巴馬小型豬85%肝切除術(shù)后急性肝功能衰竭模型的建立

桑劍鋒，馬虎成，施曉雷，黃韜，伊丹丹，丁義濤*

(1. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院肝膽外科，南京 210008；2. 南京醫(yī)科大學(xué)，南京 211166)

研究報告

巴馬小型豬85%肝切除術(shù)后急性肝功能衰竭模型的建立

桑劍鋒1，馬虎成1，施曉雷1，黃韜2，伊丹丹2，丁義濤1*

(1. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院肝膽外科，南京 210008；2. 南京醫(yī)科大學(xué)，南京 211166)

目的 探索不同比例肝切除體積對巴馬小型豬急性肝功能衰竭的影響，為建立合適的小型豬大部分肝切除后急性肝功能衰竭模型提供合適的方法。方法 分別行75%、85%及95%肝切除，CT檢查殘留肝并記錄存活情況，術(shù)前、術(shù)后 1、3、5 d和術(shù)后 1、2、3 周定期抽血檢測肝功能，獲取肝組織HE 染色，檢查肝病理情況。結(jié)果 75%、85%及 95%肝切除小型豬平均存活時間為(19.0±5.6)d，(17.3±5.5)d，(1.3±1.5)d，不同肝切除比例的巴馬小型豬病理學(xué)評分分別為(5.67±0.52)、(8.17±0.82)、(8.50±0.71)。隨著肝切除比例增加，肝功能衰竭發(fā)病率升高。85%肝切除可引起谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、總膽汁酸水平顯著增高。結(jié)論 85%體積肝切除可造成典型的小型豬急性肝功能衰竭模型。

急性肝功能衰竭；肝大部切除術(shù)；動物模型；巴馬小型豬

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)是一種以短期劇烈肝功能喪失以及大量肝細胞壞死為特點的臨床重癥，常常伴有肝性腦病且易引起多器官功能衰竭，即使采取重癥監(jiān)護，ALF的病死率仍然很高[1]。肝移植是目前治療ALF唯一有效的方式，但卻存在供體缺乏以及需要長期使用免疫抑制劑等問題。近年來，生物人工肝支持系統(tǒng)[2]和干細胞移植[3，4]等新方法被大量用于包括急性肝衰竭在內(nèi)的各種終末期肝病的基礎(chǔ)和臨床研究，取得了令人矚目的成果。但是，由于ALF病情復(fù)雜、影響因素多、缺乏對照等原因，對于生物人工肝或者干細胞移植治療ALF的確切療效往往難以判斷。因此，建立理想的ALF動物模型，是進行ALF研究的基礎(chǔ)。

目前建立ALF動物模型的方法主要包括外科手術(shù)、藥物和基因敲除。但是這些方法還存在著一些問題，例如，傳統(tǒng)的外科手術(shù)肝切除常出現(xiàn)動物術(shù)后出血死亡，肝切除量不精確；而結(jié)扎各肝葉Glisson系統(tǒng)的手術(shù)方法對實驗人員手術(shù)技能以及手術(shù)設(shè)備要求較高；藥物誘導(dǎo)是選擇合適的藥物，在保證有顯著的ALF表現(xiàn)及較高死亡率的同時，盡可能減少肝外器官的損害，并且有一定的存活時間及可接受的實驗費用。另外，目前ALF的動物模型多數(shù)為鼠、兔的模型，與臨床患者臨床表現(xiàn)、生理生化指標(biāo)和病理改變差異較大。與嚙齒類動物相比，小型豬的生理特征以及免疫系統(tǒng)與人類相似。本實驗通過比較不同比例肝切除體積對小型豬肝功能衰竭的影響，為建立合適的小型豬大部分肝切除后ALF模型提供合適的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級巴馬小型豬，24只，雌雄不限，體重15 kg左右，由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院實驗動物中心提供【SCXK(滬)2012-0013】。無菌手術(shù)在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動物實驗中心屏障動物設(shè)施進行【SYXK(蘇)2014-0052】。試驗全程所有的動物處理方法和實驗操作步驟均嚴(yán)格遵守《南京大學(xué)動物保護和使用規(guī)定》。

