周期素依賴性蛋白激酶—5在不同成年牛皮膚中的表達(dá)

劉晉冀+楊潔鴻

摘要：采用不同毛色的牛皮作為研究對象，運用免疫組織化學(xué)法對周期素依賴性蛋白激酶-5（CDK-5）在成年牛皮膚中的表達(dá)進行定位和定性研究。結(jié)果表明，CDK-5在牛皮膚毛囊的外根鞘和毛球部呈陽性表達(dá)，說明CDK-5可能與牛毛色形成有關(guān)。

關(guān)鍵詞：周期素依賴性蛋白激酶-5（CDK-5）；毛囊；毛色；免疫組織化學(xué)

中圖分類號：S823；Q344+.13 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1007-273X（2017）03-0005-02

周期素依賴性蛋白激酶-5（Cyclin dependent kinase 5，CDK-5）是CDKs家族的成員之一，屬于小絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，因為他具有與其他的CDK成員同源的序列而得名[1]。但CDK-5的功能卻不同于其他CDKs成員那樣參與細(xì)胞周期的調(diào)控，而是主要參與神經(jīng)元正常功能的維持[2]。最初認(rèn)為CDK-5僅在神經(jīng)元中表達(dá)，但近年的研究發(fā)現(xiàn)CDK-5在非神經(jīng)元的組織或細(xì)胞中廣泛表達(dá)并發(fā)揮作用。牛（Cattle）是中國傳統(tǒng)物種，也是非常常見的物種之一。牛作為經(jīng)濟型大型哺乳動物，除了肉、奶等畜牧產(chǎn)品外，皮毛作為農(nóng)業(yè)附屬品，也同樣具有研究價值。動物皮毛中的黑色素種類、數(shù)量以及分布情況決定其毛色的表達(dá)，其中酪氨酸酶（TYR）是黑色素合成過程中的關(guān)鍵酶，對毛色形成發(fā)揮至關(guān)重要的作用。其中酪氨酸羥化酶（TH）是TYR重要的激活因子之一，而TH酶的活性受細(xì)胞CDK-5的調(diào)控，因此CDK-5可能在毛色形成過程中發(fā)揮作用。哺乳動物的毛色受許多基因的控制，這些基因通過相互作用決定毛色的產(chǎn)生。研究CDK-5與牛毛色的關(guān)系，不僅會通過實踐操作對免疫組化有一個定性的認(rèn)識，而且可以依據(jù)學(xué)術(shù)界先鋒對羊駝的毛色形成的研究作出假設(shè)，對CDK-5是否對所有動物的毛色形成有關(guān)系這一問題提供一個實例[3-8]。白色毛色是由于黑色素細(xì)胞數(shù)量較少，黑素體內(nèi)黑色素含量也少，毛根中明顯缺乏黑色素細(xì)胞及其前體的緣故[9]。哺乳動物的皮膚和毛發(fā)色素沉著決定于其所含真黑色素與褐色素的相對數(shù)量[10，11]。因此，試驗對CDK-5在黑白兩色牛皮膚中的表達(dá)進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

選取黑白毛色的牛體側(cè)皮膚，剃毛后刮凈表皮，用取皮器取出黑白各2塊牛皮膚組織，置于4%的中性甲醛溶液中固定18 h，石蠟包埋，切片，進行免疫組織化學(xué)研究。

1.2 主要試劑及方法

兔抗人、大鼠、小鼠CDK-5多克隆抗體、HRP-山羊抗兔LgG、DAB顯色試劑盒（DB公司）；PBS緩沖液，正常兔血清，DAB顯色液，Triton試劑（聚乙二醇辛基苯基醚），無水乙醇，蘇木精染料，KD-BM生物組織包埋機、KD-2508切片機，HPP-9160電熱恒溫培養(yǎng)箱、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、Leica DMLB顯微鏡。組織包埋及切片制作免疫組織化學(xué)流程參照文獻(xiàn)[11]的方法。

1.3 免疫組化圖像分析

光鏡下觀察免疫組織化學(xué)切片，每頭牛取3張切片，每張切片用DP軟件采集5個視野，對染色結(jié)果用Image-ProPlus 6.0軟件進行圖像分析，進行陰陽性對照。

