脂多糖干預(yù)對大鼠周圍神經(jīng)損傷后瓦勒變性的影響

熊樂，張倩，沈若武，邊洪琳，孫廣強，王毅，張鳳玉，張蓓*

(1.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071；2.青島阜外心血管病醫(yī)院，山東 青島 266034)

研究報告

脂多糖干預(yù)對大鼠周圍神經(jīng)損傷后瓦勒變性的影響

熊樂1，張倩2，沈若武1，邊洪琳1，孫廣強1，王毅1，張鳳玉1，張蓓1*

(1.青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266071；2.青島阜外心血管病醫(yī)院，山東 青島 266034)

目的 探討脂多糖對于大鼠坐骨神經(jīng)損傷瓦勒變性早期髓鞘碎片清除的影響。 方法 將50只Wistar大鼠隨機分成假手術(shù)組(10只)，模型組(20只)和脂多糖LPS組(20只)，LPS組及模型組橫斷大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)后，行神經(jīng)外膜端端吻合；假手術(shù)組僅游離出坐骨神經(jīng)，然后關(guān)閉切口。LPS組大鼠在神經(jīng)斷端顯微注射LPS (2 g/ L) 1 μL，模型組及假手術(shù)組大鼠注射同等體積生理鹽水。于術(shù)后1.5、24 h和7 d 取術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)。實時定量PCR(qRT-PCR)檢測坐骨神經(jīng)中白介素1β(IL-1β)mRNA、單核細胞趨化蛋白-1 (MCP-1) mRNA水平；免疫熒光法檢測坐骨神經(jīng)中CD68+巨噬細胞的表達；HE染色觀察坐骨神經(jīng)的病理變化；油紅O染色觀察坐骨神經(jīng)脫髓鞘程度；LFB染色觀察坐骨神經(jīng)髓鞘變化；坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)評價大鼠運動功能的恢復(fù)情況。結(jié)果 實時定量PCR顯示，與假手術(shù)組相比，術(shù)后1.5 h模型組IL-1β mRNA和MCP-1 mRNA的表達均明顯升高(P<0.001,P<0.001)，與模型組相比，術(shù)后1.5 h LPS組IL-1β mRNA和MCP-1mRNA的表達明顯升高(P<0.001,P<0.001)。術(shù)后24 h模型組IL-1β mRNA和MCP-1m RNA的表達均明顯升高(P<0.001,P<0.001)，與模型組相比，術(shù)后24 h LPS組IL-1β mRNA和MCP-1 mRNA的表達明顯升高(P<0.01,P<0.01)。免疫熒光可見，與模型組相比，術(shù)后7 d LPS組中CD68+細胞表達顯著上調(diào)(P<0.05)。術(shù)后7 d坐骨神經(jīng)HE染色可見, LPS組坐骨神經(jīng)斷端較多炎性細胞浸潤，許旺細胞增殖活躍，模型組神經(jīng)斷端炎性細胞和許旺細胞較少。術(shù)后7 d坐骨神經(jīng)ORO染色可見，與模型組相比，LPS組斷端遠側(cè)脫髓鞘程度較高。術(shù)后7 d坐骨神經(jīng)LFB染色可見,模型組和LPS組坐骨神經(jīng)斷端均出現(xiàn)脫髓鞘反應(yīng)，但與模型組相比，LPS組神經(jīng)斷端殘余髓鞘碎片明顯減少(P<0.05)。SFI顯示，與模型組相比，LPS組大鼠在術(shù)后10、20、30、40和50 d分別不同程度升高，術(shù)后20 d明顯增高, 差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論 脂多糖通過激活固有免疫系統(tǒng)加快大鼠坐骨周圍神經(jīng)損傷后瓦勒變性早期髓鞘碎片的清除。