1.1.2 實驗材料

丙泊酚注射液(20 mL， 200 mg)，西安力邦制藥有限公司，批號：1209252；氟哌利多注射液(2 mL, 5 mg)，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號：AE130101；鹽酸利多卡因注射液(20 mL, 0.4 g)，上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號：1203E02；硫酸阿托品注射液(1 mL, 0.5 mg)，上海禾豐制藥有限公司，批號：121203；鹽酸氯胺酮注射液(2 mL, 0.1 g)，上海朝暉藥業(yè)有限公司，批號：120405。地西泮注射液(2 mL, 10 mg)，天津金耀氨基酸有限公司，批號：1301041。

1.2 方法

1.2.1 豬大部分肝切除模型的建立

所有動物在25℃環(huán)境下適應(yīng)3 d后建模。巴馬小型豬麻醉采用氯胺酮(2支)、氟哌利多(2支)、阿托品(1支)頸部肌肉注射。手術(shù)過程中以丙泊酚(1支)、氯胺酮(2支)、地西泮(3支)、5 mL鹽酸利多卡因溶于5%葡萄糖溶液靜脈滴注維持。實驗豬仰臥位，四肢固定于手術(shù)臺上。安爾碘消毒術(shù)區(qū)皮膚。腹部正中切口，自劍突切開皮膚、白線及腹膜后入腹，切開長約10 cm。用手術(shù)紗布將腸管隔離，即可顯露肝。術(shù)中觀察豬肝分為左外側(cè)葉、中葉、右外側(cè)葉和尾狀葉，中葉又分為左中葉和右中葉，尾狀葉與右外側(cè)葉相連，但有一不甚明顯的小葉間裂從右外側(cè)葉分裂出尾狀葉。參照Higgins和Anderson方法[5]行豬肝切除術(shù)：(1)假手術(shù)組 (Sham)(n=6)：僅作開腹處理；(2)75%肝切除組 (75% hepatectomy)(n=6)：順序切除實驗豬肝左外側(cè)葉、左中葉及右中葉的遠端2/3；(3)85%肝切除組 (85% hepatectomy)(n=6)：順序切除實驗豬肝左外側(cè)葉及中葉；(4)95%肝切除組 (95%, hepatectomy)(n=6)：順序切除實驗豬肝左外側(cè)葉、中葉及右外側(cè)葉，僅留尾狀葉。結(jié)扎下腔靜脈，按上述肝切除方法行不同比例的肝切除術(shù)。術(shù)后室溫下飼養(yǎng)，予以自由進食和飲水。觀察并記錄存活情況。

1.2.2 術(shù)后觀察指標(biāo)

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，組間比較應(yīng)用獨立樣本t檢驗，生存期比較采用Kaplan-Meir曲線，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后一般情況及生存時間

75%肝切除實驗豬術(shù)后蘇醒快，無肝功能衰竭表現(xiàn)，進食和活動與正常豬沒有區(qū)別。85%肝切除實驗豬均出現(xiàn)肝功能衰竭的征象，表現(xiàn)為術(shù)后蘇醒時間延長，精神萎靡，嗜睡，不喜動，對刺激反應(yīng)弱，眼睛出現(xiàn)血性分泌物，大量腹水，尿色深黃。死亡實驗豬尸檢可見肝右外側(cè)葉腫脹，腹腔有中等量腹水。95%肝切除實驗豬術(shù)后即陷入肝昏迷狀態(tài)，對刺激反應(yīng)較弱，很快于1～3 d內(nèi)死亡，尸檢見尾狀葉腫脹，腹腔少量積液。在實驗豬死亡后尸體解剖時均未發(fā)現(xiàn)腹腔大出血或血管栓塞等并發(fā)癥，證明實驗豬死于肝功能衰竭。