2 結(jié)果與分析

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CDK-5在白色和黑色牛皮膚毛囊的外根鞘和毛球部呈陽性表達(dá)，反應(yīng)陽性物分布在胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)，對照組未觀察到陽性細(xì)胞（圖1）。由圖1可知，在黑白兩色牛皮膚毛囊外根鞘和毛球部存在CDK-5陽性免疫反應(yīng)物，預(yù)示了CDK-5在黑白兩色牛皮膚毛囊中發(fā)揮著某種生物學(xué)功能。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，在黑白牛皮膚毛囊外根鞘和毛球部存在CDK-5陽性免疫反應(yīng)物，表明CDK-5在黑白兩色牛皮膚毛囊中發(fā)揮著某種生物學(xué)功能。皮膚毛囊外根鞘內(nèi)含有大量的黑色素細(xì)胞，正常的黑色素細(xì)胞形態(tài)特點為核小和胞漿不明顯[12]，而毛球是產(chǎn)生生黑素細(xì)胞并直接向毛干輸送黑色素的惟一部位[13]。研究發(fā)現(xiàn)，CDK-5是一個能使體內(nèi)外的酪氨酸羥化酶（TH）發(fā)生磷酸化的激酶[14]，TH在許多位點被不同的激酶磷酸化后不同程度地影響著TH酶的活性[15-17]。TH被CDK-5磷酸化后，TH的蛋白水平和活性均增加，如果缺少CDK-5，TH蛋白將不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解。TH是TYR的活性之一，而TYR是在黑色素合成的起始過程中的一種關(guān)鍵酶。

本研究結(jié)果顯示，黑白色牛皮膚中存在CDK-5基因和蛋白的表達(dá)量，與文獻(xiàn)觀點相結(jié)合，推測CDK-5與牛毛色的形成相關(guān)。然而，CDK-5在牛毛色形成調(diào)控過程中的作用和其功能的驗證還有待于進一步的研究，本試驗將為研究該基因與牛乃至其他哺乳動物毛色形成的關(guān)系提供一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] LEW J，WINKFEIN R，PAUDEL H，et al.Brain prolinedirected protein kinase is a neurofilament kinase which displays high sequence homology to p34cdc2[J].J Biol Chem，1992，267（36）：25922-25926.

[2] XIONG W，PESTELL R，ROSNER MR.Role of cvclins in neuronal diferentiation of immortmized hippoeampal cells[J].Mol Cell Bio，1997，17：6585-6597.

[3] 劉 佳，董常生，范瑞文，等.周期素依賴性蛋白激酶-5在不同毛色羊駝皮膚中的表達(dá)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2010，41（4）：478-483.

[4] 高 莉，董常生，赫曉燕，等.羊駝酪氨酸酶基因家族在不同毛色個體中的基因表達(dá)水平[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（7）：895-899.

[5] 姜俊兵，趙志軍，賀俊平，等.Agouti在不同顏色被毛羊駝皮膚組織中的表達(dá)[J].畜牧與獸醫(yī)，2007，39（4）：38-40.

[6] 張巧靈，姜俊兵，賀俊平，等.羊駝顯性白毛調(diào)控KI T基因的分子克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)[J].激光生物學(xué)報，2008，17（1）：43-47.

[7] PAREEK T K，KULKARNI A B. Cdk5： A new player in pain signaling[J]. Cell Cycle，2006，5（6）：585-588.

[8] BANKSTON A N，LI W，ZHANG H，et al. The primary activator for cyclin-dependent kinase 5（Cdk5） in oligodendroglia， is essential for oligodendroglia differentiation and myelin repair[J]. J Biol Chem，2013，288（25）：18047-18057.

[9] ANKAD B S，BEERGOUDER S L. Pityriasis lichenoides et varioliformis acuta in skin of color： New observations by dermoscopy[J]. Dermatol Pract Concept，2017，7（1）：27-34.

[10] HOLMGAARD H，HANSEN E Q，DONG N P，et al. Individuals with dark eyes and hair exhibit higher pain sensitivity[J]. Somatosens Mot Res，2017，34（1）：21-26.

[11] YANG M A，LEE W K，SHIN H S，et al. Neuroendocrine tumors in the stomach， duodenum， and pancreas accompanied by novel MEN1 gene mutation[J]. Korean J Gastroenterol，2017，69（3）：181-186.

[12] SHI C，VICCARO K，LEE HG，et al. Cdk5-Foxo3 axis： Initially neuroprotective， eventually neurodegenerative in Alzheimer's disease models[J]. J Cell Sci，2016，129（9）：1815-1830.

[13] ZHAO W，YAN J，GAO L，et al. Cdk5 is required for the neuroprotective effect of transforming growth factor-β1 against cerebral ischemia-reperfusion[J]. Biochem Biophys Res Commun，2017，485（4）：775-781.

[14] 王 穎. 周期素依賴性蛋白激酶-5研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)（臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊），2004，25（6）：500-505.

[15] 閆 明，焦守恕，王 鉅. 周期素依賴性蛋白激酶-5在腦缺血中的作用機制的研究[J].實驗動物科學(xué)，2007，24（4）：50-54.

[16] 張俊珍，董常生，范瑞文，等.哺乳動物毛色形成研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2006，27（增）：65-68.

[17] CICERO S，HERRUP K. Cyclin-dependent kinase 5 is essential for neuronal cell cycle arrest and differentiation[J]. Neurosci，2005，25（42）：9658-9668.