周圍神經(jīng);瓦勒變性;脂多糖;髓鞘碎片

周圍神經(jīng)損傷長久以來都是臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。周圍神經(jīng)損傷后發(fā)生瓦勒變性，即由于各種創(chuàng)傷、牽拉、缺血、高低溫、電擊等原因，直接使神經(jīng)纖維受損中斷，周圍神經(jīng)損傷后遠段發(fā)生的軸突壞死、髓鞘分解消失和神經(jīng)鞘膜增生等一系列蛻變和細胞吞噬過程。變性崩解的髓鞘碎片會抑制近心段神經(jīng)軸突的再生[1, 2]，所以快速有效地清除髓鞘碎片對神經(jīng)再生意義重大，而巨噬細胞在此過程中發(fā)揮了巨大的作用。近年來, 關(guān)于巨噬細胞參與瓦勒變性在遠端軸突再生中發(fā)揮作用的研究十分廣泛, 它對周圍神經(jīng)再生的影響主要有兩個：一是吞噬變性組織，為再生神經(jīng)清除障礙；二是分泌活性物質(zhì)直接或通過雪旺細胞間接為軸突再生提供適宜的微環(huán)境。Toll樣受體(TLRs)作為一種模式識別受體，介導(dǎo)天然免疫應(yīng)答，除了識別病原相關(guān)分子模式外，也可識別損傷相關(guān)分子模式，如壞死細胞、熱休克蛋白(HSP60，HSP70)和細胞外基質(zhì)成分[3]，已有研究表明TLRs表達于神經(jīng)系統(tǒng)[4]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性細菌細胞壁上的主要成分，可以通過激活相應(yīng)TLRs信號通路有效刺激巨噬細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化。已有研究發(fā)現(xiàn)小鼠脊髓損傷模型中，腹腔注射LPS能促進瓦勒變性過程中的髓鞘碎片的清除[5]。在外周神經(jīng)損傷大鼠模型中，通過在大鼠神經(jīng)斷端單次顯微注射微量LPS，探究LPS對瓦勒變性中炎性細胞募集及髓鞘碎片清除的影響，旨在從分子免疫學(xué)角度，在損傷早期縮短瓦勒變性時間，提高神經(jīng)修復(fù)速度及質(zhì)量，為周圍神經(jīng)輔助治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級 Wistar 雄性大鼠50只，體重(200±20)g，由青島市實驗動物和動物實驗中心提供【SCXK(魯)20011-0007】。飼養(yǎng)于飼養(yǎng)箱，每箱 5 只大鼠，通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，溫度為(24±2) ℃，相對濕度為45%～55%，自由飲食與進水，買回大鼠適應(yīng)環(huán)境 1 周后開始實驗。大鼠的組織取材于青島大學(xué)動物實驗設(shè)施內(nèi)進行【SYXK(魯) 2011-0012】。

1.1.2 試劑及儀器

LPS購于美國Sigma公司。免疫組化用的兔抗大鼠的相關(guān)多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Premix Ex Taq 熒光定量試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 坐骨神經(jīng)損傷模型制備

10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，麻醉成功后，用8%硫化鈉脫毛術(shù)區(qū)皮膚，消毒后將動物俯臥位固定，無菌條件下顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)，于梨狀肌下緣0.8 cm處用利刀橫行切斷坐骨神經(jīng)，以神經(jīng)外膜上走行的血管為標(biāo)記，用8/0無損傷縫合線行神經(jīng)外膜端端吻合，吻合口縫合4針，逐層關(guān)閉切口。假手術(shù)組僅游離出坐骨神經(jīng)，然后關(guān)閉切口。

1.2.2 分組與給藥

50只Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組(10只)，模型組(20只)和LPS組(20只)。LPS組大鼠端端縫合后，在神經(jīng)斷端顯微注射LPS (2 g/L) 1 μL，模型組及假手術(shù)組大鼠尾靜脈注射同等體積生理鹽水。1.3 觀察與研究指標(biāo)