所有存活的實驗豬術(shù)后25 d處死，共2只，均為75%肝切除組。各組的生存時間分別為：75%肝切除組，(21.4±2.9)d；85%肝切除組，(17.3±3.6) d；95%肝切除組，(1.3±1.0) d，與前兩組差異均具有顯著性(P< 0.01)(圖1)。

2.2 實驗豬術(shù)前、術(shù)后影像學(xué)觀察及切除比例測定

各組動物在手術(shù)切除前、手術(shù)切除后均行肝CT掃描以測定肝體積。各組動物肝CT掃描及重建結(jié)果見圖2。經(jīng)體積測定證實，各組手術(shù)切除范圍分別為70%～80%、80%～90%和93%～97%，符合切除要求。

2.3 實驗室檢驗

各組試驗豬在術(shù)前、手術(shù)后第1天(D1)、手術(shù)后第3天(D3)、手術(shù)后第5天(D5)、手術(shù)后1周(W1)、手術(shù)后2周(W2)、手術(shù)后3周(W3)抽血靜脈血行肝功能(ALT、AST、TBil、DBil、TBA、γ-GT、ALP、LDH、ALB)、血清氨及凝血功能(PT)檢測。各項檢查結(jié)果見圖3。

與假手術(shù)組比較，75%切除術(shù)后1 d(P<0.05)、85%切除術(shù)后1 d(P<0.01)及3 d(P<0.05)谷丙轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)明顯提高，差異具有顯著性；75%切除術(shù)后1 d(P<0.05)、85%切除術(shù)后1 d(P<0.01)、95%切除術(shù)后1 d(P<0.01)谷草轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)顯著性提高，差異有顯著性，并持續(xù)保持高水平狀態(tài)。堿性磷酸酶活性85%切除術(shù)后保持持續(xù)性升高，差異有顯著性(P<0.01)；乳酸脫氫酶活性85%及95%切除術(shù)后1 d活性明顯增高，差異有顯著性(P<0.05)；γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶各組活性明顯增高(P<0.05或P<0.01)；總膽汁酸85%切除術(shù)后3、5 d明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)；直接膽紅素85%切除術(shù)后3、5 d及1周明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。凝血酶原時間未見統(tǒng)計學(xué)差異。肝切除各組之間差異無顯著性(P>0.05)。

2.4 組織學(xué)改變

所有存活的實驗豬在術(shù)后3 d在超聲引導(dǎo)下行肝穿刺取少量肝組織，術(shù)后3 d內(nèi)死亡的實驗豬行尸體取肝，行HE染色，病理圖片見圖4。肝切除各組HE染色切片顯示肝竇明顯擴張、空泡樣變最早出現(xiàn)在匯管區(qū)周圍肝細胞、可出現(xiàn)點狀壞死和片狀壞死。假手術(shù)組實驗豬肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞繞中央靜脈放射狀排列，肝小葉間由纖細的結(jié)締組織分割。匯管區(qū)由小葉間動脈、小葉間靜脈和小葉間膽管組成，膽管上皮細胞無變性、壞死，無增生(圖4A-a)。75%肝切除組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇重度擴張、充血，出血(圖4A-b)。85%肝切除組出血區(qū)肝細胞壞死、消失，肝小葉邊緣殘存少量肝細胞。肝組織壞死，僅見肝小葉結(jié)構(gòu)輪廓(圖4A-c)。95%肝切除切片中肝小葉輪廓可見，但細胞全部壞死, 匯管區(qū)纖維組織部分壞死，內(nèi)有炎細胞浸潤，部分炎細胞處于壞死狀態(tài)(細胞核固縮或碎裂)(圖4A-d)。

圖1 各組巴馬小型豬生存百分率Fig.1 Survival rates of the Bama miniature pigs with post-hepatectomy acute hepatic failure

