，并對(duì)影響其檢測(cè)效果的因素進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RNAiso plus，購(gòu)自Takara公司；氯仿、無(wú)水乙醇、75%乙醇，DEPC水、ddH2O、DNA Marker購(gòu)自TakaRa公司；核酸染料購(gòu)自百泰克有限公司。

1.1.2 器材、儀器準(zhǔn)備 1 000 μL槍，200 μL槍，50 μL槍，1 000 μL槍頭，200 μL槍頭，75%酒精棉，止血鉗，EP管，EP管架；PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)伯樂(lè)公司，型號(hào)為S1000）等。

1.1.3 樣品 共24個(gè)樣本，包括22個(gè)未知樣本（均為新生牛初血清），陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

1.2 方法

PCR技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是由Saiki發(fā)明，因其技術(shù)對(duì)世界生物醫(yī)學(xué)的巨大推動(dòng)作用，獲得了1992年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[3]。由美國(guó)PE-Cetus公司的Kary Banks Mulis在1985年建立的[4]。這項(xiàng)技術(shù)可在試管內(nèi)經(jīng)數(shù)小時(shí)反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。

1.2.1 提取步驟

（1）取2 mL無(wú)菌無(wú)酶EP管，加入RNA Siso Plus（裂解液）900 μL（加液過(guò)程中如槍頭接觸到EP管壁或其他物品，需更換槍頭），再分別吸取待測(cè)血清樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各200 μL于EP管中，每加一次樣品換一次槍頭。輕輕上下顛倒搖勻至底部無(wú)沉淀，顏色均一，冰盒中靜置5 min。將已檢測(cè)樣品放-20 ℃冷凍保存（陰性對(duì)照放在中間順序）。

（2）12 000 r/min、4 ℃離心1 min。加入200 μL的氯仿，上下顛倒20次混勻，至顏色均一為乳粉色，冰盒中靜置8 min。

（3）12 000 r/min、4 ℃離心15 min。在離心剩余2 min時(shí)準(zhǔn)備新1.5 mL無(wú)菌無(wú)酶EP管，加入800 mL -20 ℃預(yù)冷的異丙醇。從離心機(jī)輕拿輕放取出EP管（離心后液體分為三層，底層為有機(jī)溶液層，中層蛋白質(zhì)，上層上清液含RNA）。吸取400 μL上清液（分兩次，每次200 μL吸取，吸取上層液體時(shí)切勿碰觸或吸取中層蛋白質(zhì)），放入事先加好異丙醇的新1.5 mLEP管中，輕輕上下顛倒20次搖勻，-20 ℃靜置20 min[5]。

（4）12 000 r/min、4 ℃離心15 min。離心機(jī)中EP管擺放方向保持一致，以使沉淀在管底同一側(cè)。若離心后不出沉淀繼續(xù)-20 ℃放置10～20 min后離心。棄上清，保留沉淀。沉淀即為RNA提取物，量很少，在倒上清液時(shí)注意切勿將沉淀倒出。

（5）加入1 mL75%乙醇（DEPC水配制，加乙醇過(guò)程中如槍頭接觸到EP管壁或其他物品，需更換槍頭），輕輕上下顛倒，洗滌沉淀，將沉淀懸浮起來(lái)即可。

（6）7 500 r/min、4 ℃離心5 min。棄上清，保留沉淀。用200 μL槍頭將管底殘余乙醇液體吸凈，吸取一個(gè)樣品換一個(gè)槍頭，注意不要碰觸和吸取到RNA沉淀。

（7）EP管中的RNA在超凈工作臺(tái)中室溫下自然干燥10 min。加入20 μL的無(wú)RNase水（將水加到沉淀上），輕彈溶解沉淀，短期使用-20 ℃保存，長(zhǎng)期使用保存于-70 ℃下。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primeier 5.0設(shè)計(jì)BVDV特異性引物（表1、表2）。

PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系：25 μL，配制在冰盒上進(jìn)行，設(shè)定好反應(yīng)程序后，將裝有上述體系液體PCR反應(yīng)管包括對(duì)照管（空白PCR體系管和水樣PCR體系管）放入Smart CycLer System中按照表3參數(shù)設(shè)定PCR儀進(jìn)行 PCR反應(yīng)。

1.2.3 電泳分析

（1）制膠。稱取1.35 g瓊脂糖粉放入錐形瓶中（注：倒入過(guò)程中避免瓊脂糖粉末粘在錐形瓶壁上）。加入90 mL 1×TBE溶液，微波爐加熱無(wú)絮狀物至完全溶解（注：至少沸騰3次），取出錐形瓶后，冷卻至60 ℃左右，加入17μL的核酸染料，搖至徹底混勻后倒入帶有梳子的膠槽中（輕輕混勻即可，避免氣泡產(chǎn)生），冷卻凝固40 min。

（2）將制好的膠放入電泳槽中，倒入1×TBE，液位高于膠面2 mm。

（3）用移液槍取樣品與6×Loading Buffer混合點(diǎn)于膠孔中。

（4）將電泳儀正負(fù)極對(duì)應(yīng)連接，開(kāi)啟電泳儀電源開(kāi)關(guān)，在120 V電壓下電泳50 min。將跑完的瓊脂糖凝膠從電泳槽取出，放在凝膠成像儀中，進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

由圖2可見(jiàn)，12號(hào)為陰性對(duì)照，無(wú)明亮的條帶；24號(hào)為陽(yáng)性對(duì)照，出現(xiàn)明亮的條帶，證明試驗(yàn)成立。剩余樣本在316 bp處，8、9、10、11、20、21、23號(hào)出現(xiàn)明亮的條帶，說(shuō)明該樣本血清樣本染牛腹瀉病毒。

2.2 影響PCR檢測(cè)的因素

2.2.1 dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200 μmol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等，如其中任何一種濃度不同于其他幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配[6]。

2.2.2 Mg2+濃度 Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著影響。在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200 μmol/L 時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0 mmol/L為宜。Mg2+濃度過(guò)高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過(guò)低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。

2.2.3 溫度與時(shí)間的設(shè)置 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)[7]。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95 ℃變性，再迅速冷卻至40～60 ℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75 ℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。

2.2.4 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。一般認(rèn)為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48 h以內(nèi)完成電泳檢測(cè)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測(cè)，大于48 h后帶型就會(huì)出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。所以精細(xì)的分子實(shí)驗(yàn)，操作過(guò)程的每一步都必須謹(jǐn)慎細(xì)致，才可保證準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

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