1.3.1 實時定量PCR測坐骨神經(jīng)IL-1β和MCP-1mRNA的表達

用 Trizol 法提取各組大鼠坐骨神經(jīng)總RNA。由TaKaRa公司生產(chǎn)的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行 cDNA 合成，按照TaKaRa公司 SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)( no．RR420A) 熒光定量試劑盒說明進行real-time PCR反應(yīng)。管家基因 β-actin 是用來規(guī)范的總RNA量。IL-1β 引物序列: 上游引物 5’-GCCAACAAGTGGTATTCTCCA-3’，下游引物 5 ’-CCGTCTTTCATCACACAGGA-3’，擴增片段為118 bp; MCP-1 引物序列: 上游引物 5’-AGGACTTCAGCACCTTTGA-3’，下游引物 5 ’-TTCTCTGTCATACTGGTCACTTC-3’，擴增片段為116 bp; β-actin 內(nèi)參序列: 上游引物 5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，下游引物 5 ’-CCCATACCCACCATCACACC-3 ’，擴增片段為 206 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，60℃ 45 s，40個循環(huán)。每份RNA樣本均進行3次重復(fù)檢測，取其平均Ct值用于結(jié)果分析，采用2-△△Ct方法對IL-1β、MCP-1 mRNA的表達水平進行相對定量。

1.3.2 免疫熒光技術(shù)檢測坐骨神經(jīng)CD68蛋白的表達

取神經(jīng)組織冰凍切片，用PBS水化20 min；10%羊血清40℃封閉 1 h；PBS 漂洗3次，每次5 min；加入一抗后，4℃孵育過夜；PBS 漂洗3次，每次5 min；加入二抗 Cy3山羊抗兔37℃孵育2 h；PBS 漂洗3次，每次5 min；熒光封片劑封片，熒光顯微鏡觀察及照片拍攝，每張切片隨機取5個非重疊視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析免疫陽性細胞面積占總面積比值。

1.3.3 大鼠坐骨神經(jīng)病理學(xué)觀察

以坐骨神經(jīng)縫合口為中心切取10 mm長的神經(jīng)組織，遠端緣用9/0無損傷縫線標(biāo)記方向，4%多聚甲醛中固定24 h，然后經(jīng)過乙醇梯度脫水、透明、進一步石蠟包埋等過程制成石蠟切塊，做縱行切片連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，然后作HE染色(蘇木素-伊紅染色)，在光鏡下觀察坐骨神經(jīng)的基本結(jié)構(gòu)及有無細胞增生、炎細胞浸潤等改變。

1.3.4 大鼠坐骨神經(jīng)油紅0染色

取0.5%油紅O/異丙醇儲存液與蒸餾水按 3∶2 比例混勻，靜置10 min后過濾獲得油紅O染液。 切片用甲醛-鈣固定10 min，蒸餾水沖洗后 60%異丙醇浸洗。 將組織切片置于預(yù)先配置好的油紅 O 染液中浸染10～15 min，60%異丙醇漂洗至背景無色后蒸餾水清洗。 在 Harris 蘇木精染液中復(fù)染30 s后，鹽酸、乙醇適度分色，室溫中放置稍干后甘油明膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 坐骨神經(jīng)髓鞘固蘭染色

以坐骨神經(jīng)縫合口為中心切取10 mm長的神經(jīng)組織，遠端緣用9/0無損傷縫線標(biāo)記方向，4%多聚甲醛中固定24 h，然后經(jīng)過乙醇梯度脫水、透明、進一步石蠟包埋等過程制成石蠟切塊，做縱行切片連續(xù)切片，切片厚度為4 μm，切片脫蠟后，然后作Luxol fast blue (LFB)染色。用LFB液在60℃溫度浸泡12 h；隨后應(yīng)用95%酒精浸洗5 min；加入0.05%碳酸鋰15 s；再應(yīng)用70%酒精洗滌，蒸餾水漂洗，進行脫水后，透明封片，在光鏡下觀察坐骨神經(jīng)的髓鞘改變,每張切片隨機取5個非重疊視野，利用Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析LFB染色陽性區(qū)域的積分光密度(IOD)平均值。