圖2 不同體積肝切除肝CT掃描及重建結(jié)果Fig.2 CT scan and CT reconstruction of the Bama miniature pigs with post-hepatectomy acute hepatic failure

病理學(xué)評分結(jié)果如圖4B，假手術(shù)組、75%肝切除組、85%肝切除組及95%肝切除組的病理學(xué)評分分別是(0.33±0.26)、(5.67±0.52)、(8.17±0.82)、(8.50±0.71)。各肝切除組與假手術(shù)組比較，差異有顯著性(P<0.01)；75%肝切除組病理學(xué)評分明顯低于85%及95%肝切除組，差異有顯著性(P<0.05)； 85%肝切除組和95%肝切除組的評分接近，差異無顯著性(P>0.05)。

3 討論

理想的ALF模型應(yīng)具有6個特征[6]：包括治療后疾病肝衰竭可逆、可重復(fù)性、死于肝衰竭本身、合適的治療窗、足夠的動物大小及對實驗人員危害小。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的動物模型主要有兩大類：即藥物肝損傷和外科手術(shù)模型[7]。但是目前這些方法都各有其局限性。

采用藥物誘導(dǎo)的方法中，D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的大鼠ALF模型目前被實驗人員廣泛使用，但是該藥穩(wěn)定性一般，個體差異較大；同時較高的價格限制了其在大動物的應(yīng)用[8]。抗Fas抗體Jo2也常被用作誘導(dǎo)ALF模型，但是須每周反復(fù)使用，劑量較難掌握，重復(fù)性較差[9]。四氯化碳是較早用于建立ALF動物模型的物質(zhì)，使用方法較為簡便，但主要的問題是肝外毒性作用較大，模型動物常出現(xiàn)高鐵血紅蛋白血癥和急性呼吸窘迫綜合征，往往導(dǎo)致動物死亡[10]，另外，四氯化碳在被用作誘導(dǎo)ALF時存在可重復(fù)性低和物種間個體差異較大等缺陷[11]。

外科手術(shù)模型就是采用手術(shù)切除模型動物大部分的肝組織，讓其肝功能短時間內(nèi)失代償，從而出現(xiàn)ALF癥狀?，F(xiàn)有文獻報道的肝大部分切除建立ALF模型的切除體積從70%～95%不等，越大的體積伴隨著更高的死亡率。如Emond等[12]發(fā)現(xiàn)在70%肝大部切除術(shù)后，幾乎100%的大鼠能夠存活。而Panis等[13]發(fā)現(xiàn)在75%，85%和90%的肝切除后，術(shù)后4 d時存活率分別為100%，18%和0%，結(jié)果與我們的研究類似。另外，Madrahinov[14]報道了在肝切除90%和95%之后，大鼠1周時的存活率分別為100%和66%。

以上的實驗大都集中在鼠類，而在巴馬小型豬中，切除多少體積的肝誘導(dǎo)ALF目前并無統(tǒng)一認識。另外，傳統(tǒng)的Higgins和Anderson介紹的直接套扎肝蒂并切除相應(yīng)肝葉的方法雖然簡單，但由于在做套扎時，為防止腔靜脈狹窄，往往要遠離肝蒂結(jié)扎，這樣切除的肝量不精確。為了避免切除肝體積的誤差而引起的實驗偏倚，本研究采用術(shù)后CT重建計算殘留肝體積的方法，保證每組小型豬手術(shù)后殘余的肝體積符合實驗要求的體積量。如果某一只小型豬的殘留肝體積不符合其所在組的分組標(biāo)準(zhǔn)范圍，可以選擇放棄該次建?；蛘吒鶕?jù)殘留肝體積，將其分到另一符合標(biāo)準(zhǔn)范圍的組，確保了實驗的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