1.3.6 大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)測定

制作長約50 cm，寬約8.5 cm，高約8 cm的硬紙暗箱，兩端均留門，箱底墊上白紙，將大鼠雙后足蘸墨水后，在紙箱內(nèi)從一端到另一端行走，每條紙每側(cè)足留下4～5個足印，選實驗側(cè)及正常側(cè)足清晰的足印測量3個變量，精確到mm，算出每只鼠各變量的平均值。術(shù)后10、20、30、40和50 d檢測，測量足印長度(print length，PL)，第1足趾到第5足趾的距離(toe spread，TS)，第2足趾到第4足趾的距離(intermediary toe spread，IT)，E和N分別代表實驗側(cè)和正常側(cè)。將上述3個變量帶入Bain公式計算出SFI:SFI=-38.3(EPL-NPL)/NPL + 109.5 (ETS-NTS)/NTS + 13.3 (EIT-NIT)/NIT-8.8。正常SFI為0，神經(jīng)功能完全喪失為 -100。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

整個實驗過程中，各組大鼠無死亡。假手術(shù)組大鼠術(shù)后與術(shù)前步態(tài)無變化，無行動困難，模型組和LPS組均出現(xiàn)右下肢功能活動受限，足趾攣縮不能伸展，術(shù)側(cè)腿部肌肉萎縮，呈拖曳步態(tài)。術(shù)后10 d即可見，與模型組相比， LPS組大鼠術(shù)側(cè)肢體拖曳程度較輕，抬起幅度較高，足趾攣縮程度較輕，伸展幅度較大。術(shù)后30 d，模型組和LPS組大鼠存在不同程度右足踝部皮膚紅腫，足趾潰瘍，肌肉萎縮現(xiàn)象，針刺反應(yīng)消失，但LPS組大鼠肢體活動幅度明顯大于模型組。術(shù)后50 d，模型組和LPS組大鼠均紅腫消失，潰瘍?nèi)坑?，針刺反?yīng)靈敏，模型組仍有一只大鼠出現(xiàn)肌肉萎縮現(xiàn)象，LPS組大鼠無肌肉萎縮。2.2 實時定量PCR測坐骨神經(jīng)組織IL-1β和MCP-1mRNA的表達融解曲線分析顯示兩組基因擴增均呈單峰，退火溫度一致，無非特異性擴增。與假手術(shù)組相比，在術(shù)后1.5 h，模型組的IL-1β和MCP-1 mRNA表達水平均升高，差異有顯著性(P<0.001)。與模型組相比，LPS組的IL-1β和MCP-1 mRNA表達水平均升高，差異有顯著性(P<0.001)。而在術(shù)后24 h，模型組的IL-1β和MCP-1 mRNA表達水平均升高，差異有顯著性(P<0.001)。與模型組相比，LPS組的IL-1β和MCP-1 mRNA表達水平均升高，差異有顯著性(P<0.01)。結(jié)果見圖1。

注： **P < 0.01, ***P < 0.001差異有顯著性。圖1 大鼠坐骨神經(jīng)組織中IL-1β和MCP-1 mRNA的表達Note.**P < 0.01,***P < 0.001 vs. control group. There were significant differences.Fig.1 IL-1β and MCP-1 mRNA expression levels in sciatic nerve tissues of the rats

2.3 免疫熒光法測坐骨神經(jīng)組織CD68+巨噬細胞細胞的表達

術(shù)后7 d神經(jīng)組織切片免疫特異性巨噬細胞 CD68 抗體染色可見，假手術(shù)組無CD68+巨噬細胞浸潤，模型組神經(jīng)斷端有少量CD68+巨噬細胞浸潤，而與模型組相比，LPS組CD68+巨噬細胞明顯增多。通過定量，分析距離損傷中心2 mm內(nèi)遠端免疫陽性細胞面積所占比值顯示，LPS組CD68+巨噬細胞明顯增加，差異有顯著性(P<0.05)，見圖2。

注：與模型組相比，*P<0.05。a.假手術(shù)組； b.模型組；c.LPS組；d. CD68+巨噬細胞半定量分析。圖2 大鼠坐骨神經(jīng)組織中CD68+和iba1+細胞的表達 (10×20)Note. *P<0.05, vs model group. a. Sham group; b. Model group; c. LPS group; d. Semi-quantitative analysis of CD68+ macrophages.Fig.2 Expression of CD68+ and iba1+ cells in sciatic nerve tissue of the rats

2.4 大鼠坐骨神經(jīng)組織HE染色

術(shù)后7 d坐骨神經(jīng)HE染色，低倍鏡下可見假手術(shù)組大鼠坐骨神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)完整，纖維排列整齊，無炎性細胞浸潤，模型組和LPS組軸突完全斷裂，髓鞘崩解，與模型組相比，LPS組有較多炎性細胞浸潤斷端吻合口處形成小結(jié)節(jié)，如箭頭所示。高倍鏡下可見，模型組吻合口處炎性細胞浸潤，雪旺細胞增殖；LPS組可見吻合口周圍大量炎性細胞浸潤，雪旺細胞增生活躍。結(jié)果見圖3。

注：a.假手術(shù)組； b.模型組； c.LPS組。箭頭指向吻合口。圖3 大鼠坐骨神經(jīng)組織病理變化 (HE 染色， 40×10)Note. a. Sham group; b. Model group; c. LPS group. The arrow points to the anastomosis.Fig.3 Pathological changes in sciatic nerve tissues of the rats

2.5 大鼠坐骨神經(jīng)脂滴油紅O染色

術(shù)后7 d坐骨神經(jīng)油紅O染色可見，變性的髓鞘磷脂以及被巨噬細胞吞噬的髓鞘能被特異性染成橘紅色，細胞核呈藍色，背景為白色，反映神經(jīng)斷端脫髓鞘程度。模型組神經(jīng)斷端有少量髓磷脂堆積；而與模型組相比，LPS組大量脂滴堆積明顯增加，脫髓鞘程度明顯高于模型組，結(jié)果見圖4。

注：a. 模型組；b. LPS組。圖4 大鼠坐骨神經(jīng)脂滴油紅O染色(ORO 染色，40×10)Note. a. Model group; b. LPS group.Fig.4 Lipid droplet in the sciatic nerves of rats (Oil red O staining)

2.6 大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘固蘭染色

術(shù)后7 d坐骨神經(jīng)LFB染色可見，髓鞘被特異性染成天藍色，軸突不著色，背景為白色, 反映在坐骨神經(jīng)損傷遠端崩解的髓鞘碎片被巨噬細胞清除的情況。假手術(shù)組大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，顯示了正常的髓鞘形態(tài)；模型組和LPS組神經(jīng)斷端可見髓鞘淡染，顯示變性崩解的髓鞘，與模型組相比，LPS組殘余髓鞘碎片較少，通過定量分析，計算距離損傷中心2 mm內(nèi)遠端被染色髓鞘的積分光密度(IOD)平均值，可見與模型組相比，LPS組殘余髓鞘碎片較少，差異有顯著性(P<0.05),反映了LPS組的崩解髓鞘碎片清除速率明顯高于模型組。結(jié)果見圖5。

2.7 大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)測定

模型組和處理組大鼠在術(shù)后10、20、30、40和50 d，行足跡實驗分析坐骨神經(jīng)功能指數(shù)，評價大鼠運動功能的恢復(fù)情況。各組大鼠行走時步態(tài)穩(wěn)定，足跡清晰。結(jié)果顯示，兩組大鼠SFI均逐步上升，LPS組在損傷后20 d分別明顯高于模型組，差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)果見圖6。

3 討論

周圍神經(jīng)損傷后病理過程復(fù)雜，因此神經(jīng)損傷后的形態(tài)學(xué)變化和各種促進神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的方法成為一直是研究的熱點。周圍神經(jīng)損傷后，能夠通過神經(jīng)再生重新支配相應(yīng)的靶器官，而成功的神經(jīng)再生依賴巨噬細胞參與瓦勒變性。周圍神經(jīng)損傷后，崩解的髓鞘碎片上可能存在抑制軸突再生的因子，及時清除變性的髓鞘為軸突的再生提供更有利的環(huán)境，有利于神經(jīng)早期再生修復(fù)[5]。