注：* P<0.05 vs 假手術(shù)組，** P<0.01 vs 假手術(shù)組。圖3 各組小型豬血清生化、凝血和氨的表達水平Note. * P<0.05, ** P<0.01 vs sham-operated group.Fig.3 Serum biochemical, coagulation and ammonia parameters of the Bama miniature pigs with post-hepatectomy acute hepatic failure

注：A：各組HE染色。a：假手術(shù)組(術(shù)后3 d)，組織結(jié)構(gòu)正常。b：75%肝切除組(術(shù)后3 d)，藍星示一個肝小葉，基本正常。黑箭示小葉間纖細的纖維組織。c：85%肝切除組(術(shù)后3 d)，黑星示肝小葉，肝細胞全部壞死，黑箭示匯管區(qū)，其內(nèi)有變性、壞死的炎細胞浸潤。d：95%肝切除組(術(shù)后1 d死亡時)，黑星示膽汁湖，局部肝細胞壞死。藍星是肝小葉中央部肝細胞索變窄、肝竇擴張。B：各組病理學(xué)評分結(jié)果。** P <0.01 vs假手術(shù)組；# P <0.05 vs 95%肝切除組及85%肝切除組。圖4 各組肝組織HE染色和病理學(xué)評分Note. A: The liver tissues. a: A sham-operated pig, 3 days post hepatectomy. b: A pig at 3 days after 75% hepatectomy. The blue star indicates a small lobule, the black arrow indicates lobular fibrous tissue. c: A pig at 3 days after 85% hepatectomy. The black star shows a hepatic lobule filled with necrotic cells, the black arrow indicates portal area, where degenerative and necrotic inflammatory cells were observed. d: A pig died at one day after 95% hepatectomy. The black star indicates a bile lake containing necrotic hepatocytes. The blue star shows that hepatic cords in the hepatic lobule became narrow and hepatic sinus expanded. B: Pathological scores of liver tissues. **P<0.01, vs. the sham-operated group, #P<0.05, vs. 95% hepatorectomy group and 85% hepatorectomy group. Fig.4 Pathological scores of the Bama miniature pigs with post-hepatectomy acute hepatic failure(HE staining)

本研究結(jié)果表明，75%肝切除可以引起肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝竇重度擴張、充血、出血，肝功能指標(biāo)也出現(xiàn)異常，但肝功能衰竭的表現(xiàn)并不明顯，由于實驗豬具有較強的肝功能修復(fù)能力，動物總體生存時間也相對較長，不利于生存期的考察。而85%肝切除模型屬于急性肝功能衰竭，手術(shù)實驗豬均出現(xiàn)肝功能衰竭的征象，表現(xiàn)為術(shù)后蘇醒時間延長、精神萎靡、嗜睡、對刺激反應(yīng)弱和尿少色深黃等癥狀。尸體剖檢未發(fā)現(xiàn)腹腔出血和血管血栓形成，但存在尾狀葉腫脹和腹腔少量積液，證明實驗豬死于門靜脈高壓引起的肝功能衰竭。死亡實驗豬尸檢可見肝右外側(cè)葉腫脹、顏色變淺，腹腔有中等量腹水，這些均是出現(xiàn)門靜脈高壓的表現(xiàn)。存活實驗豬的肝功能在術(shù)后第4天開始逐漸得到改善。隨著肝切除量增加，實驗豬生存率明顯降低。95%肝切除組實驗豬，死亡時間集中于術(shù)后l～3 d內(nèi)。肝最大切除量是多少，在理論上還不明確。實驗豬經(jīng)歷了85%肝切除后仍可存活的現(xiàn)象提示，并非是剩余的肝細胞數(shù)量不足引發(fā)的肝功能衰竭，而是由大部分肝切除后發(fā)生的病理生理變化導(dǎo)致肝有效肝細胞數(shù)量減少。

目前的研究表明有多種機制參與肝切除術(shù)后肝功能衰竭的發(fā)生。包括過度的炎性反應(yīng)[13]、菌群易位[15]和Kupffer細胞激活[16]等。另外，急性門靜脈高壓可能也是術(shù)后肝功能衰竭的主要機制之一。大量肝實質(zhì)細胞被切除后，門靜脈血流動力學(xué)的異常變化現(xiàn)已成為研究者關(guān)注的焦點，而由此引發(fā)的的小肝綜合征，使人們對門靜脈高壓所引起的肝損傷越來越重視[17-19]。因此，本實驗所建立的大部分肝切除模型除了能夠為ALF的基礎(chǔ)研究提供大動物模型外，還完美地模擬了小肝綜合征，為研究臨床上大部分肝切除術(shù)導(dǎo)致的小肝綜合征提供了可以借鑒的動物模型。

綜合而言，85%肝切除模型出現(xiàn)的肝衰竭征象較75%肝切除更加典型，血清生化學(xué)指標(biāo)及病理組織學(xué)檢查均出現(xiàn)肝衰竭的明顯特征性改變，符合臨床肝衰竭的特征，95%肝切除由于手術(shù)操作的難度及較短的動物生存期，不具有實際應(yīng)用價值。由于實驗豬具有較強的肝功能修復(fù)能力，75%肝切除動物總體肝衰竭癥狀不典型，生存時間也相對較長，不利于生存期的考察。85%肝切除動物生存期介于75%肝切除和95%肝切除之間，亦比較適合考察不同治療方案對動物生存期的影響。本研究顯示85%肝切除模型可作為巴馬小型豬肝功能衰竭模型建立的標(biāo)準(zhǔn)，正是這種模型具有的肝功能衰竭的高發(fā)病率、高死亡率以及一定的自愈率，使其成為合適的外科ALF模型，對建立巴馬小型豬肝切除后ALF模型標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一具有重要意義。

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Establishment of a porcine model of acute liver failure after 85% hepatectomy

SANG Jian-feng1, MA Hu-cheng1, SHI Xiao-lei1, HUANG Tao2, YI Dan-dan2, DING Yi-tao1*

(1. Department of Hepatobiliary Surgery, Drum Tower Hospital Affiliated to Nanjing University Medical School, Nanjing 210008, China; 2. Nanjing Medical University, Nanjing 211166)

Objective To establish a porcine model of liver failure after different percent hepatectomy. Methods The porcine models of liver failure 75%, 85%, 95% hepatectomy were developed and the living conditions and survival time were recorded. The blood samples of pre-surgery, post-hepatectomy d1, d3, d5 and post-hepatectomy 1 week, 2 weeks, and 3 weeks were collected for hepatic function analysis. Histological examination of liver tissues was performed using HE staining. Liver injury histology was interpreted and scored in the terminal samples. Results The average survival time of pigs with post-hepatectomy liver failure after 75%, 85%, 95% hepatectomy was 19.0±5.6 days, 17.3±5.5 days, 1.3±1.5 days, respectively. Their pathological scores were 5.67±0.52, 8.17±0.82 and 8.50±0.71, respectively. With the increase of percent hepatic resection, the incidence of hepatic failure was increasing. ALT, AST, ALP, LDH and TBA were dramatically increased in the pigs after 85% hepatectomy. Conclusions The pig model of acute liver failure by 85% hepatectomy is successfully established, which can cause typical acute liver failure in Bama miniature pigs.

Acute liver failure; Hepatectomy; Animal model; Bama miniature pigs.

DING Yi-tao, E-mail: kwh2003@263.net

國家自然科學(xué)基金(編號：81500478)。

桑劍鋒(1971-)，男，博士，副主任醫(yī)師，專業(yè)：普通外科。E-mail： drsangjianfeng@163.com

丁義濤 (1950-)，男，教授，博士生導(dǎo)師， 研究方向：肝臟外科。E-mail: yitao_ding@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0174-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.011

2016-08-21