注：與模型組相比，*P<0.05。a.假手術(shù)組； b.模型組； c.LPS組； d.髓鞘陽性染色半定量分析。圖5 大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘固蘭染色結(jié)果(LFB 染色，20×10)Note. *P<0.05, vs．model group. a. Sham group; b. Model group; c. LPS group; d. Semi-quantitative analysis of the myelin sheath.Fig.5 Histology of sciatic nerve myelin in the rats(LFB staining) LFB staining.

注：與模型組相比，*P<0.05。圖6 大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)檢測Note. *P<0.05, vs．model group. Fig.6 Sciatic function indexes (SFI) of the rats

我們利用Wistar大鼠建立坐骨神經(jīng)損傷模型，首先檢測斷端注射LPS后對大鼠坐骨神經(jīng)上相關(guān)炎性因子的表達影響。MCP-1是單核/巨噬細胞趨化因子,能導(dǎo)致單核/巨噬細胞在病變組織中大量浸潤，IL-1β是由活化的巨噬細胞分泌的細胞因子，同時IL-1β 能誘導(dǎo) MCP-1在損傷后第1天表達達到高峰，保證了單核/巨噬細胞的募集。Carroll等[6]研究發(fā)現(xiàn),周圍神經(jīng)損傷后1.5 h在損傷區(qū)域已經(jīng)有MCP-1mRNA表達,在神經(jīng)損傷后24 h達到高峰。因此本研究分別在術(shù)后1.5 h和24 h利用qRT-PCR檢測大鼠坐骨神經(jīng)組織上MCP-1和IL-1β的基因表達水平，研究結(jié)果與上述結(jié)果保持一致，在損傷后1.5 h的檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組已有IL-1β和MCP-1表達，與模型組相比，LPS組表達大幅提升。在損傷后24 h的檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組MCP-1和IL-1β增高，與模型組相比，LPS組表達明顯提升。說明LPS可有效增加MCP-1和IL-1β分泌。

其次我們檢測大鼠坐骨神經(jīng)斷端巨噬細胞募集和變性髓鞘碎片清除情況。本研究采用免疫熒光檢測巨噬細胞的募集，發(fā)現(xiàn)在術(shù)后7 d與模型組相比，LPS組神經(jīng)斷端巨噬細胞募集明顯增加，說明LPS能有效增加神經(jīng)斷端巨噬細胞募集。HE染色顯示，與模型組相比，術(shù)后7 d LPS組大鼠神經(jīng)斷端有大量炎性細胞募集，許旺細胞增殖明顯活躍。ORO染色顯示，在術(shù)后7 d LPS組神經(jīng)斷端脫髓鞘程度明顯高于模型組。同時術(shù)后7 d坐骨神經(jīng)LFB染色也表明，與模型組相比，LPS組神經(jīng)斷端殘余髓鞘碎片明顯減少。以上兩種染色結(jié)果均與巨噬細胞減少保持一致。說明LPS能有效募集巨噬細胞清理變性崩解的髓鞘碎片，從而縮短瓦勒變性時間。

最后，我們探究以上對瓦勒變性過程的干預(yù)是否影響后期大鼠運動功能的恢復(fù)。有一些研究指出，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)TLR2和TLR4信號的過度活化會導(dǎo)致組織損傷甚至行為障礙[7-12]。與此相反，有研究證明大鼠擠壓傷后，全身性注射LPS明顯減小脊髓空洞的大小[13]，Kigerl等[14]發(fā)現(xiàn)在脊髓挫傷小鼠模型中，TLR2和TLR4的基因敲除小鼠運動功能恢復(fù)能力減弱，提示在神經(jīng)損傷后，TLRs信號可能具有神經(jīng)保護的作用。SFI 反映下肢協(xié)調(diào)功能和肌力恢復(fù)情況，是從行為學(xué)的角度評價周圍神經(jīng)功能的可靠指標(biāo)。我們研究結(jié)果顯示，LPS組大鼠SFI同期均高于模型組，在術(shù)后20 d明顯高于模型組。說明縮短瓦勒變性時間可能有利于后期運動功能的恢復(fù)。但我們考慮到運動功能的恢復(fù)受多種因素作用，如LPS激活TLRs信號后是否增加了神經(jīng)元的存活等，這些都需要我們?nèi)蘸蟾由钊氲难芯俊?/p>

本研究通過在受損神經(jīng)斷端顯微注射LPS激活TLRs信號通路活化單核/巨噬細胞募集，來觀察對瓦勒變性中髓鞘碎片清除的影響。研究結(jié)果讓我們進一步明確了瓦勒變性中巨噬細胞的作用，從分子免疫學(xué)角度為周圍神經(jīng)損傷修復(fù)輔助治療提供一個新策略。

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Effect of lipopolysaccharide on Wallerian degeneration after peripheral nerve injury in rats

XIONG Le1，ZHANG Qian2，SHEN Ruo-wu1，BIAN Hong-lin1, SUN Guang-qiang1, WANG Yi1, ZHANG Feng-yu1, ZHANG Bei1*

(1.Medical College,Qingdao University,Qingdao 266071,China; 2.Qingdao Fu Wai Cardiovascular Hospital,Qingdao 266034)

Objective To investigate the effects of lipopolysaccharide (LPS) on myelin phagocytosis during Wallerian degeneration after early peripheral nerve injury in rats. Methods Fifty male Wistar rats were recruited and randomly divided into LPS group (n=20), model group (n=20) and sham group (n=10). The right sciatic nerves of rats in the LPS and model groups were cut and sutured end-to-end, while the sciatic nerve of sham group rats were only exposed. Immediately after surgery, the rats in LPS group were given microinjections of LPS (2 g/L) into the surgical site in a final volume of 1 μL, and the rats in other two groups were injected with the same volume of saline. The sciatic nerves were taken at 1.5 h, 24 h and 7d after surgery. Real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was applied to detect the dynamic expressions of IL-1β mRNA and MCP-1 mRNA. Immunofluorescence staining was used to test the expression of CD68+macrophages in sciatic nerves. HE staining was used to observe the pathological alterations of sciatic nerves tissue. ORO staining was used to observe sciatic nerves demyelination. LFB staining was used to detect the sciatic nerves myelin. Sciatic function index was used to evaluate the recovery of motor function in rats. Results Compared with the model group, qRT-PCR indicated that the expression of IL-1β and MCP-1 from LPS group were increased at 1.5 h and 24 h after surgery (P<0.001,P<0.001), respectively. Compared with the model group, the expression of CD68+cells was increased significantly at 7th day after surgery (P<0.05). Histological examination showed that compared with the model group, a lot of inflammatory cells and Schwann cells were found at sciatic nerve stump in the LPS group at 7th day after operation. ORO staining showed that the degree of demyelination in the LPS group was higher than that in the model group. LFB staining showed that the sciatic nerve stump demyelination appeared in both model group and the LPS group at 7th day after operation, but compared with the model group, myelin debris clearance in the LPS group was significantly accelerated (P<0.05). Finally, compared with the model group, the SFI in the LPS group was increased significantly at 20 d after surgery (P<0.05). Conclusions The results confirm that LPS is possible to manipulate the innate immune response to accelerate myelin clearance during Wallerian degeneration after early peripheral nerve injury in rats.

Peripheral nerve; Wallerian degeneration; Lipopolysaccharide; Myelin debris

ZHANG Bei, E-mail: zhangbei124@aliyun.com

山東省高等學(xué)?？萍加媱?編號J14LK10，J16LK04)。

熊樂(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：神經(jīng)免疫。E-mail： 369113603@qq.com

張蓓(1973-)，女，副教授，博士，研究生導(dǎo)師，研究方向：臨床免疫。E-mail: zhangbei124@aliyun.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0211-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.018

2016-06-08